published_or_final_version / abstract / Pathology / Doctoral / Doctor of Philosophy

published_or_final_version / Medical Sciences / Master / Master of Medical Sciences

La progression tumorale est caractérisée par deux processus clés, la prolifération et l’invasion cellulaires. Les nAChRs, activés par la nicotine et ses nitrosamines dérivées (NNN et NNK), modulent les concentrations calciques intracellulaires et activent in vitro la prolifération, l’apoptose, la migration et l’invasion de lignées cellulaires tumorales. Dans cette étude, nous montrons, en utilisant des cultures primaires de cellules dérivées de cancers pulmonaires non à petites cellules (carcinomes épidermoïdes et adénocarcinomes), que les nAChRs α7 régulent différemment la prolifération cellulaire en fonction du stade de différenciation des tumeurs. Le nAChR α7 agit comme répresseur de la prolifération cellulaire dans les tumeurs bien différenciées et dans l’épithélium respiratoire normal, alors que dans les tumeurs peu différenciées, il stimule la prolifération cellulaire en réponse à la nicotine. A l’inverse, le nAChR α3α5β2 n’est que partiellement impliqué dans la régulation de la prolifération cellulaire aussi bien dans les tumeurs pulmonaires que dans l’épithélium respiratoire normal. Les nAChRs α7 et nAChRs α3α5β2 sont tous les deux impliqués dans la stimulation de l’invasion des cellules tumorales des carcinomes épidermoïdes et adénocarcinomes. Le polymorphisme non-synonyme rs16969968 de la sous-unité α5 induit une mutation au niveau d’un acide aminé hautement conservé (D398N). De nombreuses études d’association pangénomiques lient ce polymorphisme au développement des cancers pulmonaires. Dans cette étude nous montrons que les nAChRs exprimant la sous-unité α5 mutée (D398N) altèrent la prolifération et la différenciation des cellules respiratoires et modulent l’invasion des cellules tumorales, en synergie avec les nAChRs α7. / Tumor progression is characterized by two key processes, cell proliferation and invasion. Nicotinic receptors, activated by nicotine and its derived nitrosamines (NNK and NNN) modulate intracellular calcium concentrations and activate in vitro proliferation, apoptosis, migration and invasion of tumor cell lines. In this study, we show, by using primary cell cultures from lung cancer tumors, adenocarcinoma and squamous cell carcinoma, that nAChR α7 differently regulates cell proliferation according to the state of tumor differentiation. The α7 nAChRs acts as a repressor of cell proliferation in differentiated lung cancer tissues and in the normal respiratory epithelium, while it stimulates cell proliferation in response to nicotine, in poorly differentiated tumors. Conversely, the α3α5β2 nAChR is only partially involved in the regulation of cell proliferation in lung cancers and in the normal respiratory epithelium. The α7 and α3α5β2 nAChRs are both involved in the in vitro invasion process of adenocarcinoma and squamous cell carcinoma. Non-synonymous polymorphism rs16969968 in the CHRNA5 gene induces a mutation in a highly conserved amino acid (D398N). Many genome-wide association studies have demonstrated the relationship between this polymorphism and the incidence of lung cancer. In this study, we show that nAChRs, expressing the mutated α5 subunit (D398N), are in involved in the alteration of the proliferation and the differentiation state of respiratory epithelial cells, and also modulate tumor cell invasion, in synergy with the α7 nAChRs.

