Le diabète et l’obésité ont atteint de telles proportions dans le monde qu’on parle de pandémie. Les enjeux médicaux et financiers font de ces deux maladies un problème majeur de santé publique. Deux groupes de facteurs contribuent à ces deux maladies : l’environnement, et la génétique sur laquelle cette thèse s’appuie. Ce travail s’est focalisé sur les formes rares et monogéniques qui constituent les formes extrêmes de diabète de type 2 et d’obésité.Ces formes sont loin d’être totalement élucidées. Mon projet s’est concentré sur l’utilisation du séquençage de nouvelle génération (NGS) pour identifier de manière plus optimale, par rapport au séquençage classique de type Sanger, des mutations dans des gènes déjà connus chez de nouveaux patients introduits dans notre cohorte dans une optique de diagnostic. Le deuxième objectif était d’utiliser les techniques de NGS pour découvrir de nouveaux loci, liés à de nouvelles voies de signalisation impliquées dans la physiopathologie du diabète et de l’obésité.La première approche utilise une technique d’enrichissement par hybridation en phase liquide et se focalise sur 34 gènes associés à des formes monogéniques et polygéniques d’obésité. Le criblage a été réalisé sur 201 individus dans 13 familles dont la cause d’obésité est inconnue. Cette approche a mené à l’identification d’une mutation dans un gène connu de l’obésité : PCSK1. Cette mutation est causale, car elle conduit à un codon-stop au début de la protéine et n’est présente que chez des individus obèses. De plus, l’étude fonctionnelle a démontré une inhibition partielle de PC1/3 par la protéine tronquée et un possible impact sur la maturation et la sécrétion de l’enzyme.La deuxième approche se base sur une technique d’amplification par PCR dans des microgouttelettes lipidiques développée par la société Raindance, dont le premier test vise à réidentifier les mutations causales du diabète et/ou de l’obésité chez 40 patients. Cette approche a donné des résultats satisfaisants, car pour une large majorité de patients, les mutations causales ont pu être à nouveau identifiées. Seul un patient n’a pu être reconfirmé à cause des outils bioinformatiques actuels qui restent limités dans la détection des indels complexes. Parmi les 39 patients identifiés, 3 d’entre eux sont potentiellement porteurs de plusieurs mutations causales. Cette technique pourrait être envisagée dans le domaine clinique, car elle permet une approche multigénique en fournissant un diagnostic rapide, moins couteux et qualitativement aussi bon que le séquençage Sanger.La troisième approche met en jeu le séquençage de l’exome entier (WES) chez 4 individus où la famille entière s’est précédemment révélée négative pour tous les gènes connus du diabète. Cette approche a permis la découverte d’un 13e gène du MODY, KCNJ11, et confirme le large spectre phénotypique qui va du diabète néonatal au MODY selon les mutations. La difficulté majeure de cette technique est le filtrage des variants en vue d’aboutir à une seule mutation causale (ou éventuellement plusieurs sur un même gène) pour identifier de nouveaux gènes du MODY. La stratégie utilisée combinait à la fois un filtrage bioinformatique, avec par exemple des filtres sur la coségrégation familiale et sur des bases de SNPs référencés, et un filtrage biologique, avec l’utilisation d’une technique de génotypage haut débit. En conclusion, ce travail a permis de tirer parti des avancées technologiques comme la capture, le séquençage ciblé de masse et le NGS pour élucider et améliorer le criblage des formes monogéniques de diabète et d’obésité. Cette amélioration de la compréhension des mécanismes moléculaires conduira peut-être au développement de meilleurs traitements comme la médecine personnalisée. On espère voir des améliorations directes pour le patient dans un futur proche, par exemple un diagnostic moléculaire plus rapide, plus sûr et plus exhaustif. / Diabetes and obesity have reached such proportions worldwide we are talking about pandemic. Both diseases are a major cause of mortality and multiple complications. Medical and financial issues are for both diseases a major public health problem. Two groups of factors contribute to these two diseases: environment, and genetics on which this thesis is based. This work focused on rare and monogenic forms which are extreme forms of type 2 diabetes and obesity.These forms are far from being fully understood. My project focused on the use of next generation sequencing (NGS) to identify more optimally, compared to conventional Sanger sequencing, mutations in already known genes among new patients in our cohort for diagnostic purposes. The second objective was to use NGS to discover new loci associated with new signaling pathways involved in the pathophysiology of diabetes and obesity.The first approach uses a liquid-phase hybridization technique and focuses on 34 genes associated with monogenic and/or polygenic obesity. The screening was carried out on 201 people in 13 families for which the cause of obesity is unknown. This approach led to the identification of a mutation in a known gene of obesity: PCSK1. This mutation is causal because it leads to a stop codon at the beginning of the protein and is present only in obese individuals. Additionally, functional studies have demonstrated partial inhibition of PC1/3 by the truncated protein and the possible impact on the processing and secretion of this enzyme. This study has been published published in the "International Journal of Obesity" newspaper.The second approach is based on a PCR amplification technique in lipid microdroplets developed by Raindance. The first