Les nucleotides sont des molécules organiques essentielles à la vie qui participent à diverses fonctions des organismes vivants comprenant le stockage de l'information génétique (ADN), sa transcription (ARNm), sa traduction (ARNr, ARNt) en protéine et la régulation de cette traduction (miARN) ainsi qu'au contrôle de l'activité de certaines protéines comme les protéines kinases (ATP) et au stockage de l'énergie chimique (ATP, GTP). Les nucleotides peuvent aussi être relâchés dans le milieu extracellulaire et servir de signaux autocrines et paracrines en activant des récepteurs P2 spécifiques. Leur concentration est contrôlée par des ecto-nucléotidases qui hydrolysent les nucleotides en nucleosides. Ces enzymes peuvent ainsi influencer l'activation des récepteurs P2. Dans cette thèse, j'introduirai d'abord de façon globale la signalisation par les nucleotides, les nucleosides et les molécules qui contiennent des nucleotides (c'est-à-dire NAD, FAD, NpnN) et décris ensuite de façon plus spécifique l'importance de cette signalisation dans le processus inflammatoire. Par la suite, , je présenterai le travail que j'ai entrepris afin de mieux comprendre le rôle joué par les ecto-nucléotidases en approfondissant la caractérisation biochimique des nucleosides triphosphates diphosphohydrolases (NTPDases) et en analysant le rôle de l'une d'entre elles, la NTPDasel, dans le macrophage murin. Ensuite, je présenterai la caractérisation d'une nouvelle ecto-nucléotidase, la NTPDase8 (chapitre 2), et la comparaison des propriétés biochimiques des quatre NTPDases humaines et murines présentes au niveau de la membrane plasmique soit les NTPDasel, 2, 3 et 8 (Chapitre 3). Ces enzymes peuvent contrôler la concentration des différents agonistes des récepteurs P2 de façon fine et distincte. Au chapitre 4, je présenterai la caractérisation de l'ARL 67156, un inhibiteur potentiel de la NTPDasel. Parmi les différentes ecto-nucléotidases hydrolysant l'ATP extracellulaire, cette molécule inhibe de façon compétitive les NTPDasel et NTPDase3 ainsi que la nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase-1 (NPP1). Finalement, je montrerai que la NTPDasel est la principale ecto-nucléotidase des macrophages murins où elle contrôle l'activation du récepteur P2X₇ et les fonctions qui lui sont associées telles que la mort induite par l'ATP, l'ouverture d'un pore et la relâche d'IL-iβ et d'IL-18, deux cytokines précoces de l'inflammation.

L’ATP est l’agoniste naturel du récepteur P2Y11. Ce nucléotide ne peut cependant pas être utilisé comme agent thérapeutique car, in vivo, il s’hydrolyse rapidement en ADP ou en AMP qui ne possèdent qu’une faible activité pour le récepteur. D’où l’intérêt de disposer d’analogues de synthèse moins sensibles à l’hydrolyse et possédant une affinité égale ou supérieure à celle de l’ATP. Le premier objectif que nous nous sommes fixés au cours de notre thèse de doctorat fut de mettre au point un schéma de synthèse permettant d’obtenir des analogues de l’adénosine-5’-triphosphate [1] portant un motif thioalkyle ou thioaryle en position 2 de la base ainsi qu’un groupement dichlorométhylène entre les phosphores b et g de la chaîne polyphosphate. En effet, ces composés présentent une activité agoniste vis-à-vis du récepteur P2Y11, leurs synthèses sont bien décrites dans la littérature et les produits de départ sont beaucoup moins onéreux qu’en série 2’-désoxy. De plus, ces synthèses permettront de mettre les différentes réactions au point avant de synthétiser les analogues de la 2’-désoxyadénosine. Ces composés présentant une activité agoniste vis-à-vis du récepteur P2Y11 systématiquement supérieure à leurs homologues de la série 2’-OH, leur synthèse fera l’objet de la deuxième partie de ce travail. Deux schémas de synthèse en sept étapes ont été imaginés pour effectuer la synthèse des dérivés [101] à [105], l’un au départ d’adénosine [12] et l’autre au départ de guanosine [39]. Le schéma au départ d’adénosine ne nous a pas permis d’obtenir les analogues désirés en raison des difficultés de reproductibilité des réactions ainsi qu’en raison du faible rendement de la deuxième étape du schéma de synthèse. Le schéma au départ de la guanosine a permis