Au cours de l'invasion tumorale, la matrice extracellulaire du tissu broncho-pulmonaire, riche en élastine, subit de nombreux remaniements. La dégradation de cette élastine conduit à la production de peptides bioactifs. Ces peptides d'élastine (PE) possèdent un récepteur spécifique, le complexe récepteur de l'élastine (CRE), et peuvent également interagir avec l'intégrine alphavbeta3 et la galectine-3. Dans cette étude, nous avons étudié le rôle des PE et de leurs récepteurs dans la progression tumorale des carcinomes broncho-pulmonaires.Des cellules épithéliales bronchiques tumorales sont incubées in vitro avec un mélange de PE, la kappa-élastine (kE), ou avec des peptides synthétiques. Le traitement par les peptides entraine une augmentation de la capacité infiltrante des cellules invasives associée à un relargage précoce de MMP 2, MMP 9 et uPA mais n'a pas d'effet sur la prolifération et le phénotype cellulaire. Les niveaux d'ARNm des 3 protéases stimulées ne sont pas modifiés et ni l'actinomycine D, ni le cycloheximide ou la bréfeldine A ne sont capables d'inhiber les effets liés à la kE. Ces effets ne sont pas non plus inhibés par le lactose et les autres antagonistes des trois récepteurs. Enfin, les peptides VGVAPG et GRKRK, présentant les séquences spécifiques reconnues par les récepteurs, ne réussissent pas à reproduire les effets observés avec la kE, alors que des nonapeptides les reproduisent de façon quasi-identique.Ces résultats montrent que les PE régulent la capacité invasive des carcinomes broncho-pulmonaires, via le relargage d'enzymes protéolytiques. Cette modulation mettrait en jeu des mécanismes post-traductionnels et un récepteur lactose-insensible, différent du CRE, de l'intégrine alphavbeta3 et de la galectine-3, et reconnaissant des nonapeptides d'élastine. / Elastin-rich lung extra-cellular matrix is largely remodeled during tumor invasion. Elastin degradation produces peptides displaying a wide range of biological activities. These elastin derived peptides (EP) interact with the Elastin Receptor Complex (ERC) but also bind to alphaVbeta3 integrin and galectin-3. In this study, we explored the role of EP and their receptors in tumor progression of lung carcinomas.In vitro, lung tumor cells were incubated in presence of kappa-elastin (kE), a mix of EP or with synthetic elastin peptides. EP treatment induced an increase of invasive capacity of invasive cells with quickly increased levels of MMP-2, MMP 9 and uPA but had no effect on cell proliferation and phenotype. Interestingly, protease regulation was not observed at the mRNA level and actinomycin D, cycloheximide and brefeldin A were unable to inhibit kE effects. These effects could not be inhibited either by classical receptor antagonists including lactose or blocking antibodies. Finally, synthetic peptides VGVAPG and GRKRK, displaying receptor-specific sequences, failed to reproduce kE effects whereas nonapeptides partially mimicked them.These results demonstrate that treatment with EP up-regulates invasiveness of lung tumor cells via the release of proteolytic enzymes. This modulation involves post-translational mechanisms and a lactose-insensitive receptor, different from the ERC, alphaVbeta3 integrin and galectin-3 and recognizing nonapeptidic sequences.

L’arrivée récente de l’immunothérapie a bouleversé la prise en charge des cancers broncho-pulmonaires non à petites cellules (CBNPC). Le nivolumab, anticorps inhibiteur du point de contrôle immunitaire PD-1, a montré des résultats remarquables en deuxième ligne métastatique après échec des chimiothérapies standards de première intention. Cependant, seul un quart des patients tire un bénéfice durable de la prise de ce traitement. `A ce jour, aucun biomarqueur prédictif de l'efficacité thérapeutique du nivolumab n'a pu être identifié de manière claire et consensuelle. La recherche de biomarqueurs prédictifs de bénéfice ou de résistance à ce traitement répresente donc un enjeu majeur.L’apparition du séquençage à haut débit au cours de la dernière décennie a eu un impact considérable sur la recherche clinique et fondamentale, permettant d’appréhender la génétique d’une tumeur dans son ensemble. Ces nouvelles techniques s’ajoutent à d’autres déjà éprouvées telles que l’immunophénotypage ou l’immunohistochimie à disposition des chercheurs pour une analyse extensive des caractéristiques de la tumeur et du patient.L’objectif de ce travail a été d’identifier des marqueurs prédictifs d’efficacité du nivolumab dans le traitement des CBNPC avancés au moyen de ces différentes technologies. Pour