Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les cellules de l’organisme réagissent au danger en relâchant des substances dont les nucléotides, qui sont à l’origine de l’inflammation et/ou fibrose notamment au niveau du foie. Ceux-ci activent leurs récepteurs P2 disséminés sur la plupart des cellules de l’organisme. Il existe des enzymes parmi lesquelles les NTPDases, habilitées à hydrolyser ces nucléotides, limitant ainsi leur activité pro¬inflammatoire. Notre laboratoire a identifié, cloné et localisé la NTPDase8, au niveau des canalicules biliaires du foie. Predisant une fonction dans l’inflammation hépato-biliaire in vivo, nous avons généré une lignée de souris déficiente en cette enzyme et des anticorps dirigés contre celle-ci. Durant ma maitrise, j’ai confirmé la déficience de l’enzyme (ADN, ARN et protéine) dans cette lignée de souris Entpd8-/-. Les souris déficientes se sont révélées plus inflammées sans traitement, mais moins atteintes par l’inflammation et la fibrose que les souris sauvages à la suite de deux modèles distincts de fibrose hépatique. / Body cells react, to danger signals by releasing in the external environment, substances such as nucleotides that are responsible for inflammation and/or fibrosis. Nucleotids activate their P2 receptors spread throughout the body. There are enzymes such as the NTPDases, which are empowered to hydrolyze these nucleotides thus limiting their P2 receptor-induced activation. Our laboratory has identified, cloned and located one of those enzymes referred as NTPDase8 at the level of the liver bile canaliculi. This location may lead to a particular function in liver inflammatory attacks. So, we generated NTPdase8 knock-out mice and antibodies against this protein. During my Master degree, I characterized NTPDase8-deficient mice to the level of DNA, RNA and protein. I then developed two models of liver fibrosis to assess the role of this enzyme in vivo. The knock-out mice which started more inflamed were found little less inflamed and fibrotic after the experiments than wild-type mice.

Le neutrophile humain est une cellule immunitaire qui a besoin de constamment adapter ses réponses aux signaux fournis par son milieu afin d'être efficace dans la première ligne de défense contre les pathogènes. Nous avons identifié au cours de cette thèse le rôle de cytohésine-1, un facteur d'échange du GTP pour les petites protéines G de la famille des Arfs dans la régulation de la signalisation et des fonctions des neutrophiles humains. Nous avons ainsi montré l'implication de cytohésine-1 dans l'activation d'Arfô et de la phosphohpase D, ce qui aboutit à la régulation de la dégranulation et la production d'anion superoxyde par le neutrophile. Nous avons également montré l'impact de cytohésine-1 sur les fonctions du neutrophile liées aux β2 intégrines LFA-1 et Mac-1, comme l'adhésion, la migration et la phagocytose. Ces résultats indiquant l'importance de cytohésine-1 dans la physiologie du neutrophile in vitro, suggèrent que cette protéine pourrait avoir un rôle dans le cadre d'une inflammation.

L’ATP est l’agoniste naturel du récepteur P2Y11. Ce nucléotide ne peut cependant pas être utilisé comme agent thérapeutique car, in vivo, il s’hydrolyse rapidement en ADP ou en AMP qui ne possèdent qu’une faible activité pour le récepteur. D’où l’intérêt de disposer d’analogues de synthèse moins sensibles à l’hydrolyse et possédant une affinité égale ou supérieure à celle de l’ATP. Le premier objectif que nous nous sommes fixés au cours de notre thèse de doctorat fut de mettre au point un schéma de synthèse permettant d’obtenir des analogues de l’adénosine-5’-triphosphate [1] portant un motif thioalkyle ou thioaryle en position 2 de la base ainsi qu’un groupement dichlorométhylène entre les phosphores b et g de la chaîne polyphosphate. En effet, ces composés présentent une activité agoniste vis-à-vis du récepteur P2Y11, leurs synthèses sont bien décrites dans la littérature et les produits de départ sont beaucoup moins onéreux qu’en série 2’-désoxy. De plus, ces synthèses permettront de mettre les différentes réactions au