L’UGT1A6 humaine appartient à la famille multigénique des UDP-glucuronosyltransférases (UGTs) qui sont responsables de la biotransformation des xénobiotiques et des substances endogènes. Cette isoforme joue un rôle important en pharmaco-toxicologie car elle est impliquée dans la métabolisation de médicaments et de substances phénoliques polycycliques. L’UGT1A6 catalyse le transfert de l’acide glucuronique, à partir du substrat donneur l’acide UDP-a-D-glucuronique, sur des phénols accepteurs hydrophobes. Le mécanisme réactionnel postulé est de type SN2 et fait appel à une base catalytique capable d’activer l’accepteur par déprotonation. Il s’ensuit une attaque nucléophile sur le carbone 1 de l’acide glucuronique et conduit à la formation d’un ß-D-glucuronide hydrosoluble avec inversion de configuration et libération d’UDP facilitée par la présence d’un cation magnésium. Le but de notre travail est d’identifier les acides aminés qui sont impliqués dans la catalyse enzymatique et dans la reconnaissance des substrats. Nous avons cherché dans un premier temps la base catalytique. Le rôle des 15 acides aminés aspartique / glutamique hautement conservés de toute la séquence codante de l’UGT1A6 humaine a été évalué par mutagenèse dirigée systématique, modification chimique et modélisation par homologie avec les glycosyltransférases dont la structure 3-D est résolue. Nous avons montré que, sauf pour les résidus aspartique Asp150 et Asp488, la substitution des résidus carboxyliques par alanine a conduit à des mutants actifs mais présentant une diminution de l’activité enzymatique et une baisse d’affinité pour le substrat accepteur et / ou le substrat donneur. En outre, la comparaison de séquences des UGTs et l’homologie avec les glycosyltransférases suggèrent que l’Asp150 joue un rôle de base catalytique. Dans un second temps, nous avons identifié l’acide aminé (His38) de l’UGT1A6 comme résidu pivot dans la reconnaissance des substrats accepteurs. L’étude a tiré profit de l’existence de 2 isoformes présentant 93% d’homologie et des spécificités de substrats très différentes : l’UGT1A4 qui métabolise que des amines et l’UGT1A3 qui métabolise les phénols, acides carboxyliques mais pas les amines. La comparaison de séquences de la famille UGT1A fait apparaître un résidu histidine très conservé dans toute les isoformes, sauf dans l’UGT1A4 ou il est remplacé par une proline. La substitution de Pro40 de l’UGT1A4 par His élargit l’activité enzymatique aux composés phénoliques et carboxyliques (spécificité de type UGT1A3). Inversement, lorsque le résidu His40 de l’UGT1A3 est remplacé par la proline, cette isoforme conjugue les amines et pas les phénols et acides carboxyliques, comme l’UGT1A4. Cette étude constitue une avancée importante sur la compréhension des mécanismes moléculaires de la glucuronoconjugaison des xénobiotiques et des médicaments. Enfin, dans une dernière partie nous avons entrepris une étude visant à établir la panoplie des UGTs présentes dans les cellules chondrocytaires articulaires chez l’homme qui sont la cible de médicaments de type anti-inflammatoires non stéroïdiens carboxyliques et d’estrogènes connus pour affecter l’homéostasie du cartilage. Les résultats montrent que plusieurs isoformes sont présentes à l’état de transcrits, à des niveaux très faibles, ne permettant pas pour l’instant de les caractériser par immunodosage ou par mesure de l’activité enzymatique. / The human UDP-glucuronosyltransferase UGT1A6 is the primary phenol-metabolizing UGT isoform. It catalyzes the nucleophilic attack of phenolic xenobiotics on UDP-glucuronic acid, leading to the formation of water-soluble glucuronides. The catalytic mechanism proposed for this reaction is an acid-base mechanism that involves an aspartic/glutamic acid and/or histidine residue. Here, we investigated the role of fifteen highly conserved aspartic/glutamic acid residues over the entire sequence of human UGT1A6 by site-directed mutagenesis. We showed that, except for aspartic residues D150 and D488, the substitution of carboxylic residues by alanine led to active mutants but with decreased enzyme activity and lower affinity for acceptor and/or donor substrate. Further analysis including mutation of the corresponding residue in other UGT1A isoforms suggests that D150 play a major catalytic role. In this report, we also identified a single active site residue important for glucuronidation of phenols and carboxylic acid substrates by UGT1A enzyme family. Replacing P40 of UGT1A4 by histidine expanded the glucuronidation activity of the enzyme to phenolic and carboxylic compounds, therefore leading to UGT1A3-type isoform in terms of substrate specificity. Conversely, when H40 residue of UGT1A3 was replaced with proline, the substrate specificity shifted toward that of UGT1A4 with loss of glucuronidation of phenolic substrates. Furthermore, mutation of H39 residue of UGT1A1 (H40 in UGT1A4) to proline led to loss of glucuronidation of phenols but not of estrogens. This study provides a step forward to better understand the glucuronidation mechanism and substrates recognition, which is invaluable for a better prediction of drug metabolism and toxicity in human. In the last part of the work, we determined the UGT isoforms that are expressed in human articular chondrocytes, and which are involved in the glucuronidation of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and estrogens known to affect cartilage homeostasy. The results showed that several isoforms were indeed expressed as a transcript, but at a very low level, making the characterisation of the enzyme via their activity or immunodosage unsuccessful.

