La progression tumorale est caractérisée par deux processus clés, la prolifération et l’invasion cellulaires. Les nAChRs, activés par la nicotine et ses nitrosamines dérivées (NNN et NNK), modulent les concentrations calciques intracellulaires et activent in vitro la prolifération, l’apoptose, la migration et l’invasion de lignées cellulaires tumorales. Dans cette étude, nous montrons, en utilisant des cultures primaires de cellules dérivées de cancers pulmonaires non à petites cellules (carcinomes épidermoïdes et adénocarcinomes), que les nAChRs α7 régulent différemment la prolifération cellulaire en fonction du stade de différenciation des tumeurs. Le nAChR α7 agit comme répresseur de la prolifération cellulaire dans les tumeurs bien différenciées et dans l’épithélium respiratoire normal, alors que dans les tumeurs peu différenciées, il stimule la prolifération cellulaire en réponse à la nicotine. A l’inverse, le nAChR α3α5β2 n’est que partiellement impliqué dans la régulation de la prolifération cellulaire aussi bien dans les tumeurs pulmonaires que dans l’épithélium respiratoire normal. Les nAChRs α7 et nAChRs α3α5β2 sont tous les deux impliqués dans la stimulation de l’invasion des cellules tumorales des carcinomes épidermoïdes et adénocarcinomes. Le polymorphisme non-synonyme rs16969968 de la sous-unité α5 induit une mutation au niveau d’un acide aminé hautement conservé (D398N). De nombreuses études d’association pangénomiques lient ce polymorphisme au développement des cancers pulmonaires. Dans cette étude nous montrons que les nAChRs exprimant la sous-unité α5 mutée (D398N) altèrent la prolifération et la différenciation des cellules respiratoires et modulent l’invasion des cellules tumorales, en synergie avec les nAChRs α7. / Tumor progression is characterized by two key processes, cell proliferation and invasion. Nicotinic receptors, activated by nicotine and its derived nitrosamines (NNK and NNN) modulate intracellular calcium concentrations and activate in vitro proliferation, apoptosis, migration and invasion of tumor cell lines. In this study, we show, by using primary cell cultures from lung cancer tumors, adenocarcinoma and squamous cell carcinoma, that nAChR α7 differently regulates cell proliferation according to the state of tumor differentiation. The α7 nAChRs acts as a repressor of cell proliferation in differentiated lung cancer tissues and in the normal respiratory epithelium, while it stimulates cell proliferation in response to nicotine, in poorly differentiated tumors. Conversely, the α3α5β2 nAChR is only partially involved in the regulation of cell proliferation in lung cancers and in the normal respiratory epithelium. The α7 and α3α5β2 nAChRs are both involved in the in vitro invasion process of adenocarcinoma and squamous cell carcinoma. Non-synonymous polymorphism rs16969968 in the CHRNA5 gene induces a mutation in a highly conserved amino acid (D398N). Many genome-wide association studies have demonstrated the relationship between this polymorphism and the incidence of lung cancer. In this study, we show that nAChRs, expressing the mutated α5 subunit (D398N), are in involved in the alteration of the proliferation and the differentiation state of respiratory epithelial cells, and also modulate tumor cell invasion, in synergy with the α7 nAChRs.