quant à lui d’obtenir les analogues de l’adénosine-5’-triphosphate [101] à [105] avec des rendements globaux compris entre 10 et 20 %. Les tests d’activité agoniste ont montré que le dérivé [105] active le récepteur P2Y11 de la même manière que l’ATPgS avec des concentrations trois fois moindre. La deuxième partie de ce travail consista en la synthèse d’analogues du 2-thiodésoxynucléotide-5’-triphosphate. Un schéma de synthèse analogue à celui utilisé pour la synthèse des dérivés [101] à [105] au départ de la 2’-désoxyguanosine [40] aurait pu permettre l’obtention de tels dérivés. Cependant, les problèmes de dégradation rencontrés que le problème lié à l’introduction d’un motif thioalkyle (troisième étape) nous ont contraint à abandonner cette stratégie de synthèse. Les dérivés [106] à [110] ont finalement été synthétisés au départ du 2-désoxyribose [50]. Nous avons ensuite engagé ces analogues dans la réaction de phosphorylation. C’est lors de cette réaction que nous avons rencontré des problèmes importants de purification et de dégradation. Afin de résoudre ces problèmes, nous avons adopté pour une autre stratégie de synthèse afin d’obtenir les analogues triphosphate. Cette stratégie consiste en l’introduction d’un naphtoate en position 3’ afin de modifier la polarité de la molécule et espérer ainsi pouvoir obtenir une meilleure séparation. Les phosphorylations sur ces dérivés ont été effectuées dans les mêmes conditions que précédemment n’ont pas permis d’aboutir aux monophosphates correspondants. Dans ces conditions, l’ester naphtoïque et le lien glycosidique sont hydrolysés.

Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L'adénosine, la PGE2 ou l'AMP cyclique intracellulaire mènent toutes à des actions antiinflammatoires chez le neutrophile en inhibant par exemple la phagocytose, la production d'ions superoxydes, l'adhésion et la libération de cytokines. Par contre, les mécanismes moléculaires régulant ces actions anti-inflammatoires ne sont pas bien connus. Dans cette étude, nous avons étudié l'impact que ces agents ont sur le profil d'expression des gènes du neutrophile. L'expression génique a été étudiée par Genechip puis les résultats obtenus ont été validés par la technique du peR en temps réel. Avec cette approche, une quinzaine de gènes dont l'expression était altérée par ces agents ont été identifiés. Remarquablement, les trois agents utilisés ont eu un impact fort similaire sur le profil d'expression, suggérant un mécanisme commun permettant de limiter l'activation cellulaire. Nous avons donc identifié lors de ce projet un ensemble de gènes qui peuvent constituer d'importants signaux d'arrêt de l'activation du neutrophile.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Dans le cerveau adulte, la signalisation liée à l’adénosine facilite ou inhibe la libération vésiculaire de neurotransmetteurs suite à l’activation des récepteurs de l’adénosine de type 2A ou 1 (A2AR ou A1R), respectivement. Cependant, son rôle dans le développement est mal connu. Au cours de ma thèse, j’ai étudié le rôle de la signalisation adénosine dans la synaptogenèse GABAergiques de l’hippocampe. Nous avons mis en évidence (i) une sécrétion activité-dépendante accrue d’adénosine et d’ATP pendant la période de synaptogenèse, (ii) un pic d’expression de l’enzyme limitant la formation de l’adénosine à partir de l’ATP extracellulaire, l’ecto-5’-nucleotidase, aux synapses pendant cette période critique, et (iii) un pic d’expression péri/post- synaptique du A2AR concomitant de la période de synaptogenèse. Cette expression développementale des molécules clés de la signalisation adénosine dépendante du A2AR corrélait avec un rôle de ce récepteur dans la stabilisation des synapses GABAergiques naissantes, une régulation restreinte à la période de synaptogenèse. De plus, la suppression de A2AR par une approche shRNA dans des neurones isolés conduisait à une perte de synapses GABAergiques équivalente à celle observée après un blocage pharmacologique de l’activité du A2AR, signifiant que la stabilisation synaptique médiée par le A2AR est un processus « cellule autonome » indépendant de l’activité du réseau neuronal et qu’elle requiert l’activation du A2AR