Spelling suggestions: "subject:"dyndrome dde usher"" "subject:"dyndrome dde asher""
1 |
Deciphering molecular mechanisms of unusual variants in Usher Syndrome / Identification et caractérisation de variants atypiques dans le Syndrome de UsherLiquori, Alessandro 21 December 2015 (has links)
Le syndrome de Usher (USH) est une maladie transmise selon le mode autosomique récessif caractérisée par l’association d’une surdité congénitale (HL) et d’une rétinite pigmentaire (RP), et dans certains cas, d’une aréflexie vestibulaire. Une hétérogénéité clinique et génétique est reconnue. Environ 10 % des cas USH restent non résolus après analyse moléculaire exhaustive des différents gènes. Ces cas incluent les patients qui ne portent aucune mutation dans un des gènes USH connus ainsi que les patients porteurs d’une seule mutation dans un gène USH. Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressés à l’étude des patients porteurs d’une seule mutation dans les gènes USH2A et PCDH15.Dans la première partie de la thèse, nous avons analysé une cohorte de patients avec un phénotype USH2A bien défini : 5 patients pour lesquels une seule mutation à l’état hétérozygote avait été identifiée dans le gène USH2A et un patient porteur d’un variant silencieux en trans d’une mutation non-sens.Pour les 5 patients, nous avons émis l’hypothèse que la seconde mutation, restant à être identifiée, pourrait se trouver dans des régions introniques profondes. Pour cela, nous avons développé une approche de séquençage à haut débit (NGS) de l’ADN pour identifier les variants introniques profonds dans le gène USH2A et évaluer leurs conséquences sur l’épissage. Comme preuve de concept et pour valider l’approche, y compris le pipeline bio-informatique et l’évaluation des outils de prédiction de l’épissage, nous avons analysé un patient porteur d’un pseudoexon (PE) connu dans le gène USH2A. Ensuite, les 5 patients ont été étudiés en utilisant le pipeline défini, ce qui a conduit à l’identification de 3 nouveaux variants introniques profonds chez 4 d’entre eux. Tous les variants ont été prédits comme pouvant avoir un impact sur l’épissage et aboutir à l’insertion de PE. Ces prédictions ont été validées par les essais minigènes. Grâce à cette étude, nous présentons une stratégie innovante pour identifier les mutations introniques profondes, lorsque l’analyse des transcrits n’est pas possible. Par ailleurs, le pipeline bio-informatique développé fonctionne indépendamment de la taille du gène analysé, ce qui permet l’application possible de cette approche à n’importe quel gène. Par ailleurs, un oligonucléotide antisens de type morpholino (AMO) a été évalué in vitro afin de rétablir l’altération d’épissage induite par une des mutations identifiées. Les résultats ont montré un taux d’exclusion élevé du transcrit aberrant et suggèrent une application possible en thérapie moléculaire. Nous avons ensuite effectué des études sur le variant USH2A c.1377T>A, un variant silencieux afin d’évaluer son effet sur l’épissage. L’analyse de l’ARN issu de cellules nasales du patient a montré que ce variant conduit au saut de l’exon 8 dans les transcrits USH2A. Ceci a été confirmé par un essai minigène. En outre, des études préliminaires ont été réalisées en utilisant des outils de prédictions et des essais minigènes pour évaluer l’implication des éléments cis-régulateurs dans le défaut d’épissage observé chez le patient. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons analysé une patiente USH1, pour laquelle une seule mutation avait été identifiée dans le gène PCDH15. Dans ce cas, nous avons combiné la culture des cellules épithéliales nasales avec l’analyse des transcrits PCDH15. Celle-ci a été réalisée par séquençage de cinq RT-PCR chevauchantes. Grâce à cette analyse, nous avons réussi à délimiter une région d’intérêt dans le transcrit, dont l’amplification a échoué exclusivement pour l’allèle porteur de la mutation non identifiée. D’autres analyses ont été effectuées dans la région génomique correspondante par capture ciblée couplée au séquençage NGS et LongRange PCR suivi de séquençage Sanger. Cependant, aucun variant candidat n’a été identifié à ce jour. Nous suggérons l’implication de mécanismes moléculaires complexes qui restent à être caractérisés. / Usher syndrome (USH) is an autosomal recessive disorder characterized by the association of sensorineural hearing loss (HL) and retinitis pigmentosa (RP), and in some cases, vestibular areflexia. Clinical and genetic heterogeneity are recognised. Indeed, three clinical types can be caused by mutations in one of the 10 known genes and USH2A represents the most frequently involved gene.Approximately 10 % of the USH cases remain genetically unsolved after extensive molecular analysis of the different genes, which includes sequencing of the exons and their intronic boundaries, combined to large rearrangements screening by array CGH. These unsolved cases include patients who do not carry any mutation in any of the known USH genes and patients who carry a single USH mutation. During this thesis we focalised on the study of patients carrying a single mutation in USH2A and PCDH15 gene.First, we