cela, notre étude s'est alors intéressée à une cohorte multicentrique de 115 patients atteints de CBNPC et traités par nivolumab en deuxième ou troisième ligne métastatique après échec d'un doublet cytotoxique. Dans les limites de disponibilité et de qualité des échantillons, les profils génétique, transcriptomique et immunohistochimique de la tumeur ainsi que les profils clinique et immunologique des patients ont été analysés.Nos résultats mettent en évidence des marqueurs prédictifs majeurs de réponse au nivolumab. Ainsi, une bonne réponse au doublet cytotoxique de première intention favorise une efficacité optimale du nivolumab en ligne ultérieure. Par ailleurs, un contrôle régulier de l'évolution des cellules myéloïdes immunosuppresives et des cellules cytotoxiques exprimant TIM-3 d'un patient permet de détecter une résistance primaire ou secondaire au traitement. D'autre part, l'estimation conjointe des expressions des protéines PD-L1 et CD8 par séquençage d'ARN constitue un marqueur prédictif majeur de réponse. Sa capacité prédictive surpasse celle de l'estimation de PD-L1 seule et celle d'autres signatures transcriptomiques précédemment établies et composées d'un nombre plus important de gènes. Enfin, l'étude des séquençages d'exome des tumeurs montre l'importance d'une analyse étendue de la génétique tumorale et la nécessité de ne pas se limiter à l'estimation de sa charge mutationnelle.Dans ce travail, nous avons pu mettre en évidence des marqueurs prédictifs d'efficacité du nivolumab dans le traitement des CBNPC avancés. Nos résultats soulignent l'importance de l'utilisation de plusieurs technologies pour la caractérisation de la biologie tumorale et de l'immunité du patient dans une démarche de découverte de biomarqueurs et de construction de modèles prédictifs d'efficacité des immunothérapies. / The recent introduction of immunotherapy has disrupted the management of non-small cell lung cancer (NSCLC). Nivolumab, an antibody targeting the immune checkpoint inhibitor PD-1, has shown remarkable results in seconde-line setting after failure of standard first-line chemotherapy. However, only a quarter of patients benefits from this therapy. To date, no predictive biomarker of the therapeutic efficacy of nivolumab has been identified in a clear and consensual manner. The research for predictive biomarkers of efficacy or resistance to this treatment is, therefore, a major challenge.The emergence of high-throughput sequencing over the past decade has had a significant impact on clinical and fundamental research, making possible to understand the genetics of a tumor as a whole. These new techniques are in addition to other already proven techniques such as immunophenotyping or immunohistochemistry available to researchers for extensive analysis of tumor and patient characteristics.The objective of this work was to identify predictors of the efficacy of nivolumab in the treatment of advanced NSCLC using these different technologies. To do this, our study focused on a multicentre cohort of 115 NSCLC patients treated with nivolumab in the second- or third-line after failure of a cytotoxic doublet. Within the limits of sample availability and quality, the genetic, transcriptomic and immunohistochemical profiles of the tumor as well as the clinical and immunological profiles of the patients were analysed.Our results highlight major predictive markers of response to nivolumab. Thus, a good response to the first-line cytotoxic doublet promotes optimal efficacy of subsequent online nivolumab. In addition, regular monitoring of the evolution of a patient's immunosuppressive myeloid cells and cytotoxic cells expressing TIM-3 can detect primary or secondary resistance to treatment. On the other hand, the joint estimation of PD-L1 and CD8 protein expressions by RNA sequencing is a major predictive marker of response. Its predictive capacity surpasses that of the PD-L1 estimate alone and that of other previously established transcriptomic signatures composed of a larger number of genes. Finally, the study of tumor exome sequencing shows the importance of extensive analysis of tumor genetics and the need not only to focus on the estimation its mutation burden.In this work, we were able to identify predictive markers of the efficacy of nivolumab in the treatment of advanced NSCLC. Our results highlight the importance of using several technologies for the characterization of tumor biology and patient immunity in a process of biomarker discovery and the construction of predictive models of the efficacy of immunotherapies.