test is to re-identify the causal mutations of diabetes and/or obesity in 40 patients. This approach has yielded satisfactory results because for a large majority of patients, the causative mutations have been identified again. Only one patient was unable to be reconfirmed because current bioinformatics tools are limited in the detection of complex indels. Of the 39 patients identified, 3 of them are potential carriers of several causative mutations. This technique could be considered in the clinical field because it allows a multigene approach by providing a rapid diagnosis, cheaper and with a quality similar to the gold standard Sanger sequencing. For us, the purpose of this technique is a fast and optimal clinical diagnosis in order to identify unsolved cases, which are candidates for exome sequencing. This second study was published in "Diabetes Care" journal.The third approach involves whole exome sequencing (WES) in 4 individuals where the whole family was previously tested negative for all known genes of diabetes. This approach led to the discovery of a thirteen MODY gene, KCNJ11, and confirms the broad phenotypic spectrum that goes from neonatal diabetes to MODY depending on the mutations. The major difficulty with this technique is filtering variants in order to get a single causal mutation (or possibly several on the same gene) to identify new MODY genes. The strategy we used combined both a bioinformatics filter for example with filters on family cosegregation and on SNP databases and a biological filter, with the use of a technique for high-throughput genotyping. This pioneering study in the use of NGS to identify new genes of MODY has been published in "PLoS ONE".In conclusion, this work took advantage of technological advances such as capture, targeted sequencing and NGS to elucidate and to improve the screening of monogenic forms of diabetes and obesity. This improved understanding of the molecular mechanisms may lead to the development of better treatments like personalized medicine. We hope to see direct improvements for patients in the near future, such as a more accurate, faster and more comprehensive molecular

Le syndrome de Usher est une maladie génétique associant surdité congénitale et rétinopathie pigmentaire (RP), auxquelles peuvent s'ajouter des troubles vestibulaires. Les différences phénotypiques, distinguées en 3 types cliniques, s'accompagnent d'une hétérogénéité génétique impliquant au moins 10 gènes. Identifier et caractériser les causes moléculaires grâce aux outils d'analyses génétiques disponibles permet d'améliorer la compréhension des mécanismes physiopathologiques à l'origine des symptômes du syndrome de Usher. Dans ce cadre, nous nous sommes inscrits dans une recherche d'exhaustivité des études moléculaires. Dans un premier temps, nous avons ainsi mis en place l'analyse et défini le spectre mutationnel des gènes minoritairement impliqués dans le type II (GPR98 et DFNB31). Nous avons également développé différents outils, notamment pour l'analyse de variants altérant le mécanisme d'épissage ou touchant les régions promotrices des gènes USH2.Ces travaux permettent d'obtenir un taux de détection des altérations conduisant au syndrome de Usher type 2 de 90 %. Ce taux est maintenant similaire à celui observé pour le type 1, qui constituait jusqu'ici la référence.Nous avons, dans un second temps, développé le séquençage nouvelle génération (NGS) appliqué à l'exome Usher. L'objectif de cette analyse était de tester la faisabilité et l'efficacité de cette approche, en vue de son éventuelle utilisation en diagnostic moléculaire. La définition des critères de qualité et la mise en place de la priorisation des variants ont été réalisées sur un groupe contrôle. L'étude a ensuite été étendue sur une cohorte de patients. Les résultats obtenus montrent qu'une utilisation en diagnostic est possible mais restera dépendante de l'amélioration de la technique du séquençage, de son analyse et des outils bioinformatiques pour interpréter le volume de données ainsi généré. / Usher syndrome is a genetic disorder combining sensorineural hearing loss (HL) and retinitis pigmentosa (RP). Some patients will also exhibit vestibular areflexia (VA). Clinical and genetic heterogeneity is recognized as the 3 clinical subgroups, defined mainly on the degree of HL and VA, can be caused by mutations in one of the 10 known genes. It is important to use all accessible genetic tools to identify and characterize molecular origin in order to improve the knowledge of the physiopathological mechanisms causing Usher Syndrome.In this context, we have developed an exhaustive approach. In a first step, we have implemented the analysis and established the mutational spectrum of the 2 minor USH2 genes (GPR98 and DFNB31). In addition, we have developed several tools, in particular to study variants susceptible to alter splicing or lying in the promoter regions of the USH2 genes.Thanks to this work, the USH2 mutation detection rate has now been raised to 90%, similar to that of USH1.We have then designed a targeted exome of the Usher genes to be sequenced using the GS Junior system (Roche 454). The aim of the study was to test the feasibility of this new technics for a possible transfer to diagnostic facilities. Quality criteria and variant priorization were set up on a control cohort (previously studied in one of the USH gene). The study has then been extended on a patient cohort. Our results indicate that NGS Usher-exome can be used in molecular diagnostics but improvement of the reliability of the sequencing technology, bioinformatics tools and dedicated databases is essential.