point avant de synthétiser les analogues de la 2’-désoxyadénosine. Ces composés présentant une activité agoniste vis-à-vis du récepteur P2Y11 systématiquement supérieure à leurs homologues de la série 2’-OH, leur synthèse fera l’objet de la deuxième partie de ce travail. Deux schémas de synthèse en sept étapes ont été imaginés pour effectuer la synthèse des dérivés [101] à [105], l’un au départ d’adénosine [12] et l’autre au départ de guanosine [39]. Le schéma au départ d’adénosine ne nous a pas permis d’obtenir les analogues désirés en raison des difficultés de reproductibilité des réactions ainsi qu’en raison du faible rendement de la deuxième étape du schéma de synthèse. Le schéma au départ de la guanosine a permis quant à lui d’obtenir les analogues de l’adénosine-5’-triphosphate [101] à [105] avec des rendements globaux compris entre 10 et 20 %. Les tests d’activité agoniste ont montré que le dérivé [105] active le récepteur P2Y11 de la même manière que l’ATPgS avec des concentrations trois fois moindre. La deuxième partie de ce travail consista en la synthèse d’analogues du 2-thiodésoxynucléotide-5’-triphosphate. Un schéma de synthèse analogue à celui utilisé pour la synthèse des dérivés [101] à [105] au départ de la 2’-désoxyguanosine [40] aurait pu permettre l’obtention de tels dérivés. Cependant, les problèmes de dégradation rencontrés que le problème lié à l’introduction d’un motif thioalkyle (troisième étape) nous ont contraint à abandonner cette stratégie de synthèse. Les dérivés [106] à [110] ont finalement été synthétisés au départ du 2-désoxyribose [50]. Nous avons ensuite engagé ces analogues dans la réaction de phosphorylation. C’est lors de cette réaction que nous avons rencontré des problèmes importants de purification et de dégradation. Afin de résoudre ces problèmes, nous avons adopté pour une autre stratégie de synthèse afin d’obtenir les analogues triphosphate. Cette stratégie consiste en l’introduction d’un naphtoate en position 3’ afin de modifier la polarité de la molécule et espérer ainsi pouvoir obtenir une meilleure séparation. Les phosphorylations sur ces dérivés ont été effectuées dans les mêmes conditions que précédemment n’ont pas permis d’aboutir aux monophosphates correspondants. Dans ces conditions, l’ester naphtoïque et le lien glycosidique sont hydrolysés.

Les lymphocytes Th17 représentent une sous-population lymphocytaire hautement inflammatoire, due à leur particularité à produire des cytokines pro-inflammatoires dont notamment l'IL-17 qui représente leur cytokine signature. Les Th17 jouent un rôle central dans le développement de plusieurs maladies inflammatoires auto-immunes, cependant les mécanismes intervenant dans la régulation de leur fonction effectrice, notamment dans le contexte de ces maladies, demeurent peu connus. Des études récentes ont montré que la signalisation purinergique joue un rôle dans la régulation de la réponse immune et inflammatoire notamment dans l'activation des lymphocytes T CD4⁺ naïfs. Dans cette maitrise, j'ai porté mon intérêt sur le rôle des nucléotides extracellulaires et leurs récepteurs dans l'activation et la différenciation des lymphocytes Th17 humains. Nous avons démontré par RT-PCRq que les Th17 expriment les récepteurs à nucléotides P2X4,5,7 et P2Y₁₁. En utilisant des antagonistes spécifiques pour chacun des récepteurs P2, sauf pour le P2X5 qui n'est pas fonctionnel chez l'humain, nous avons démontré que l'inhibition du P2X4, contrairement à celle des autres récepteurs à nucléotides, bloque la polarisation des lymphocytes T CD4⁺ vers la voie Th17 et diminue la production d'IL-17 suite de l'activation des Th17 polarisés par des anticorps anti-CD3 et anti-CD28. Par contre, la voie de polarisation des Th1 n'est pas affectée par l'antagonisme du P2X4. De plus, l'inhibition de P2X4 a diminué également la prolifération des lymphocytes T, alors qu'un antagoniste des récepteurs P2X7 et P2Y₁₁ n'a eu aucun effet. Ces résultats montrent que le récepteur P2X4 joue un rôle majeur dans la différenciation et l'activation des Th17 et pourrait réguler le développement des maladies inflammatoires.