Les tumeurs sont généralement constituées de différentes sous-populations de cellules cancéreuses génétiquement hétérogènes, responsables en grande partie de la capacité de la tumeur à évoluer rapidement et à s’adapter aux conditions environnementales. Cette diversité génétique a des conséquences majeures pour le patient, notamment au cours de la progression tumorale et pour l’acquisition d’une résistance aux traitements.Nous avons développé une nouvelle stratégie basée sur la technologie CRISPR/Cas9 qui consiste à introduire, en plus d’une altération de séquence voulue d’un gène d’intérêt, une série de mutations silencieuses, constituant une sorte d’étiquette génétique qui peut être détectée par PCR quantitative ou séquençage de nouvelle génération. En parallèle, un code-barres constitué exclusivement de mutations silencieuses est utilisé comme contrôle interne pour les effets non spécifiques potentiels qui peuvent être engendrés suite au clivage hors-cible par le système CRISPR/Cas9. Cette approche, que nous avons appelée CRISPR-barcoding, permet de générer et de suivre l’émergence d’un petit groupe de cellules cancéreuses contenant une mutation voulue au sein d’une population de cellules non modifiées, représentant ainsi un nouveau modèle expérimental d’hétérogénéité génétique intratumorale. Grâce à une série de preuves de concept, nous avons montré que CRISPR-barcoding est une nouvelle approche qui permet d’étudier de façon simple et rapide les conséquences fonctionnelles de différents types de modifications génétiques apportées directement au niveau de la séquence génomique.Dans la deuxième partie de ma thèse, nous avons utilisé cette nouvelle approche pour l'étude de la résistance du cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC) à la thérapie ciblée. Les patients de CBNPC dont la tumeur présente une mutation activatrice de l'epidermal growth factor receptor (EGFR) sont généralement traités avec des inhibiteurs de ce récepteur. Malheureusement, malgré une réponse initiale, presque invariablement ces patients rechutent, suite au développement d’une résistance causée, dans la majorité des cas, par l’apparition de mutations secondaires ou tertiaire de l'EGFR. Grâce à un criblage réalisé en utilisant un modèle de CBNPC basé sur la stratégie CRISPR-barcoding, nous avons pu identifier l’inhibiteur multikinase sorafenib pour sa capacité à prévenir la résistance de ces cellules aux inhibiteurs d’EGFR. Ce composé présente un mécanisme d’action original, impliquant une diminution précoce du niveau de phosphorylation de STAT3, suivie par une baisse considérable de l’expression de l’EGFR, aboutissant à une inhibition des voies intracellulaires en aval de ce récepteur, telles que RAS-MAPK et PI3K-AKT-mTOR. Ces données ont été confirmées in vivo en utilisant un modèle de xénogreffe de cellules de CBNPC modifiées par CRISPR-barcoding.En conclusion, l’ensemble de nos résultats montre que le sorafenib peut prévenir l’émergence de cellules de CBNPC résistantes aux inhibiteurs d’EGFR, indiquant que ce composé pourrait représenter une nouvelle stratégie thérapeutique pour le traitement de ce type de tumeur. / Individual tumors are composed of multiple and genetically distinct subpopulations of transformed cells that can adapt and evolve in a different way based on environmental conditions. This genetic diversity has major consequences for the patient, particularly during tumor progression and for cancer treatment.We devised a new strategy based on CRISPR/Cas9 technology in which a potentially functional modification in the sequence of a gene of interest is coupled with a series of silent point mutations, functioning as a genetic label for cell tracing. In parallel, a second barcode consisting of distinct silent mutations is inserted in the same cell population and used as a control for CRISPR/Cas9 off-target cleavage. This approach, that we named CRISPR barcoding, enables detection of cells containing the mutation of interest within a mass population of unmodified cells using real-time quantitative PCR or deep sequencing. Through a series of proof-of-concept studies, we demonstrated that CRISPR-barcoding is a fast and highly flexible strategy to investigate the functional consequences of a specific genetic modification in a broad range of assays.In the second part of my thesis, we used CRISPR-barcoding to investigate non-small cell lung cancer (NSCLC) resistance to targeted therapy. Some NSCLCs harbor activating mutations of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and are addicted to this signaling pathway. These tumors initially show a good response to EGFR inhibitors (EGFRi), but they almost invariably relapse, due to the acquisition of a resistance, as a result of additional genetic alterations, including secondary and tertiary EGFR mutations. Using a CRISPR-barcoding model, we identified the multikinase inhibitor sorafenib for its ability to prevent EGFRi resistance in NSCLC cells. This compound acts through an original mechanism that involves early reduction of STAT3 phosphorylation and late down-regulation of EGFR, resulting in the inhibition of different downstream pathways activated by this receptor, including, RAS-MAPK and PI3K-AKT-mTOR. These results were confirmed in vivo, using a CRISPR-barcoding xenograft model for NSCLC.Altogether, our data indicate that sorafenib can prevent NSCLC resistance to EGFRi through a novel mechanism, thus providing a new potential therapeutic strategy for the treatment of this type of cancer.