Les milliers d’espèces de microorganismes présentes dans les océans sont essentiellement connus pour être planctoniques ou benthiques. Moins décrits, de nombreux micro-organismes colonisent également la surface et le tube digestif des macro-organismes marins, formant des communautés appelées microbiomes. Ces microbiomes ont des conséquences cruciales sur la fitness de leur hôte. Les récents progrès en biologie moléculaire ont ouvert la voie à une caractérisation des différentes facettes de sa biodiversité, à la fois taxonomique, phylogénétique, et fonctionnelle. L’objectif de cette thèse est donc de caractériser la biodiversité des microbiomes cutanés des organismes marins, d’identifier ses échelles de variabilité, ses déterminants, et son importance à l’échelle de l’écosystème. Dans un premier temps j’ai mesuré l’efficacité d’indices de biodiversité à détecter des signaux écologiques dans le cas spécifique de communautés microbiennes. Puis, j’ai décrit le microbiome cutané des principaux grands clades d’animaux marins (poissons téléostéens, cétacés et invertébrés de plusieurs classes). J’ai démontré que le microbiome cutané était très différent des communautés présentes dans l’eau environnante. J’ai aussi montré qu’il était variable, à la fois entre individus et entre espèces, mais ne présentait pas de patron de phylosymbiose. Enfin, j’ai évalué la contribution de la diversité des microbiomes cutanés à la diversité de la communauté microbienne globale d’un écosystème corallien. J’ai ainsi démontré que les animaux marins hébergent collectivement une richesse microbienne presque vingt fois supérieure à celle de l’eau les environnant, et 75% de la richesse phylogénétique à l’échelle de l’écosystème. Dans un contexte d’érosion massive de la diversité des macro-organismes marins, ces résultats soulignent la nécessité d’évaluer plus exhaustivement la biodiversité microbienne marine et sa vulnérabilité face aux pressions anthropiques. / Oceans contain thousands of microbial species playing crucial roles for the functioning of the marine ecosystem. These microorganisms are present everywhere in the water column. Some microorganisms also colonize the surface and the digestive tract of marine macro-organisms, forming communities called microbiomes. These microbiomes have positive effects for their host’s fitness. The diversity of these marine animal surface microbiome is still largely understudied, despite recent progress in molecular biology that now permits to fully assess its different facets of biodiversity, i.e. taxonomic, phylogenetic and functional. The goal of this thesis is therefore to describe the diversity of the surface microbiome of marine animals, to assess its variability at different levels, as well as its determinants, and the significance of such diversity at the ecosystem’s scale. Firstly, I have assessed the efficiency of various diversity indices to detect ecological signals in the specific case of microbial communities. Secondly, I have described the surface microbiome of major marine animal clades (teleostean fishes, cetaceans and several classes of invertebrates). I found that these microbiomes are highly distinct from the surrounding planktonic communities. I demonstrated that these microbiomes are variable both between individuals from the same species and between species, but do not show a phylosymbiosis pattern. Last, I assessed the contribution of surface microbiomes to the global microbial community at the scale of a coral reef ecosystem. I demonstrated that marine animal surfaces host almost twenty times more microbial species than the water column, and 75% of the phylogenetic richness present in the ecosystem. In a context of massive erosion of marine macroscopic organisms, it is therefore urgent to exhaustively assess marine microbial biodiversity and its vulnerability facing anthropic pressures.

Le lymphome est un cancer des ganglions lymphatiques, lieu de prolifération et différenciation des cellules immunitaires en particulier des lymphocytes B qui sont des cellules productrices d'anticorps. Les lymphomes résultent de l’accumulation de mutations génétiques dans le génome d’une cellule B normale contribuant à la transformation en cellule B maligne. Cette cellule B dite transformée prolifère alors pour engendrer un clone de cellules B malignes qui s’accumulent au niveau des ganglions lymphatiques, formant alors une tumeur appelée ‘lymphome B’ (pour cancer lymphoïde issu de la transformation maligne des lymphocytes B). Le ganglion lymphatique normal a une structure histologique qui se décompose ainsi, du centre à la périphérie : le centre germinatif, la zone du manteau et la zone marginale. Les lymphomes B sont classés en différents sous-types histologiques en fonction de leur origine topographique au niveau du ganglion lymphatique et de leurs caractéristiques bio cliniques spécifiques. Parmi ces sous-types, une forme particulièrement agressive peut être distinguée : le lymphome à cellules du manteau. Ce sous-type de lymphome est caractérisé par des rechutes successives et une survie qui est généralement courte (médiane de survie de 4 à 5 ans) même si certains patients, avec des formes plus indolentes de lymphomes à cellules du manteau, présentent des survies prolongées (médiane de survie de 7 à 10 ans). Des biomarqueurs prédictifs de la courte survie manquent aujourd’hui, ce qui rend difficile la prise en charge optimisée des patients. Ce projet s’intéresse à cette question. Plus précisément, nous nous proposons de rechercher des mutations génétiques associées à la résistance thérapeutique. Notre approche sera basée sur le séquençage ciblé à haut débit du génome de cellules B tumorales issus de patients présentant des cas classiques du lymphomes à cellules du manteau mais aussi des cas plus particuliers comme ceux présentant des résistances thérapeutiques précoces, par exemple. Par cette approche dite de ‘cartographie’ à l’échelle