have analysed a cohort of well-defined USH2A patients: five patients, for whom a single USH2A heterozygous mutation had been identified and one patient carrying a silent variant in trans to a nonsense mutation. For the 5 patients, we supposed that the second mutation remaining to be found could be localised deep in the introns. Indeed, a deep intronic mutation resulting in the inclusion of a pseudoexon (PE 40) in USH2A transcripts had been identified, following RNA analysis from nasal cells. Unfortunately, analysing USH2A transcripts still represent a challenging approach in a diagnostic settings and it is not always possible. To circumvent this issue, we have developed a DNA-Next Generation Sequencing (NGS) approach to identify deep intronic variants in USH2A and evaluate their consequences on splicing. As a proof of concept and to validate this approach, including the bioinformatics pipeline and the assessment of splicing predictor tools, the patient carrying the PE 40 was analysed at first. Then, the 5 patients were studied using the defined pipeline, which led to the identification of 3 distinct novel deep intronic variants in 4 of them. All were predicted to affect splicing and resulted in the insertion of PEs, as shown by minigene assays. Through this study, we present a new and attractive strategy to identify deep intronic mutations, when RNA analyses are not possible. In addition, the bioinformatics pipeline developed is independent of the gene size, implying the possible application of this approach to any disease-linked gene. Moreover, an antisense morpholino oligonucleotide (AMO) tested in vitro for its ability to restore the splicing alterations caused by one of the identified mutation provided high inhibition rates. These results are indicative of a potential application for molecular therapy.In the second case, we have performed studies on the USH2A c.1377T>A silent variant to investigate its effect on splicing. Analysis of RNA from nasal cells of patients showed that this variant led to the skipping of exon 8 in USH2A transcripts. This was confirmed by minigene assay. Moreover, preliminary studies have been performed using prediction tools and minigene assays to assess the involvement of cis-acting elements in causing the aberrant splicing.In the second part of the thesis, we have analysed an USH1 patient, for whom only one mutation had been identified in the PCDH15 gene. In this case, we combined nasal epithelial cells culture with the analysis of the PCDH15 transcripts. This was performed by sequencing five overlapping RT-PCRs. Through this analysis, we were able to delimit a region within the transcript, which failed to be amplified exclusively in the allele carrying the unidentified mutation. Further analyses have been performed in the corresponding genomic region by NGS-target capture and LongRange PCR associated with Sanger sequencing. However, no evident mutation has been identified so far. Therefore, we suggest the involvement of complex molecular mechanisms that remain to be characterised.
|
2 |
Cellular and molecular mechanisms of Usher syndrome pathogenesis / Mécanismes cellulaires et moléculaires de la pathogénèse du syndrome de UsherCortese, Matteo 30 September 2016 (has links)
Le syndrome d’Usher (USH) cause une surdité-cécité chez l’homme. Au moins neuf gènes responsables ont été identifiés. L’origine de l’atteinte auditive a été dévoilée par l’analyse de souris mutantes, mais les causes de la cécité sont encore obscures. Néanmoins, unes des protéines de Usher, la myosine VIIa, a été impliquée dans le transport intracellulaire dans les photorécepteurs. Pour mieux comprendre le rôle dans la rétine, j’ai étudié l’un de ses partenaires, la spectrine βV. Nous avons conclu que cette spectrine, en collaboration avec les protéines USH1, est impliquée dans le trafic cellulaire: elle couple les moteurs (myosine VIIA, kinesine II et le complexe dynéine/dynactine) à leurs cargos en route vers le segment externe des photorécepteurs. La combinaison d’études comparatives dans les cellules ciliées (CC) de l'oreille interne de grenouille et de souris, de tests biochimiques et d’analyses phylogénétiques indique que le transport vers et depuis la surface apicale des cellules est la fonction ancestrale de cette spectrine. Chez les mammifères, une pression évolutive a engendré le recrutement de la spectrine βV à la paroi latérale des CC externes auditives, probablement pour participer à une nouvelle fonction: l’électromotilité. Enfin, j’ai étudié l’origine de la surdité dans le syndrome d’Usher III. Le seul gène causal connu est CLRN1, qui code pour la clarine-1. Nous avons conclu que la clarine-1 est nécessaire à la maturation et le maintien des touffes ciliaires des CC. De plus, la clarine-1 est essentielle pour le regroupement des canaux calciques voltage-dépendants au voisinage immédiat de la machinerie exocytotique de la synapse à ruban des CC internes. / Usher syndrome (USH) causes a combined deafness-blindness in humans. At least nine causative genes are known. While the analysis of USH knockout mice has shed light on the origin of the auditory deficit, the causes of