Les tumeurs sont généralement constituées de différentes sous-populations de cellules cancéreuses génétiquement hétérogènes, responsables en grande partie de la capacité de la tumeur à évoluer rapidement et à s’adapter aux conditions environnementales. Cette diversité génétique a des conséquences majeures pour le patient, notamment au cours de la progression tumorale et pour l’acquisition d’une résistance aux traitements.Nous avons développé une nouvelle stratégie basée sur la technologie CRISPR/Cas9 qui consiste à introduire, en plus d’une altération de séquence voulue d’un gène d’intérêt, une série de mutations silencieuses, constituant une sorte d’étiquette génétique qui peut être détectée par PCR quantitative ou séquençage de nouvelle génération. En parallèle, un code-barres constitué exclusivement de mutations silencieuses est utilisé comme contrôle interne pour les effets non spécifiques potentiels qui peuvent être engendrés suite au clivage hors-cible par le système CRISPR/Cas9. Cette approche, que nous avons appelée CRISPR-barcoding, permet de générer et de suivre l’émergence d’un petit groupe de cellules cancéreuses contenant une mutation voulue au sein d’une population de cellules non modifiées, représentant ainsi un nouveau modèle expérimental d’hétérogénéité génétique intratumorale. Grâce à une série de preuves de concept, nous avons montré que CRISPR-barcoding est une nouvelle approche qui permet d’étudier de façon simple et rapide les conséquences fonctionnelles de différents types de modifications génétiques apportées directement au niveau de la séquence génomique.Dans la deuxième partie de ma thèse, nous avons utilisé cette nouvelle approche pour l'étude de la résistance du cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC) à la thérapie ciblée. Les patients de CBNPC dont la tumeur présente une mutation activatrice de l'epidermal growth factor receptor (EGFR) sont généralement traités avec des inhibiteurs de ce récepteur. Malheureusement, malgré une réponse initiale, presque invariablement ces patients rechutent, suite au développement d’une résistance causée, dans la majorité des cas, par l’apparition de mutations secondaires ou tertiaire de l'EGFR. Grâce à un criblage réalisé en utilisant un modèle de CBNPC basé sur la stratégie CRISPR-barcoding, nous avons pu identifier l’inhibiteur multikinase sorafenib pour sa capacité à prévenir la résistance de ces cellules aux inhibiteurs d’EGFR. Ce composé présente un mécanisme d’action original, impliquant une diminution précoce du niveau de phosphorylation de STAT3, suivie par une baisse considérable de l’expression de l’EGFR, aboutissant à une inhibition des voies intracellulaires en aval de ce récepteur, telles que RAS-MAPK et PI3K-AKT-mTOR. Ces données ont été confirmées in vivo en utilisant un modèle de xénogreffe de cellules de CBNPC modifiées par CRISPR-barcoding.En conclusion, l’ensemble de nos résultats montre que le sorafenib peut prévenir l’émergence de cellules de CBNPC résistantes aux inhibiteurs d’EGFR, indiquant que ce composé pourrait représenter une nouvelle stratégie thérapeutique pour le traitement de ce type de tumeur. / Individual tumors are composed of multiple and genetically distinct subpopulations of transformed cells that can adapt and evolve in a different way based on environmental conditions. This genetic diversity has major consequences for the patient, particularly during tumor progression and for cancer treatment.We devised a new strategy based on CRISPR/Cas9 technology in which a potentially functional modification in the sequence of a gene of interest is coupled with a series of silent point mutations, functioning as a genetic label for cell tracing. In parallel, a second barcode consisting of distinct silent mutations is inserted in the same cell population and used as a control for CRISPR/Cas9 off-target cleavage. This approach, that we named CRISPR barcoding, enables detection of cells containing the mutation of interest within a mass population of unmodified cells using real-time quantitative PCR or deep sequencing. Through a series of proof-of-concept studies, we demonstrated that CRISPR-barcoding is a fast and highly flexible strategy to investigate the functional consequences of a specific genetic modification in a broad range of assays.In the second part of my thesis, we used CRISPR-barcoding to investigate non-small cell lung cancer (NSCLC) resistance to targeted therapy. Some NSCLCs harbor activating mutations of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and are addicted to this signaling pathway. These tumors initially show a good response to EGFR inhibitors (EGFRi), but they almost invariably relapse, due to the acquisition of a resistance, as a result of additional genetic alterations, including secondary and tertiary EGFR mutations. Using a CRISPR-barcoding model, we identified the multikinase inhibitor sorafenib for its ability to prevent EGFRi resistance in NSCLC cells. This compound acts through an original mechanism that involves early reduction of STAT3 phosphorylation and late down-regulation of EGFR, resulting in the inhibition of different downstream pathways activated by this receptor, including, RAS-MAPK and PI3K-AKT-mTOR. These results were confirmed in vivo, using a CRISPR-barcoding xenograft model for NSCLC.Altogether, our data indicate that sorafenib can prevent NSCLC resistance to EGFRi through a novel mechanism, thus providing a new potential therapeutic strategy for the treatment of this type of cancer.