du génome, nous espérons identifier des nouveaux prédicteurs moléculaires de la survie chez ces patients atteints de lymphome à cellules du manteau et également apporter de nouvelles connaissances dans l’interconnexion entre la génétique et l’épigénétique dans cette maladie. / Lymphoma is a cancer of the lymph nodes which are organs in which immune cells, particularly the antibody producing B cells, proliferate and differentiate before circulating in the blood and tissues to fight infection. B cell lymphoid cancers – ‘B cell lymphoma’ arise as a consequence of the occurrence of gene mutations in B cells. By affecting the functions of key B cell genes, these mutations drive the malignant transformation of the affected B cells which then begin to divide abnormally eventually destroying normal lymph node organization and function. The lymph node is divided into distinct micro-anatomical compartments or zones which are called (from the inner to outer most compartment – germinal centre, mantle zone, and marginal zone). B cell lymphoma classification follows this general organization and classifies tumours depending on the compartment of origin of the particular tumour B cell population. This classification thus defines lymphoma according to a ‘histological subtype’ with defined clinic-biological features. Among these subtypes, mantle cell lymphoma (MCL) is a particularly aggressive form of B lymphoid cancer. This type of lymphoma is characterised by successive relapses and short survival (median is 4 to 5 years), although some patients can show long survival. Predictive biomarkers of this clinical behavior are lacking. This project aims to address this question. More specifically we propose to perform whole ‘exome’ sequencing – i.e. sequencing of all protein coding sections of all known protein coding genes in the genome – of the tumour B cell DNA from patients who show refractory or early relapsing disease compared to patients who show relatively long survival. By doing this genome scale study we hope to identify new gene mutations that can serve as molecular predictors of survival and bring new knowledges in the understanding between genetics and epigenetics in MCL.

L’arrivée récente de l’immunothérapie a bouleversé la prise en charge des cancers broncho-pulmonaires non à petites cellules (CBNPC). Le nivolumab, anticorps inhibiteur du point de contrôle immunitaire PD-1, a montré des résultats remarquables en deuxième ligne métastatique après échec des chimiothérapies standards de première intention. Cependant, seul un quart des patients tire un bénéfice durable de la prise de ce traitement. `A ce jour, aucun biomarqueur prédictif de l'efficacité thérapeutique du nivolumab n'a pu être identifié de manière claire et consensuelle. La recherche de biomarqueurs prédictifs de bénéfice ou de résistance à ce traitement répresente donc un enjeu majeur.L’apparition du séquençage à haut débit au cours de la dernière décennie a eu un impact considérable sur la recherche clinique et fondamentale, permettant d’appréhender la génétique d’une tumeur dans son ensemble. Ces nouvelles techniques s’ajoutent à d’autres déjà éprouvées telles que l’immunophénotypage ou l’immunohistochimie à disposition des chercheurs pour une analyse extensive des caractéristiques de la tumeur et du patient.L’objectif de ce travail a été d’identifier des marqueurs prédictifs d’efficacité du nivolumab dans le traitement des CBNPC avancés au moyen de ces différentes technologies. Pour cela, notre étude s'est alors intéressée à une cohorte multicentrique de 115 patients atteints de CBNPC et traités par nivolumab en deuxième ou troisième ligne métastatique après échec d'un doublet cytotoxique. Dans les limites de disponibilité et de qualité des échantillons, les profils génétique, transcriptomique et immunohistochimique de la tumeur ainsi que les profils clinique et immunologique des patients ont été analysés.Nos résultats mettent en évidence des marqueurs prédictifs majeurs de réponse au nivolumab. Ainsi, une bonne réponse au doublet cytotoxique de première intention favorise une efficacité optimale du nivolumab en ligne ultérieure. Par ailleurs, un contrôle régulier de l'évolution des cellules myéloïdes immunosuppresives et des cellules cytotoxiques exprimant TIM-3 d'un patient permet de détecter une résistance primaire ou secondaire au traitement. D'autre part, l'estimation conjointe des expressions des protéines PD-L1 et CD8 par séquençage d'ARN constitue un marqueur prédictif majeur de réponse. Sa capacité prédictive surpasse celle de l'estimation de PD-L1 seule et celle d'autres signatures transcriptomiques précédemment établies et composées d'un nombre plus important de gènes. Enfin, l'étude des séquençages d'exome des tumeurs montre l'importance d'une analyse étendue de la génétique tumorale et la nécessité de ne pas se limiter à l'estimation de sa charge mutationnelle.Dans ce travail, nous avons pu mettre en évidence des marqueurs prédictifs d'efficacité du nivolumab dans le traitement des CBNPC avancés. Nos résultats soulignent l'importance de l'utilisation de plusieurs technologies pour la caractérisation de la biologie tumorale et de l'immunité du patient dans une démarche de découverte de biomarqueurs et de construction de modèles prédictifs d'efficacité des immunothérapies. / The recent introduction of immunotherapy has disrupted the management of non-small cell lung cancer (NSCLC). Nivolumab, an antibody targeting the immune checkpoint inhibitor PD-1, has shown remarkable results in seconde-line setting after failure of standard first-line chemotherapy. However, only a quarter of patients benefits from this therapy. To date, no predictive biomarker of the therapeutic efficacy of nivolumab has been identified in a clear and consensual manner. The research for predictive biomarkers of efficacy or resistance to this treatment is, therefore, a major challenge.The emergence of high-throughput