Les lymphocytes Th17 représentent une sous-population lymphocytaire hautement inflammatoire, due à leur particularité à produire des cytokines pro-inflammatoires dont notamment l'IL-17 qui représente leur cytokine signature. Les Th17 jouent un rôle central dans le développement de plusieurs maladies inflammatoires auto-immunes, cependant les mécanismes intervenant dans la régulation de leur fonction effectrice, notamment dans le contexte de ces maladies, demeurent peu connus. Des études récentes ont montré que la signalisation purinergique joue un rôle dans la régulation de la réponse immune et inflammatoire notamment dans l'activation des lymphocytes T CD4⁺ naïfs. Dans cette maitrise, j'ai porté mon intérêt sur le rôle des nucléotides extracellulaires et leurs récepteurs dans l'activation et la différenciation des lymphocytes Th17 humains. Nous avons démontré par RT-PCRq que les Th17 expriment les récepteurs à nucléotides P2X4,5,7 et P2Y₁₁. En utilisant des antagonistes spécifiques pour chacun des récepteurs P2, sauf pour le P2X5 qui n'est pas fonctionnel chez l'humain, nous avons démontré que l'inhibition du P2X4, contrairement à celle des autres récepteurs à nucléotides, bloque la polarisation des lymphocytes T CD4⁺ vers la voie Th17 et diminue la production d'IL-17 suite de l'activation des Th17 polarisés par des anticorps anti-CD3 et anti-CD28. Par contre, la voie de polarisation des Th1 n'est pas affectée par l'antagonisme du P2X4. De plus, l'inhibition de P2X4 a diminué également la prolifération des lymphocytes T, alors qu'un antagoniste des récepteurs P2X7 et P2Y₁₁ n'a eu aucun effet. Ces résultats montrent que le récepteur P2X4 joue un rôle majeur dans la différenciation et l'activation des Th17 et pourrait réguler le développement des maladies inflammatoires.

Les maladies inflammatoires de l'intestin (MII) sont caractérisées par le dysfonctionnement de l'épithélium intestinal et la dérégulation de l'équilibre du système immunitaire. L'inflammation liée aux MII pourrait être déclenchée et / ou exacerbée par des signaux de danger tels que les nucléotides. Les nucléotides activent les récepteurs P2 et leurs niveaux sont modulés par des ectonucléotidases dont la famille des ecto-nucléosides triphosphates diphosphohydrolases (ENTPDases). Nous avons identifié le dernier membre de cette famille d'enzymes que nous avons nommé NTPDase8. Nous avons observé que cette enzyme est exprimée par peu de tissus dont les intestins. Dans cette thèse, nous démontrons que la NTPDase8 est exprimée à la surface apicale des cellules épithéliales intestinales (CEI) au niveau du colon. Nos résultats indiquent que la NTPDase8 est un protecteur clé de l'inflammation intestinale. En effet, elle prévient l'activation du récepteur P2Y6. Nous résultats proposent aussi que l’injection intra-rectale de la NTPDase8 protège totalement les souris de la colite induite par un modèle chimique. Le deuxième aspect abordé dans ma thèse est le rôle régulateur du récepteur P2Y6 dans l'inflammation intestinale. Nos résultats in vivo montrent l'importance de bloquer ce récepteur pharmacologiquement afin d’éviter le développement de l'inflammation et ainsi éviter une boucle inflammatoire. Nous avons également démontré que le récepteur P2Y6 joue un rôle clé dans la régulation de l'activité d'autres récepteurs à nucléotides in vitro, ce qui influence l'homéostasie des cellules épithéliales intestinales. Notre travail décrypte l'importance de la signalisation associée aux nucléotides dans la pathogenèse de la colite expérimentale et met en évidence des propriétés qui pourraient être appliquées à d’autres troubles gastro-intestinaux outre la colite. En extension, ces données suggèrent que l'axe NTPDase8-P2Y6 pourrait être une cible thérapeutique dans le traitement des maladies inflammatoires de l’intestin. / Inflammatory bowel diseases (IBD) are characterized by a dysfunction of the intestinal epithelium and a dysregulation of the immune system balance. The inflammation underlying IBD could be triggered and/or exacerbated by danger signals such as nucleotides. The nucleotides activate P2 receptors and their level is modulated by ectonucleotidases which include members of the ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) family. We identified the last member of this family of enzymes, the NTPDase8. We originally found its expression in the intestine at the RNA level. In this work, we demonstrate that NTPDase8 is expressed at the apical surface of intestinal epithelial cells (IEC) in the colon. Our results indicate that NTPDase8 is a key protector of intestinal inflammation by regulating the activation of P2Y6 receptor as the administration of the enzyme protects totally from the intestinal inflammation. In agreement, the deletion of NTPDase8 gene leads to a dramatic increase of inflammation is a murine model of colitis. The second aspect addressed in my thesis is the regulatory role of the P2Y6 receptor in intestinal inflammation. We found that this receptor expressed on IEC is pro-inflammatory and that blocking it pharmacologically prevented the intestinal inflammation triggered in a colitis model. We have also demonstrated that the P2Y6 receptor plays a key role in regulating the activity of other nucleotide receptors in vitro, which influences the homeostasis of intestinal epithelial cells. Our work deciphers the importance of nucleotide signaling in the pathogenesis of experimental colitis and highlights properties that could be applied to other gastrointestinal disorders. In extension, these data suggest that NTPDase8-P2Y6 axis could be a therapeutic target in the treatment of IBD.

