Les hélicases sont des enzymes extrêmement répandues qui sont essentielles pour mener à bien l'ensemble des processus cellulaires impliquant des acides nucléiques. Ces protéines parviennent à annihiler les structures secondaires et tertiaires qui peuvent se former dans l'ADN ou l'ARN grâce à l'énergie puisée par l'hydrolyse de l'ATP. Les hélicases ne sont toutefois pas l'exclusivité des organismes eucaryotes et procaryotes, mais bon nombre de virus codent aussi pour des enzymes possédant cette fonction. La famille des Flaviviridae ne fait pas exception à ce groupe puisque l'ensemble des virus de cette famille code pour une hélicase nommée NS3. La famille des Flaviviridae est une famille virale d'une importance monumentale étant donné la présence de nombreux pathogènes humains parmi ses rangs. On y dénote le virus de l'hépatite C, le virus de la dengue et le virus du Nil occidental pour ne nommer que ceux-là. Ces virus ont aussi un autre point en commun, le manque criant d'une thérapie efficace pour traiter les patients atteints. La protéine NS3 et plus particulièrement son activité hélicase est une cible potentielle envisageable pour le traitement de ces virus étant donné l'aspect essentiel de cette activité dans le cycle de réplication de ceux-ci. L'étude présentée dans ce mémoire a pour dessein d'étudier le site d'hydrolyse de l'ATP de la protéine NS3 du virus du Nil occidental. Le but final est de découvrir les déterminants moléculaires qui mènent à la sélection du substrat à hydrolyser, tant au niveau du substrat qu'au niveau de la protéine. Du côté du substrat, une panoplie d'analogues de purines fut testée pour déterminer la capacité de ces molécules à compétitionner pour le site actif de la protéine ainsi que pour la faculté de la protéine à hydrolyser ces substrats. Du côté de la protéine, une gamme de mutants de NS3 fut exprimée et l'habileté de ces mutants à discriminer entre les différents substrats qui lui étaient présentés a été mesurée. Les acides aminés qui ont été sélectionnés pour être mutés l'ont été soit pour leur ressemblance à un motif de reconnaissance de l'ATP chez d'autres hélicases, soit pour leur proximité du substrat, déterminée grâce à un modèle de la protéine bâti sur la structure cristallisée de la protéine NS3 du virus de la dengue. L'ensemble des résultats obtenus a permis de dresser le portrait des atomes de l'ATP qui sont liés par la protéine en plus de mettre à jour plusieurs acides aminés qui sont impliqués directement ou indirectement dans la sélection du substrat par NS3. Il semble en effet que la présence d'un groupement donneur de liaison hydrogène soit nécessaire à la position six d'une purine pour permettre un bon niveau d'hydrolyse de la molécule, permettant ainsi à la protéine de faire la distinction entre l'ATP et le GTP. Aussi, l'apport insoupçonné dans le processus d'hydrolyse d'acides aminés tels que Arg202, Ans417 ou encore Arg185 a été démontré. Finalement, différentes expériences permettant d'élargir les connaissances sur la protéine NS3 ainsi que sur les hélicases en général sont proposées. Des recherches visant à déterminer les ressemblances et les différences au niveau de la discrimination entre sources d'énergie à utiliser entre les diverses protéines NS3 des Flaviviridae vont permettre d'amener à un autre niveau la compréhension du mécanisme d'hydrolyse de cette protéine. Des études s'appliquant à modifier différents acides aminés afin de façonner la protéine NS3 pour qu'elle hydrolyse des analogues particuliers ou qu'elle lie des acides nucléiques précis pourraient aussi permettre de mieux comprendre les bases de la reconnaissance des substrats de NS3 en plus de fournir éventuellement des outils moléculaires voués à des fonctions multiples.

La poly(A) polymérase (PAP) est une enzyme essentielle pour le métabolisme de la cellule qui catalyse l'ajout d'une longue séquence de polyadénosines à l'extrémité 3' des ARNm. Cet ajout, effectué par un large complexe multi-protéique de clivage et de polyadénylation est nécessaire pour la stabilité, le transport et la traduction des ARNm. L'ATP est la molécule qui sert de source d'énergie à la PAP et représente aussi son unique substrat pour la réaction de polyadénylation. La PAP est une enzyme hautement conservée de la levure à l'humain et est même encodée dans le génome de certains virus. En effet, elle est aussi retrouvée chez les eucaryotes inférieurs, comme les levures, et même certains virus à ADN encodent une enzyme jouant le même rôle. Le champignon Candida albicans , source d'infections sévères surtout chez les patients immunodéprimés, encode sa propre PAP. L'étude de cet organisme tantôt levure unicellulaire, tantôt champignon mycellaire demeure essentielle en raison de la perte d'efficacité des antibiotiques actuellement disponibles découlant de l'émergence de souches multi-résistantes. La PAP représente une nouvelle cible thérapeutique fort intéressante due à son implication directe dans les étapes de maturation des ARNm, processus essentiel à tout organisme eucaryote. L'étude présentée dans ce mémoire se concentre sur l'étude du site actif de la PAP de C. albicans , plus précisément au niveau des interactions moléculaires associées à la sélection du substrat par l'enzyme. Le but final est de déterminer les groupements fonctionnels favorisant la reconnaissance de l'ATP au niveau du substrat nucléotidique, mais aussi de déterminer les acides aminés de la protéine qui sont potentiellement impliqués dans cette sélection moléculaire. Pour ce faire, une gamme d'analogues de nucléotides, principalement de purines, a été testée pour évaluer la capacité de ceux-ci à compétitionner avec le substrat pour le site actif de l'enzyme. Du côté de la protéine, plusieurs mutants ponctuels ont été produits afin d'évaluer la discrimination de ces mutants envers les différents nucléotides et/ou analogues de nucléotides. La sélection des acides aminés mutés s'est basée sur le modèle bioinformatique de la PAP de C. albicans généré à partir de la radiocristallographie de la PAP d'un autre organisme eucaryote effectué en présence d'ATP et d'ARN, Saccharomyces cerevisiae . Les résultats ont en effet démontré que la présence d'un groupement donneur de pont hydrogène en position 6 d'une purine permet sa liaison au site actif de l'enzyme et son transfert subséquent sur le brin d'ARN. En effet, ceci explique en grande partie la discrimination entre l'ATP et le GTP par la protéine. Aussi, l'apport de certains acides aminés tels Asn-222, Met-306 et Cys-307 dans ce mécanisme de distinction des nucléotides a été démontré. De manière insoupçonnée, certains analogues se sont avérés de bons substrats pour la PAP malgré leur modification chimique, donnant lieu à une queue poly(A) modifiée chimiquement. L'impact de cette modification sur la stabilité et l'efficacité de traduction d'ARNm portant divers types de modification sur la queue poly(A) a donc été évalué en cellules. Il s'avère que la stabilité semble négativement affectée de manière générale alors que l'efficacité de traduction s'est vu être dépendante du type de modification chimique.