dans la cellule post-synaptique.L’ATP et l’adénosine sont secrétés par la glie et les neurones ; cependant, nous avons montré in vitro que la libération neuronale activité-dépendante suffit à stabiliser les synapses GABAergiques naissantes. En utilisant la vidéomicroscopie sur cellules vivantes, nous avons montré que la signalisation adénosine stabilise les synapses actives. Puis, nous avons caractérisé le mécanisme moléculaire sous-jacent. Nous rapportons la contribution de la cascade adénylate cyclase/adénosine monophosphate cyclique/protéine kinase A et nous avons identifié une ciblé clé, la géphrine, la molécule d’ancrage postsynaptique des récepteurs GABAA. Enfin, nous avons mis en évidence que la stabilisation de l’élément présynaptique requiert probablement le complexe trans-synaptique Slitrk3-PTPd.Puisque le GABA exerce une fonction similaire au cours du développement et que le GABA et l’adénosine sont co-libérés à certaines synapses, j’ai étudié l’interaction entre ces deux voies de signalisation. Mes résultats favorisent l’hypothèse que la signalisation GABA, en activant la calcium-calmoduline, converge vers la signalisation adénosine en potentiant les adenylates cyclases sensibles au calcium. Mon travail m’a permis de proposer que, au cours d’une période clé du développement, les A2ARs postsynaptiques agissent comme des senseurs de l’activité des terminaisons présynaptiques GABAergiques pour stabiliser les synapses actives. En absence d’activité et donc de libération d’adénosine/ATP, les synapses seraient éliminées. / In the adult brain, adenosine signaling facilitates or inhibits neurotransmitter vesicular release mainly through activation of type 2A or 1 adenosine receptors (A2AR or A1R), respectively. However, its role in development remains to be elucidated. During my PhD, I addressed the role of A2AR-mediated signalling in GABAergic synaptogenesis in the hippocampus. We found (i) a larger activity-dependent release of ATP and adenosine during the period of synaptogenesis in the hippocampus, (ii) a peak of expression of the ecto-5’-nucleotidase, the rate-limiting enzyme for the formation of adenosine from extracellular ATP in synapses during this critical period, and (iii) a peak of peri/post-synaptic expression of A2AR concomitant with the period of synaptogenesis. This developmental expression of the key molecules of the adenosine A2AR signalling pathway correlated with a role of A2AR in the stabilization of nascent GABA synapses, a regulation restricted to the period of synaptogenesis. Furthermore, suppressing A2AR with a shRNA approach in isolated neurons led to a loss of synapses equivalent to that seen upon A2AR activity blockade, reporting that the A2AR-mediated synapse stabilization is a cell autonomous process that requires A2AR activation in the postsynaptic cell. ATP/adenosine can be secreted by both glia and neurons; however, we found that activity-dependent release of neuronal adenosine is sufficient to stabilize newly formed GABA synapses in vitro. Using live cell imaging, we showed adenosine signalling stabilizes active synapses. We then characterized the molecular mechanism downstream postsynaptic A2AR. We report the contribution of adenylyl cyclase/cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A signalling cascade and we identified a key target, the postsynaptic scaffolding molecule gephyrin. We further showed the A2AR-mediated stabilization of the presynaptic compartment most probably requires the trans-synaptic Slitrk3-PTPd complex. Since GABA exerts a similar function during development and GABA and adenosine are co-released at some synapses, I further investigated the interplay between these two pathways. My results support the hypothesis that GABA signalling converge onto the adenosine signalling pathway by potentiating calcium-sensitive adenylyl cyclases through the activation of calmodulin.Altogether these results let us propose that, during a key developmental period, postsynaptic A2ARs act as sensors of the activity of GABAergic presynaptic terminals to stabilize active nascent GABAergic synapses. In absence of activity and therefore secretion of adenosine/ATP, synapses will be eliminated.