sequencing over the past decade has had a significant impact on clinical and fundamental research, making possible to understand the genetics of a tumor as a whole. These new techniques are in addition to other already proven techniques such as immunophenotyping or immunohistochemistry available to researchers for extensive analysis of tumor and patient characteristics.The objective of this work was to identify predictors of the efficacy of nivolumab in the treatment of advanced NSCLC using these different technologies. To do this, our study focused on a multicentre cohort of 115 NSCLC patients treated with nivolumab in the second- or third-line after failure of a cytotoxic doublet. Within the limits of sample availability and quality, the genetic, transcriptomic and immunohistochemical profiles of the tumor as well as the clinical and immunological profiles of the patients were analysed.Our results highlight major predictive markers of response to nivolumab. Thus, a good response to the first-line cytotoxic doublet promotes optimal efficacy of subsequent online nivolumab. In addition, regular monitoring of the evolution of a patient's immunosuppressive myeloid cells and cytotoxic cells expressing TIM-3 can detect primary or secondary resistance to treatment. On the other hand, the joint estimation of PD-L1 and CD8 protein expressions by RNA sequencing is a major predictive marker of response. Its predictive capacity surpasses that of the PD-L1 estimate alone and that of other previously established transcriptomic signatures composed of a larger number of genes. Finally, the study of tumor exome sequencing shows the importance of extensive analysis of tumor genetics and the need not only to focus on the estimation its mutation burden.In this work, we were able to identify predictive markers of the efficacy of nivolumab in the treatment of advanced NSCLC. Our results highlight the importance of using several technologies for the characterization of tumor biology and patient immunity in a process of biomarker discovery and the construction of predictive models of the efficacy of immunotherapies.

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un syndrome myéloprolifératif rare traité par des inhibiteurs de tyrosine kinase, tel que l’imatinib. Malgré son efficacité, la résistance au traitement est un problème récurrent. Des variants génétiques responsables d’une altération de la mort cellulaire programmée (apoptose) pourraient notamment expliquer l’hétérogénéité de la réponse au traitement entre les patients. Dans un premier temps, l’objectif était de rechercher des variants candidats. Pour cela un panel de 45 gènes impliqués dans l’apoptose a été étudié par séquençage nouvelle génération chez 24 patients atteints de LMC, 12 répondeurs et 12 résistants au traitement par imatinib. A l’aide d’outils informatiques, 473 polymorphismes ont été détectés. Le nombre de patients étudiés étant limité, de nouvelles méthodes statistiques ont dû être développées pour analyser les résultats obtenus. Tout d’abord, les fréquences de survenue des variants chez les patients résistants et répondeurs ont été comparées aux fréquences observées dans la population générale et visualisées par une approche de statistiques descriptives. Cette stratégie a permis de réduire la liste à 95 polymorphismes pouvant être impliqués dans la résistance au traitement. Par la suite, les gènes ont été classés selon leur enrichissement en allèles variants. Au final, trois gènes candidats ont été choisis et séquencés chez 103 patients. Cette méthodologie, automatisée grâce à un algorithme informatique, a permis de mettre en évidence, un variant non synonyme dans le gène BCL RAMBO, retrouvé plus fréquemment chez les patients résistants de manière significative. Dans un second temps, l’objectif était de caractériser le rôle de ce variant dans la réponse à l’imatinib à l’aide de lignées cellulaires modifiées par la technologie CRISPR-Cas9. Des cellules n’exprimant plus la protéine ont été obtenues et ont permis de mettre en évidence le rôle majeur de la protéine BCL RAMBO dans l’inhibition de l’apoptose. Des lignées cellulaires portant le variant candidat ont également été créées à l’aide d’une nouvelle technique utilisant CRISPR-Cas9 : l’exon entier contenant le nucléotide d’intérêt a été remplacé par un exon modifié. La modification d’un acide aminé induite par le variant a été associé à une perte de la sensibilité au traitement par imatinib dans ces lignées, comme suggéré après séquençage des patients. Ces données indiquent que BCL-RAMBO, facteur anti-apoptotique dans une lignée modèle de LMC, pourrait devenir une nouvelle cible thérapeutique afin de surmonter la résistance à l’imatinib / Chronic myeloid leukemia (CML) is a rare myeloproliferative syndrome treated by tyrosine kinase inhibitors, such as imatinib. Despite its efficacy, resistance to treatment is a persistent clinical issue. Notably, genetic variants causing alterations in apoptosis may explain heterogeneity of imatinib sensitivity between patients. First, the goal was to look for candidate variants. For that purpose, a panel of 45 apoptotic genes was assessed by next-generation sequencing on 24 CML patients, 12 sensitive and 12 resistant to imatinib treatment. Using informatics tools, 473 polymorphisms were detected. As the number of sequenced samples was limited, novel statistical methods had to be developed to interpret the results. The variant frequency in resistant and sensitive patients was compared to variant frequency in the general population and visualized using descriptive statistics. This strategy allowed to obtain a restricted list of 95 polymorphisms that might be involved in resistance to the treatment. Then, genes were ranked according to variant allele enrichment. At the end, three candidate genes were chosen and sequenced for 103 CML patients. This methodology, automated using a computer algorithm, permitted to