vision loss are still unclear. Nevertheless, USH1B protein, myosin VIIa, appears to contribute to intracellular traffic in photoreceptor cells. To better understand the role of this myosin in the retina, I studied the functions of its interacting partner, spectrin βV. We found that spectrin V, along with USH1 proteins, participates in intracellular transport by coupling motor proteins (myosin VIIa, kinesin II, dynein/dynactin complex) to the cargoes en route towards the outer segment of photoreceptor cells. Evidence from comparative studies in frog and mouse inner ear, biochemical assays and phylogenetic analyses point to cargo trafficking to and from the apical cell region, as the likely ancestral function of this spectrin. Our analyses also suggest that evolutionary pressures in the mammalian lineage drove the recruitment of spectrin βV to the lateral wall of auditory outer hair cells, probably to support a new function: electromotility. Finally, I explored the origin of hearing loss in Usher syndrome of type III (USH3). So far, the only causal gene known is CLRN1, which codes for clarin-1. The comparative characterization of two Clrn1 mouse mutants revealed that clarin-1 is required for the maturation and maintenance of the hair bundle in the hair cells. Moreover, our results indicate that clarin-1 is also essential to cluster the voltage-gated Ca2+ channels in close proximity to the exocytotic machinery of the ribbon synapse of inner hair cells.
|
3 |
Syndrome de Usher : outils innovants pour une exploration moléculaire exhaustive / Usher syndrome : advanced tools for a comprehensive molecular explorationBesnard, Thomas 05 December 2012 (has links)
Le syndrome de Usher est une maladie génétique associant surdité congénitale et rétinopathie pigmentaire (RP), auxquelles peuvent s'ajouter des troubles vestibulaires. Les différences phénotypiques, distinguées en 3 types cliniques, s'accompagnent d'une hétérogénéité génétique impliquant au moins 10 gènes. Identifier et caractériser les causes moléculaires grâce aux outils d'analyses génétiques disponibles permet d'améliorer la compréhension des mécanismes physiopathologiques à l'origine des symptômes du syndrome de Usher. Dans ce cadre, nous nous sommes inscrits dans une recherche d'exhaustivité des études moléculaires. Dans un premier temps, nous avons ainsi mis en place l'analyse et défini le spectre mutationnel des gènes minoritairement impliqués dans le type II (GPR98 et DFNB31). Nous avons également développé différents outils, notamment pour l'analyse de variants altérant le mécanisme d'épissage ou touchant les régions promotrices des gènes USH2.Ces travaux permettent d'obtenir un taux de détection des altérations conduisant au syndrome de Usher type 2 de 90 %. Ce taux est maintenant similaire à celui observé pour le type 1, qui constituait jusqu'ici la référence.Nous avons, dans un second temps, développé le séquençage nouvelle génération (NGS) appliqué à l'exome Usher. L'objectif de cette analyse était de tester la faisabilité et l'efficacité de cette approche, en vue de son éventuelle utilisation en diagnostic moléculaire. La définition des critères de qualité et la mise en place de la priorisation des variants ont été réalisées sur un groupe contrôle. L'étude a ensuite été étendue sur une cohorte de patients. Les résultats obtenus montrent qu'une utilisation en diagnostic est possible mais restera dépendante de l'amélioration de la technique du séquençage, de son analyse et des outils bioinformatiques pour interpréter le volume de données ainsi généré. / Usher syndrome is a genetic disorder combining sensorineural hearing loss (HL) and retinitis pigmentosa (RP). Some patients will also exhibit vestibular areflexia (VA). Clinical and genetic heterogeneity is recognized as the 3 clinical subgroups, defined mainly on the degree of HL and VA, can be caused by mutations in one of the 10 known genes. It is important to use all accessible genetic tools to identify and characterize molecular origin in order to improve the knowledge of the physiopathological mechanisms causing Usher Syndrome.In this context, we have developed an exhaustive approach. In a first step, we have implemented the analysis and established the mutational spectrum of the 2 minor USH2 genes (GPR98 and DFNB31). In addition, we have developed several tools, in particular to study variants susceptible to alter splicing or lying in the promoter regions of the USH2 genes.Thanks to this work, the USH2 mutation detection rate has now been raised to 90%, similar to that of USH1.We have then designed a targeted exome of the Usher genes to be sequenced using the GS Junior system (Roche 454). The aim of the study was to test the feasibility of this new technics for a possible transfer to diagnostic facilities. Quality criteria and variant priorization were set up on a control cohort (previously studied in one of the USH gene). The study has then been extended on a patient cohort. Our results indicate that NGS Usher-exome can be used in molecular diagnostics but improvement of the reliability of the sequencing technology, bioinformatics tools and dedicated databases is essential.