Le foie possède une forte activité d'hydrolyse de l'ATP extracellulaire associée aux canalicules biliaires qui a longtemps été utilisée comme marqueur de cette structure. Jusqu'à récemment, peu d'information était disponible quant à la nature exacte de cette activité. Le clonage d'une nouvelle ectonucléotidase fortement exprimée dans le foie, l'ectonucléoside triphosphate diphosphohydrolase-8 (NTPDase8), suggérait un nouveau candidat potentiel pouvant correspondre à l'ecto-ATPase canaliculaire hépatique. Le premier objectif de mon doctorat était donc de déterminer l'identité moléculaire de la protéine responsable de l'activité ATPasique canaliculaire hépatique. L'ADN complémentaire de la NTPDase8- de rat a été clone et utilisé pour la caractérisation biochimique de l'enzyme recombinante et la production de sera polyclonaux spécifiques. Les activités ATPase et ADPase hépatiques ont été détectées par histochimie enzymatique et l'expression de la NTPDase8 par immunohistochimie. L'activité ATPase majeure de foie de rat a été purifiée, caractérisée biochimiquement et ses propriétés enzymatiques comparées à celles de la NTPDase8 de rat recombinante. Tous les résultats obtenus démontrent que la NTPDase8 correspond à l'ecto-ATPase canaliculaire. Mon deuxième objectif de doctorat était d'étudier l'influence potentielle des NTPDases et de l'ecto-5'-nucléotidase/CD73 sur les concentrations extracellulaires de nucleotides hépatiques, selon leur localisation cellulaire respective. Les différentes ectonucléotidases exprimées à la surface des cellules hépatiques modulent l'activation des récepteurs de nucleosides Pl et/ou de nucleotides P2, en contrôlant les niveaux extracellulaires de leurs agonistes. Dans le foie, les NTPDases sont responsables majoritairement de l'hydrolyse des nucleotides extracellulaires comme l'ATP et l'ADP alors que l'ecto-5'-nucléotidase génère la principale quantité d'adénosine extracellulaire, à pH physiologique. Les activités ATPase, ADPase et AMPase hépatiques ont été détectées par histochimie enzymatique, et l'expression des NTPDasel, 2 et 8, et de l'ecto-5'-nucleotidase par immunofluorescence. L'expression de l'ecto-5'-nucleotidase a été analysée par cytometric de flux sur divers types cellulaires hépatiques primaires. Les profils d'hydrolyse de l'ATP en présence de différentes combinaisons NTPDase/ecto-5'-nucleotidase (reflétant la localisation hépatique de ces enzymes) ont été analysés par HPLC. Nos résultats montrent que les niveaux de nucléo(s/t)ides extracellulaires varient en fonction de la combinaison d'ecto-nucléotidases considérées et de la concentration initiale de substrat ATP extracellulaire.

Leishmania est un parasite protozoaire eucaryote unicellulaire qui infecte plus de 1.6 millions de personnes chaque année dans plus de 98 pays. Aucun vaccin humain est actuellement disponible et peu de traitements efficaces sont utillisés pour lutter contre le large spectre de pathologies causées par Leishmania. Récemment, l’étude du contrôle de la qualité des protéines chez Leishmania infantum a révélé que DDX3, une DEAD-box hélicase à ARN dotée de multiples fonctions dans le métabolisme de l’ARN et la signalisation cellulaire, joue un rôle central dans le contrôle de qualité des protéines dans la mitochondrie. Une étude plus approfondie de ce mécanisme a révélé des interactions potentielles de DDX3 avec des composantes clés de la réponse cellulaire au stress, en particulier avec une protéine de la famille des AAA + ATPases, VCP/p97/Cdc48. Comme VCP/p97/Cdc48 participe à de multiples étapes dans le contrôle de qualité des protéines en utilisant son hydrolyse de l’ATP pour séparer les protéines ubiquitinées de leurs partenaires et les acheminer au protéasome 26S pour dégradation, nous avons émis l’hypothèse que l’homologue très conservé chez Leishmania, LiVCP, pourrait agir de la même façon. Cette étude a permis la caractérisation fonctionnelle de l’homologue VCP chez Leishmania, son rôle dans la réponse du parasite au stress et sa survie dans les macrophages, ses interactions potentielles avec d’autres partenaires dont des cofacteurs clés, ainsi que la modélisation 3D des interactions LiVCP-cofacteurs. En utilisant des mutants génétiquement générés ayant moins de copies du gène LiVCP ou des mutants dominants négatifs avec une activité VCP altérée, nous avons démontré que LiVCP est un gène essentiel et que les mutants VCP sont incapables de survivre sous le shock de la chaleur et présentent un déficit de croissance très marqué chez les amastigotes. De plus, nous avons montré une forte accumulation de protéines polyubiquitinées et une sensibilité accrue au stress protéotoxique chez ces mutants, soutenant la fonction de chaperone sélective de l'ubiquitine de LiVCP. Grâce à des analyses in silico et à la «protéomique en réseau» en utilisant des