highlight a nonsynonymous variant in the BCL RAMBO gene, significantly found more often in resistant patients. Second, the objective was to characterize the role of this variant in response to imatinib using model cell lines modified by CRISPR-Cas9 technology. BCL-RAMBO knock-out cells were obtained and allowed to demonstrate the major role of BCL-RAMBO protein in apoptosis inhibition. Additionally, cell lines carrying the variant were created using a new CRISPR-Cas9 mediated technique: the whole exon carrying the nucleotide of interest was replaced with a variant exon. The amino acid change induced by the identified polymorphism was associated with a loss of sensitivity to imatinib treatment in these cell lines as suggested after patient sequencing. These data indicate that BCL-RAMBO, anti apoptotic factor in a CML cell line, could become a novel therapeutic target to overcome drug inefficacy for a subset of resistant patients.

La caractérisation exaustive des variations de l'ADN peut aider à progresser dans de nombreux champs liés à la génomique du cancer. Le séquençage nouvelle génération (NGS en anglais pour Next Generation Sequencing) est actuellement la technique la plus efficace pour déterminer une séquence ADN, du aux faibles coûts et durées des expériences comparé à la méthode de séquençage traditionnelle de Sanger. Cependant, la détection de mutations à partir de données NGS reste encore un problème difficile, en particulier pour les mutations somatiques présentes en très faible abondance comme lorsque l'on essaye d'identifier des mutations sous-clonales d'une tumeur, des mutations dérivées de la tumeur dans l'ADN circulant libre, ou des mutations somatiques dans des tissus normaux. La difficulté principale est de précisement distinguer les vraies mutations des artefacts de séquençage du au fait qu'ils atteignent des niveaux similaires. Dans cette thèse nous avons étudié la nature systématique des erreurs dans les données NGS afin de proposer des méthodologies efficaces capables d'identifier des mutations potentiellement en faible abondance. Dans un premier chapitre, nous decrivons needlestack, un nouvel outil d'appel de variants basé sur la modélisation des erreurs systématiques sur plusieurs échantillons pour extraire des mutations candidates. Dans un deuxième chapitre, nous proposons deux méthodes de filtrage des variants basées sur des résumés statistiques et sur de l'apprentissage automatique, dans le but de d'améliorer la précision de la détection des mutations par l'identification des erreurs non-systématiques. Finalement, dans un dernier chapitre nous appliquons ces approches pour développer des biomarqueurs de détection précoce du cancer en utilisant l'ADN circulant tumoral / Comprehensive characterization of DNA variations can help to progress in multiple cancer genomics fields. Next Generation Sequencing (NGS) is currently the most efficient technique to determine a DNA sequence, due to low experiment cost and time compared to the traditional Sanger sequencing. Nevertheless, detection of mutations from NGS data is still a difficult problem, in particular for somatic mutations present in very low abundance like when trying to identify tumor subclonal mutations, tumor-derived mutations in cell free DNA, or somatic mutations from histological normal tissue. The main difficulty is to precisely distinguish between true mutations from sequencing artifacts as they reach similar levels. In this thesis we have studied the systematic nature of errors in NGS data to propose efficient methodologies in order to accurately identify mutations potentially in low proportion. In a first chapter, we describe needlestack, a new variant caller based on the modelling of systematic errors across multiple samples to extract candidate mutations. In a second chapter, we propose two post-calling variant filtering methods based on new summary statistics and on machine learning, with the aim of boosting the precision of mutation detection through the identification of non-systematic errors. Finally, in a last chapter we apply these approaches to develop cancer early detection biomarkers using circulating tumor DNA

L'identification de gènes ayant permis à des populations de s'adapter à leur environnement local constitue une des problématiques majeures du domaine de la génétique des populations. Les méthodes statistiques actuelles répondant à cette problématique ne sont plus adaptées aux données de séquençage nouvelle génération (NGS). Nous proposons dans cette thèse de nouvelles statistiques adaptées à ces nouveaux volumes de données, destinées à la détection de gènes sous sélection. Nos méthodes reposent exclusivement sur l'Analyse en Composantes Principales, dont nous justifierons l'utilisation en génétique des populations. Nous expliquerons également les raisons pour lesquelles nos approches généralisent les méthodes statistiques existantes et démontrons l'intérêt d'utiliser une approche basée sur l'Analyse en Composantes Principales en comparant nos méthodes à celles de l'état de l'art. Notre travail a notamment abouti au développement de pcadapt, une librairie R permettant l'utilisation de nos statistiques de détection sur des données génétiques variées. / Identifying genes involved in local adaptation is of major interest in population genetics. Current statistical methods for genome scans are no longer suited to the analysis of Next Generation Sequencing (NGS) data. We propose new statistical methods to perform genome scans on massive datasets. Our methods rely exclusively on Principal Component Analysis which use in population genetics will be discussed extensively. We also explain the reasons why our approaches can be seen as extensions of existing methods and demonstrate how our PCA-based statistics compare with state-of-the-art methods. Our work has led to the development of pcadapt, an R package designed for outlier detection for various genetic data.