Les hélicases sont des enzymes extrêmement répandues qui sont essentielles pour mener à bien l'ensemble des processus cellulaires impliquant des acides nucléiques. Ces protéines parviennent à annihiler les structures secondaires et tertiaires qui peuvent se former dans l'ADN ou l'ARN grâce à l'énergie puisée par l'hydrolyse de l'ATP. Les hélicases ne sont toutefois pas l'exclusivité des organismes eucaryotes et procaryotes, mais bon nombre de virus codent aussi pour des enzymes possédant cette fonction. La famille des Flaviviridae ne fait pas exception à ce groupe puisque l'ensemble des virus de cette famille code pour une hélicase nommée NS3. La famille des Flaviviridae est une famille virale d'une importance monumentale étant donné la présence de nombreux pathogènes humains parmi ses rangs. On y dénote le virus de l'hépatite C, le virus de la dengue et le virus du Nil occidental pour ne nommer que ceux-là. Ces virus ont aussi un autre point en commun, le manque criant d'une thérapie efficace pour traiter les patients atteints. La protéine NS3 et plus particulièrement son activité hélicase est une cible potentielle envisageable pour le traitement de ces virus étant donné l'aspect essentiel de cette activité dans le cycle de réplication de ceux-ci. L'étude présentée dans ce mémoire a pour dessein d'étudier le site d'hydrolyse de l'ATP de la protéine NS3 du virus du Nil occidental. Le but final est de découvrir les déterminants moléculaires qui mènent à la sélection du substrat à hydrolyser, tant au niveau du substrat qu'au niveau de la protéine. Du côté du substrat, une panoplie d'analogues de purines fut testée pour déterminer la capacité de ces molécules à compétitionner pour le site actif de la protéine ainsi que pour la faculté de la protéine à hydrolyser ces substrats. Du côté de la protéine, une gamme de mutants de NS3 fut exprimée et l'habileté de ces mutants à discriminer entre les différents substrats qui lui étaient présentés a été mesurée. Les acides aminés qui ont été sélectionnés pour être mutés l'ont été soit pour leur ressemblance à un motif de reconnaissance de l'ATP chez d'autres hélicases, soit pour leur proximité du substrat, déterminée grâce à un modèle de la protéine bâti sur la structure cristallisée de la protéine NS3 du virus de la dengue. L'ensemble des résultats obtenus a permis de dresser le portrait des atomes de l'ATP qui sont liés par la protéine en plus de mettre à jour plusieurs acides aminés qui sont impliqués directement ou indirectement dans la sélection du substrat par NS3. Il semble en effet que la présence d'un groupement donneur de liaison hydrogène soit nécessaire à la position six d'une purine pour permettre un bon niveau d'hydrolyse de la molécule, permettant ainsi à la protéine de faire la distinction entre l'ATP et le GTP. Aussi, l'apport insoupçonné dans le processus d'hydrolyse d'acides aminés tels que Arg202, Ans417 ou encore Arg185 a été démontré. Finalement, différentes expériences permettant d'élargir les connaissances sur la protéine NS3 ainsi que sur les hélicases en général sont proposées. Des recherches visant à déterminer les ressemblances et les différences au niveau de la discrimination entre sources d'énergie à utiliser entre les diverses protéines NS3 des Flaviviridae vont permettre d'amener à un autre niveau la compréhension du mécanisme d'hydrolyse de cette protéine. Des études s'appliquant à modifier différents acides aminés afin de façonner la protéine NS3 pour qu'elle hydrolyse des analogues particuliers ou qu'elle lie des acides nucléiques précis pourraient aussi permettre de mieux comprendre les bases de la reconnaissance des substrats de NS3 en plus de fournir éventuellement des outils moléculaires voués à des fonctions multiples.