études de co-immunoprécipitation et de spectrométrie de masse (LC-MS / MS), nous avons établi le premier réseau protéique de VCP chez les parasites protozoaires et déterminé que p47, FAF2, UFD1, PUB1 et l’hétérodimère NPL4-UFD1 étaient les principaux cofacteurs de LiVCP. Enfin, nos travaux nous ont permis de faire progresser nos connaissances générales sur la protéine essentielle VCP et le contrôle de la qualité des protéines chez Leishmania et d’indiquer quelques perspectives intéressantes pour approfondir notre compréhension sur ces mécanismes importants non seulement chez Leishmania mais aussi chez d’autres trypanosomatides. / Leishmania is a unicellular eukaryotic protozoan parasite that infects over 1.6 million people each year in more than 98 countries. No human vaccine is currently available and few effective treatments are used to combat the broad spectrum of diseases caused by Leishmania. Recently, studies on Protein Quality Control in Leishmania infantum revealed that the multifunctional DEAD-box RNA helicase DDX3 involved among others in RNA metabolism and cell signaling plays a central role in mitochondrial protein quality control. Further studies revealed potential interactions of DDX3 with key components of the cellular stress response, particularly with the conserved AAA+ ATPase VCP/ p97/Cdc48. As VCP is associated with many ubiquitin-dependent cellular pathways that are central to protein quality control in other eukaryotic systems using its ATP hydrolysis to separate ubiquitinated proteins from their partners and bring them to the 26S proteasome for degradation, we hypothesized that the Leishmania highly conserved counterpart, LiVCP, might act in similar way. This study enabled the functional characterization of the Leishmania VCP homolog, its role in the parasite's response to stress and survival inside macrophages, its potential interactions with other partners including key VCP cofactors, and the homology 3D modeling of LiVCP-cofactor interactions. Using genetically engineered mutants with fewer copies of the LiVCP gene or dominant negative mutants with altered VCP activity, we demonstrated that LiVCP is an essential gene and that VCP mutants are unable to survive under heat stress and exhibit a very marked growth defect in amastigotes. In addition, we showed a high accumulation of polyubiquitinated proteins and increased susceptibility to proteotoxic stress in these mutants, supporting that LiVCP has an ubiquitin selective chaperone function. Using "network proteomics" analyses by co-immunoprecipitation and mass spectrometry (LC-MS/MS) studies, we established the first VCP protein network in protozoan parasites and determined p47, FAF2, UFD1, PUB1 and the NPL4-UFD1 heterodimer as the major cofactors of LiVCP. Overall, our work allowed us to advance general knowledge of the essential role of VCP in Leishmania protein quality control and to propose some interesting perspectives to deepen our understanding of these important pathways not only in Leishmania but also in other trypanosomatids.

L'objectif principal de cette étude consistait à identifier et à caractériser des inhibiteurs de l'activité enzymatique des Nucléosides Triphosphates Diphosphohydrolases (NTPDases) de la membrane cytoplasmique, soient les NTPDase 1, 2, 3 et 8. Ainsi, dans un premier temps, nous avons caractérisé l'inhibition de certains antagonistes des récepteurs P2 sur les NTPDases. Puis, nous avons produit et testé des inhibiteurs spécifiques de ces enzymes, tels des anticorps monoclonaux. Nos résultats nous permettent de conclure que certains antagonistes des récepteurs P2 tels la suramine, le NF279, le réactif bleu-2 sont aussi des inhibiteurs non sélectifs de l'activité enzymatique des formes humaines et murines des NTPDasel, 2, 3 et 8. Parmi les antagonistes testés, le plus puissant s'est avéré être le NF279. Soulignons cependant, qu'il suffit d'une modification chimique de certains de ces antagonistes pour obtenir une inhibition plus sélective de certaines NTPDases. Finalement nous avons produit et caractérisé un anticorps dirigé contre la NTPDase3 humaine qui inhibe spécifiquement cette enzyme. Ce nouvel anticorps monoclonal que nous avons produit au laboratoire représente actuellement le premier inhibiteur spécifique d'une NTPDase. Dans ce travail, nous avons également démontré que cet anticorps monoclonal est très efficace dans différents types d'expérimentation telles le Western blot, l'immunohistochimie et la cytométrie de flux. L'identification et la caractérisation de ces outils permettront une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels les nucléotides extracellulaires, via l'activation des récepteurs P2, modulent des fonctions biologiques importantes telles le développement, la sécrétion endocrinienne, l'inflammation et les réactions immunitaires.