L’épidémie actuelle d’obésité est devenue un enjeu majeur de Santé Publique dans les pays industrialisés, mais aussi dans les pays en voie de développement. Elle expose les personnes concernées à de nombreuses maladies cardio-vasculaires, métaboliques, articulaires, cancéreuses, et à une augmentation de la mortalité. Si à l’échelle sociétale, l’obésité est liée aux récents changements de notre mode de vie (accès facile à une alimentation hypercalorique, combiné à une diminution de l’activité physique), à l’échelle individuelle c’est la génétique qui détermine en grande partie notre corpulence. Dans l’obésité commune, polygénique, l’héritabilité du poids est de 70% et 5% des obésités sont monogéniques, dues à une mutation d’un seul gène dans la voie leptine-mélanocortine, régulatrice de la satiété. La diffusion des nouvelles technologies de séquençage haut débit (NGS pour Next Generation Sequencing) a permis des avancées considérables sur la connaissance de la maladie et offre une meilleure efficacité que les méthodes classiques par séquençage Sanger ou par puces à ADN, avec une plus grande rapidité de diagnostic génétique et souvent à moindre coût. Lors de mon travail de thèse, nous avons instauré une collaboration entre les services de Pédiatrie et le Centre de Génétique Chromosomique l’Hôpital Saint-Vincent de Paul à Lille d’une part, et le laboratoire UMR 8199 d’autre part afin d’appliquer ces nouvelles techniques de séquençage au diagnostic génétique d’enfants obèses suivis dans le service. Nous avons d’abord étudié 283 enfants obèses ou en surpoids adressés au Centre de Génétique Chromosomique pour bilan étiologique d’un retard de développement psychomoteur. Les premières analyses génétiques (caryotype, CGH array et recherche d’un syndrome de Prader-Willi par analyse du profil de méthylation) étaient normales et le tableau clinique n’était pas expliqué. Nous avons identifié deux nouvelles mutations délétères de SIM1 (c.886A>G/p.R296G et c.925A>G/p.S309G) chez deux patients caucasiens aux phénotypes différents. Ce travail a fait l’objet d’une publication dans le journal « Obesity ».Dans un deuxième temps, nous avons développé un protocole basé sur le NGS pour la détection simultanée des mutations ponctuelles et des anomalies structurales du génome, délétion ou duplications (CNV pour Copy Number Variation). Nous avons vérifié la capacité de notre capture personnalisée à détecter les CNV connus chez 40 patients du Centre de Génétique Chromosomique porteurs de troubles intellectuels. Puis le protocole a été appliqué chez 29 enfants obèses suivis à l’Hôpital Saint-Vincent de Paul permettant chez un certain nombre d’entre eux l’identification d’anomalies génétiques causales en une seule étape et par conséquence une amélioration de leur prise en charge médicale.Lors de mon travail de thèse, nous avons ainsi montré l’intérêt de l’utilisation des nouvelles techniques de séquençage issues du NGS pour améliorer le diagnostic génétique des enfants suspects d’obésité syndromique ou monogénique, première étape indispensable à l’émergence d’une médecine personnalisée dans la prise en charge de ces enfants. / Obesity has become a major public health issue in industrialized countries as well as in developing countries, exposing obeses patients to many cardiovascular disease, metabolic disease, osteoarthritis and cancer, and to an increasing mortality. The current worldwide obesity epidemic has largely been driven by recent changes in our lifestyle (easy access to a hypercaloric food, combined with a reduction of physical activity), however genetic differences have an appreciable role in the observed individual corpulence variation. In polygenic obesity, weight heritability is 70% and 5% of obesities are monogenic, due to a mutation of a single gene in the leptin-melanocortin pathway, regulating satiety. The use of next generation sequencing (NGS) has led to significant advances in disease awareness and provides better efficacy than conventional Sanger sequencing or DNA-chips with more accurate, faster and cheaper genetic diagnosis.During my PhD, we established a collaboration between the Pediatric departments and the Chromosomal Genetics Center at the Hôpital Saint-Vincent de Paul in Lille on the one hand and the laboratory UMR 8199 on the other hand, in order to apply the NGS to the genetic diagnosis of obese children followed in the service. We first studied 283 obese or overweight children referred to the Chromosomal Genetics Center for aetiological assessment of a developmental delay. The first genetic analyzes (karyotype, CGH array and analysis