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La première partie de la thèse traite de la recherche de biomarqueurs du cancer. Lors de la transcription, il apparaît que certains nucléotides peuvent être remplacés par un autre nucléotide. On s'intéresse alors à la comparaison des probabilités de survenue de ces infidélités de transcription dans des ARNm cancéreux et dans des ARNm sains. Pour cela, une procédure de tests multiples menée sur les positions des séquences de référence de 17 gènes est réalisée via les EST (Expressed Sequence Tag). On constate alors que ces erreurs de transcription sont majoritairement plus fréquentes dans les tissus cancéreux que dans les tissus sains. Ce phénomène conduirait ainsi à la production de protéines dites aberrantes, dont la mesure permettrait par la suite de détecter les patients atteints de formes précoces de cancer. La deuxième partie de la thèse s'attache à l'étude de l'allergie à l'arachide. Afin de diagnostiquer l'allergie à l'arachide et de mesurer la sévérité des symptômes, un TPO (Test de Provocation Orale) est réalisé en clinique. Le protocole consiste à faire ingérer des doses croissantes d'arachide au patient jusqu'à l'apparition de symptômes objectifs. Le TPO pouvant se révéler dangereux pour le patient, des analyses discriminantes de l'allergie à l'arachide, du score du TPO, du score du premier accident et de la dose réactogène sont menées à partir d'un échantillon de 243 patients, recrutés dans deux centres différents, et sur lesquels sont mesurés 6 dosages immunologiques et 30 tests cutanés. Les facteurs issus d'une Analyse Factorielle Multiple sont également utilisés comme prédicteurs. De plus, un algorithme regroupant simultanément en classes des intervalles comprenant les doses réactogènes et sélectionnant des variables explicatives est proposé, afin de mettre ensuite en compétition des règles de classement. La principale conclusion de cette étude est que les mesures de certains anticorps peuvent apporter de l'information sur l'allergie à l'arachide et sa sévérité, en particulier ceux dirigés contre rAra-h1, rAra-h2 et rAra-h3. / The first part of this doctoral dissertation deals with the research of cancer biomarkers. During transcription it was observed that some nucleotides are replaced mistakenly by others. We sought to compare the probabilities of these transcription infidelities in mRNA originating from normal and cancerous tissues. To do this, a multiple testing procedure was performed on the positions of 17 genes by considering their ESTs (Expressed Sequence Tag). The conclusion was reached that the proportions of these transcription errors are mainly increased in cancer tissues as compared to normal ones. This phenomenon would lead to the translation of aberrant proteins, whose detection could help in identifying patients with cancer. The main goals of the second part are the diagnosis of peanut allergy and the prediction of its severity. Diagnosing peanut allergy and evaluating the intensity of the symptoms are currently accomplished with a double blind placebo controlled food challenge (DBPCFC). Patients are given increasing peanut doses until the first clinical reaction appears. Since DBPCFC can result in life-threatening responses, we propose an alternate procedure with the long term goal of replacing invasive allergy tests. Discriminant analyses of peanut allergy, DBPCFC score, the eliciting dose and the first accidental exposure score were performed in 243 allergic patients using 6 immunoassays and 30 skin prick tests. A Multiple Factorial Analysis was performed to use new factors as predictors. We also developed an algorithm for simultaneously clustering eliciting dose values and selecting discriminant variables. Our main conclusion is that antibody measurements provide information on the allergy and its severity, especially those directed against the peanut allergens rAra-h1, rAra-h2 and rAra-h3.