Titre de l'écran-titre (visionné le 29 mai 2023) / La mitochondrie est connue comme la centrale électrique des cellules vivantes. Son rôle est indispensable à la vie et son dysfonctionnement peut entraîner de graves maladies. D'après certaines expériences faites avec des sondes fluorescentes qui se répartissent principalement du côté matrice de la membrane mitochondriale interne, il a récemment été suggéré que la mitochondrie fonctionne à des températures beaucoup plus élevées (~ 50°C) que la température physiologique du corps. Cette découverte, si elle est vraie, nécessiterait la réévaluation de l'efficacité et de tous les cycles thermodynamiques basée sur l'équation de Mitchell, centrale à la théorie chimiosmotique. C'est l'un des aspects de la bioénergétique des mitochondries qui est au cœur du présent projet. Au chapitre 2, des doutes et des critiques concernant la suggestion d'une mitochondrie plus chaude sont soulevés et brièvement discutés. Les implications et répercussions possibles d'une telle affirmation sur certains aspects de la biochimie et de la biophysique mitochondriales sont passées en revue. Une mitochondrie plus chaude - comme on le revendique - impliquerait une correction de 3% du terme de gradient chimique. De plus, si cette affirmation était vraie et dans la mesure revendiquée (10°C), cela impliquererait un certain caractère de moteur thermique (de Carnot) pour le fonctionnement thermodynamique mitochondrial bien que cet aspect ne représente que 4% au plus. Une « mitochondrie chaude » appelle un examen plus approfondi du bilan énergétique qui lui confère ces prétendues températures élevées. Dans les chapitres 3 et 4, comme première étape de cet effort, nous présentons une comptabilité semi-quantitative dans laquelle une formule est proposée qui donne le taux de production de chaleur dans une mitochondrie typique ainsi qu'une formule pour estimer le nombre de molécules d'ATP synthase par mitochondrie. Cent trente types de cellules protozoaires hétérotrophes sont considérés dans cette étude. Les cellules étudiées, sélectionnées pour couvrir une large gamme de tailles (volumes) d'env. 25 µm³ à 125 millions de µm³, sont estimées correspondre à une puissance par mitochondrie allant d'env. 2×10⁰ pW à 4×10⁻⁴ pW. Dans ces cellules, le nombre correspondant d'ATP synthases actives par mitochondrie varie de 37,000 à une dizaine environ. Au chapitre 5, l'origine du désaccord entre la mesure expérimentale et les estimations théoriques est abordée. Étant donné que les estimations théoriques à l'état d'équilibre placent la différence de températures entre la mitochondrie et son environnement à un maximum de 10⁻⁵ °C, ce désaccord de 6 ordres de grandeur est appelé le « paradoxe de la mitochondrie chaude. » On suggère que chaque proton transloqué via l'ATP synthase déclenche un pic de différence de température, qui durerait seulement quelques picosecondes, de l'ordre de magnitude mesuré par Chrétien et al. La moyenne temporelle de ces pics de température redonne la valeur théorique. De plus, une superposition temporelle et spatiale de l'intensité de fluorescence d'un très grand nombre de thermomètres moléculaires dans l'échantillon peut donner l'apparence d'un signal stable et continu. La membrane mitochondriale interne semble être flanquée de différences de températures fluctuant dans le temps et le long de la surface de la membrane, avec des points « chauds » et « froids » sous forme de pointes de température ultrabrèves. Au chapitre 6, il est montré que le potentiel électrostatique moléculaire intrinsèque (MESP) de l'ATP synthase s'ajoute de manière constructive au potentiel électrostatique chimiosmotique et donc le renforce. Cette tension due à la structure même de la protéine représente un nouveau terme d'énergie libre qui semble avoir été négligé jusqu'à présent. Ce terme est au moins à peu près égal en ordre de grandeur et opposé en signe à l'énergie nécessaire pour être dissipée comme un démon de Maxwell (principe de Landauer). Le potentiel électrique à travers la membrane mitochondriale interne, dans laquelle le MESP de l'ATP synthase joue un rôle important, doit être maintenu dans certaines limites pour le bon fonctionnement de la cellule. Dans le chapitre 7, un mécanisme qualitatif pour l'homéostasie de ce potentiel de membrane est proposé, par lequel une augmentation du champ électrique ralentirait l'étape limitante de la chaîne de transport d'électrons (ETC). Une augmentation de tension limite ainsi la vitesse de pompage des protons dans l'espace intermembranaire en ralentissant directement l'ETC mais aussi en court-circuitant