of the methylation profile for a Prader-Willi syndrome) were normal and the clinical phenotype was not explained. We identified two new deleterious mutations of SIM1 (c.886A> G / p.R296G and c.925A> G / p.S309G) in two Caucasian patients with different phenotypes. This work was published in "Obesity".We also developed an NGS-based protocol for the simultaneous detection of punctual mutations and structural anomalies of the genome, deletion or duplication (CNV for Copy Number Variation). We verified the ability of our personalized capture to detect the CNVs known in 40 patients of the Center of Chromosomal Genetics carrying intellectual disorders. The protocol was then applied to 29 obese children from Saint-Vincent de Paul Hospital, enabling a certain number of them to identify causal genetic abnormalities in a single step and, consequently, improving their medical management.In conclusion, during my PhD, we showed the advantage of using the new sequencing technologies derived from the NGS during the genetic diagnosis for children suspected of syndromic or monogenic obesity, this being the first essential step for the emergence of a personalized medicine in the management of childhood obesity

Le syndrome de Marfan (MFS) est une maladie génétique rare. Les signes cliniques sont principalement squelettiques, oculaires et cardiovasculaires. Le premier gène identifié est FBN1. Une LSDB UMD créée en 1995 a permis de colliger les mutations identifiées chez les patients. D’autres gènes ont été identifiés comme causant des syndromes apparentés : FBN2, TGFBR1, TGFBR2, ACTA2, SMAD3, MYH11 et MYLK. Ma thèse avait pour but de mettre à jour ces différentes bases et de créer celles des nouveaux gènes. Les techniques de séquençage nouvelle génération dans la pratique clinique amènent des médecins non spécialistes à rapporter des variations secondaires dans ces gènes « actionable ». Il s’agit de la ressource la plus complète pour les cliniciens et les généticiens pour interpréter les variants associés au MFS et ses pathologies associées pour les variants primaires et secondaires.La bicuspidie de la valve aortique (2 feuillets au lieu de 3) est la malformation cardiovasculaire la plus fréquente touchant 0,6 à 2 % de la population. Ma thèse avait pour but d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans la BAV. Grâce à une cohorte de 200 patients, le gène HOXA1, un facteur de transcription, a pu être examiné de manière plus approfondie. Alors qu’il contient une répétition de 10 histidines, les individus hétérozygotes mutés en présentent 11. Mes études ont permis de démontrer l’imputabilité de cette mutation. Dans un second temps, un séquençage d’exomes entiers a permis de mettre en évidence de nouveaux variants prédits pathogènes. Ces données permettront de mieux comprendre le rôle physiologique d’HOXA1 et des nouveaux gènes candidats dans la pathogénèse de la BAV chez l’humain. / Marfan Syndrome is a rare genetic disorder. Clinical signs are mainly skeletal, ocular and cardiovascular. The first gene identified is FBN1. A LSDB UMD was created in 1995 to colligate all the mutations identified in. Thereafter, several others genes were identified involved in related disorders : FBN2, TGFBR1 and TGFBR2, ACTA2, SMAD3, MYH11 and MYLK. The objectives of my PhD were to update these databases and to create new ones for genes. Next generation sequencing in clinical practice leads non-specialized doctors to report pathogenic secondary variants in “actionable” genes. Our databases are the only resources providing access to the full spectrum of known pathogenic mutations with checked and interpreted data from many reference diagnostic laboratories and research centers worldwide, and the most comprehensive resources for clinicians and geneticists to interpret variations linked to Marfan syndrome and related disorders not only primary but also secondary variants.Bicuspid Aortic Valve is the most common cardiovascular malformation affecting 0.6-2% of the population (2 leaflets instead of 3). Thanks to a cohort of 200 BAV patients, HOXA1 gene, a transcription factor, has been screened. While HOXA1 contains a string of 10 histidine repeats, these individuals are heterozygous for an 11 histidine repeat variant. My studies showed the imputability of this mutation. In a second phase, whole exome sequencing allow us to highlight new variants predicted pathogenic. Studies are still ongoing to confirm their imputability. These data contribute to our better understanding of the physiological of HOXA1 and new candidate genes in the pathogenesis of BAV disease in humans.