|
4 |
The auditory mechano-electrical transduction machinery : components and interactions / La machinerie de la transduction mécano-électrique auditive : composants et interactionsPepermans, Elise 25 September 2014 (has links)
La (Pcdh15) est localisée dans les touffes ciliaires des cellules ciliées internes et externes de la cochlée. Elle forme des liens interstéréociliaires entre les différents stéréocils, des protrusions riches en actine qui forment ensemble la touffe ciliaire. L’absence de Pcdh15 entraîne la désorganisation des touffes ciliaires et la perte de la mécanotransduction auditive. Pcdh15 forme en effet la partie basse du lien de bout de cil (en anglais tip-link), le lien contrôlant l’ouverture du canal de transduction, qui se situe au point d’insertion inferieur de ce lien. Il existe trois isoformes de Pcdh15 (CD1, CD2 et CD3). J’ai étudié la distribution de ces isoformes dans la touffe ciliaire à différents stades de sa maturation. Différents modèles murins « KO conditionnel » ont été générés, ils m’ont permis d’analyser les conséquences de l’absence de chacune des isoformes individuellement, ainsi que celles de l’absence de Pcdh15-CD2 et Pcdh15-CD3, et celles de l’absence simultanée des trois isoformes. J’ai ainsi pu conclure que Pcdh15-CD2 est la seule isoforme essentielle pour la formation des tip-links dans les cellules ciliées matures. Dans les touffes ciliaires matures, Pcdh15 joue également un rôle dans l’interaction entre les touffes ciliaires et la membrane tectoriale, dans le contrôle de la taille des stéréocils, et dans la formation des liens interstéréociliaires apicaux. Pour ces fonctions, mais pas pour la formation du tip-link, Pcdh15-CD1 et Pcdh15-CD2 (les isoformes présentes dans la touffe ciliaire mature) sont redondantes. Cependant, Pcdh15-CD1 ne peut compenser que partiellement l’absence de Pcdh15-CD2 et Pcdh15-CD3. Pour étudier comment Pcdh15 interagit avec les autres protéines impliquées dans le syndrome de Usher, les interactions avec l’harmonine et la whirline (deux protéines d’échafaudage qui sont colocalisées avec Pcdh15 à l’apex des stéréocils) ont été analysées in vitro. / Protocadherin-15 (Pcdh15 is located in the stereociliary hair bundles of inner and outer hair cells (IHCs and OHCs) of the cochlea, where it forms fibrous links between different stereocilia. Absence of Pcdh15 leads to deafness due to the disorganization of hair bundles and absence of mechano-electrical transduction. The latter is explained as Pcdh15 forms the lower component of the tip-link, that gate hair cell mechano-electrical transduction channels. There are three different splice isoforms of Pcdh15 (CD1, CD2 and CD3), I studied their distribution in the developing and mature auditory hair cells. Different conditional Pcdh15 knockout mouse models were generated, permitting analysis of the absence of each of the different Pcdh15 isoforms individually, of the combined absence of Pcdh15-CD2 and Pcdh15-CD3, and of the absence of all isoforms. I was able to conclude that Pcdh15-CD2 is essential for the formation of tip-links in mature hair cells. In mature hair bundles Pcdh15 also plays a role in the coupling of the hair bundles to the tectorial membrane, in the control of the size of the stereocilia, and in the formation of apical links between stereocilia. The different Pcdh15 isoforms present in mature hair bundles (Pcdh15-CD1 and Pcdh15-CD2) are functionally redundant for these functions, but not for tip-link formation. In immature hair bundles, the different Pcdh15 isoforms are functionally redundant, although Pcdh15-CD1 can only partially compensate the absence of Pcdh15-CD2 and Pcdh15-CD3. To discover how Pcdh15 interacts with other proteins implicated in Usher syndrome, interactions with harmonin and whirlin were analyzed by biophysical techniques.
|
Page generated in 0.0414 seconds