l'ETC par électroporation de la membrane entraînant une dépolarisation de celle-ci. La thèse se termine par un chapitre sur l'orientation future possible de la recherche et les principales conclusions qui découlent des travaux qui y sont présentés. / The mitochondrion is known as the powerhouse of all living cells. Its role is indispensable to life, and its malfunction can lead to serious diseases. On the basis of experiments with fluorescent probes that distribute primarily in the inner mitochondrial membrane and the matrix-side of the inner membrane, it has recently been suggested that the mitochondrion is likely to be operating at much higher temperatures than physiological temperature of the body (~ 50°C). This discovery, if true, would necessitate the re-evaluation of the thermodynamic efficiency and all of the thermodynamic cycles, based on the Mitchell equation central to chemiosmotic theory. It is this aspect of the bio-energetics of mitochondria that is at the core of the present project. In chapter 2, doubts and criticisms regarding the suggestion of a hotter mitochondrion have been raised and are briefly discussed. The possible implications and repercussion of such a claim - if true - on some aspects of mitochondrial biochemistry and biophysics are reviewed. A hotter mitochondrion - as claimed - would imply a 3% correction in the chemical gradient term. Further, if this claim is true and to the extent claimed (10°C), this may imply some heat-engine character for mitochondrial thermodynamic operation albeit this may only represent 4% at most. A "hot mitochondrion" calls for a closer examination of the energy balance that endows it with these claimed elevated temperatures. In chapters 3 and 4, as a first step in this effort, we present a semi-quantitative bookkeeping whereby, in one stroke, a formula is proposed that yields the rate of heat production in a typical mitochondrion and a formula for estimating the number of "active" ATP synthase molecules per mitochondrion. One-hundred thirty heterotrophic protozoa cell types are considered in this study. The studied cells, selected to cover a wide range of sizes (volumes) from ca. 25 µm³ to 125 million µm³, are estimated to exhibit a power per mitochondrion ranging from ca. 2×10⁰ pW to 4×10⁻⁴ pW. In these cells, the corresponding number of active ATP synthases per mitochondrion ranges from 37,000 to just about ten. In chapter 5, the origin of disagreement between the experimental measurement and the theoretical estimates is investigated. Since the steady-state theoretical estimates place the temperature difference between the mitochondrion and its surrounding at a maximum of 10⁻⁵ °C, this million-fold disagreement is called the "hot mitochondrion paradox". It is suggested that every proton translocated via ATP synthase sparks a picosecond temperature-difference spike of the order of magnitude measured by Chrétien et al. Time-averaging of these spikes recovers the theoretical value. Further, a temporal and spatial superposition of the fluorescence intensity of a very large number of molecular thermometer molecules in the sample can give the appearance of a steady signal. The inner mitochondrial membrane appears to be flanked by temperature differences fluctuating in time and along the membrane's surface, with "hot" and "cold" spots as ultrashort temperature spikes. In chapter 6, it is shown that the ATP synthase's intrinsic molecular electrostatic potential (MESP) adds constructively to, and hence reinforces, the chemiosmotic voltage. This ATP synthase voltage represents a new free energy term that appears to have been overlooked. This term, at least in ATP synthase molecules derived from five different organisms, is roughly equal in order of magnitude and opposite in sign to the energy needed to be dissipated as a Maxwell's demon (Landauer principle). The electransic potential across the inner mitochondrial membrane must be maintained within certain bounds for the proper functioning of the cell. In chapter 7, a qualitative mechanism for the homeostasis of this membrane potential is proposed whereby an increase in the electric field slows-down the rate-limiting steps of the electron transport chain (ETC). An increase in voltage thus limits the rate of pumping of the protons in the inter-membrane gap by slowing the ETC directly but also through short-circuiting the ETC by electroporation of the membrane leading to depolarization of the membrane. The thesis ends with a chapter on the possible future directions of this research and the main conclusions that arise from the work presented therein.