Les caspases forment une famille de protéases à cystéine impliquées dans divers processus comme Fapoptose et l’inflammation. Durant l'apoptose, une forme de mort cellulaire programmée, les caspases initiatrices (caspases 8, 9 et 10) activent par protéolyse les caspases exécutrices 3 et 7. Ces dernières cliveront par la suite divers substrats cellulaires pour ainsi mener au démantèlement contrôlé de la cellule qui est propre à l'apoptose. Durant mon doctorat, je me suis intéressé à l’implication de la caspase 7 durant l'apoptose, autant la façon dont elle est activée que la manière dont elle reconnait ses substrats. D’abord, j'ai voulu étudier l'implication des sites de clivage du connecteur interdomaine (CID) de la caspase 7 dans son activation par les caspases initiatrices et les déterminants primaires sous-jacents impliqués dans cette activation. Cette étude a révélé l'importance de la localisation du site de clivage dans le CID de la caspase 7 pour une activation adéquate par les caspases initiatrices. La mutagénèse de ces sites nous a permis de constater que la séquence des sites chez la caspase 7 était presque optimale pour son activation par les caspases 8 et 9 et qu’il contient des déterminants importants pour l'activité enzymatique de la caspase 7. Mes travaux soulignent également l’importance de la longueur du CID pour l’activité pré-clivage de la caspase 8, mais pas de la caspase 7. En somme, ces travaux ont permis d’éclaircir l’importance des sites de clivage de caspase 7 pour sa reconnaissance par les caspases initiatrices et pour son activité catalytique. Ces travaux ont fait l'objet du premier article de cette thèse. Puis, je me suis intéressé à la reconnaissance de certains substrats de la caspase 7 par des sites de reconnaissance situés à l'extérieur de la pochette de liaison du substrat, les exosites. J'ai identifié un exosite situé dans le domaine N-terminal de la caspase 7 qui est principalement contenu dans une séquence polybasique de quatre résidus lysine (K38-41). Cet exosite améliore le clivage des protéines poly(ADP ribose) polymérase 1 (PARP-1) et p23 sans toutefois changer l’activité catalytique basale de la caspase 7. Il est transférable sur la caspase 3 et est capable de lier PARP-1 seul. Cet exosite est également utilisé lors de l'apoptose pour favoriser le clivage de certains substrats par la caspase 7. L’existence de ce site explique les différentes activités catalytiques des caspases 7 et 3 sur des substrats apoptotiques précis. En somme, ces travaux constituent la première démonstration de l'existence d'exosites chez les caspases. Mes travaux ont donc permis de mieux comprendre la caspase 7, autant les mécanismes de son activation que ceux qu’elle utilise pour choisir ces substrats apoptotiques.

Les hélicases sont des enzymes extrêmement répandues qui sont essentielles pour mener à bien l'ensemble des processus cellulaires impliquant des acides nucléiques. Ces protéines parviennent à annihiler les structures secondaires et tertiaires qui peuvent se former dans l'ADN ou l'ARN grâce à l'énergie puisée par l'hydrolyse de l'ATP. Les hélicases ne sont toutefois pas l'exclusivité des organismes eucaryotes et procaryotes, mais bon nombre de virus codent aussi pour des enzymes possédant cette fonction. La famille des Flaviviridae ne fait pas exception à ce groupe puisque l'ensemble des virus de cette famille code pour une hélicase nommée NS3. La famille des Flaviviridae est une famille virale d'une importance monumentale étant donné la présence de nombreux pathogènes humains parmi ses rangs. On y dénote le virus de l'hépatite C, le virus de la dengue et le virus du Nil occidental pour ne nommer que ceux-là. Ces virus ont aussi un autre point en commun, le manque criant d'une thérapie efficace pour traiter les patients atteints. La protéine NS3 et plus particulièrement son activité hélicase est une cible potentielle envisageable pour le traitement de ces virus étant donné l'aspect essentiel de cette activité dans le cycle de réplication de ceux-ci. L'étude présentée dans ce mémoire a pour dessein d'étudier le site d'hydrolyse de l'ATP de la protéine NS3 du virus du Nil occidental. Le but final est de découvrir les déterminants moléculaires qui mènent à la sélection du substrat à hydrolyser, tant au niveau du substrat qu'au niveau de la protéine. Du côté du substrat, une panoplie d'analogues de purines fut testée pour déterminer la capacité de ces molécules à compétitionner pour le site actif de la protéine ainsi que pour la faculté de la protéine à hydrolyser ces substrats. Du côté de la protéine, une gamme de mutants de NS3 fut exprimée et l'habileté de ces mutants à discriminer entre les différents substrats qui lui étaient présentés a été mesurée. Les acides aminés qui ont été sélectionnés pour être mutés l'ont été soit pour leur ressemblance à un motif de reconnaissance de l'ATP chez d'autres hélicases, soit pour leur proximité du substrat, déterminée grâce à un modèle de la protéine bâti sur la structure cristallisée de la protéine NS3 du virus de la dengue. L'ensemble des résultats obtenus a permis de dresser le portrait des atomes de l'ATP qui sont liés par la protéine en plus de mettre à jour plusieurs acides aminés qui sont impliqués directement ou indirectement dans la sélection du substrat par NS3. Il semble en effet que la présence d'un groupement donneur de liaison hydrogène soit nécessaire à la position six d'une purine pour permettre un bon niveau d'hydrolyse de la molécule, permettant ainsi à la protéine de faire la distinction entre l'ATP et le GTP. Aussi, l'apport insoupçonné dans le processus d'hydrolyse d'acides aminés tels que Arg202, Ans417 ou encore Arg185 a été démontré. Finalement, différentes expériences permettant d'élargir les connaissances sur la protéine NS3 ainsi que sur les hélicases en général sont proposées. Des recherches visant à déterminer les ressemblances et les différences au niveau de la discrimination entre sources d'énergie à utiliser entre les diverses protéines NS3 des Flaviviridae vont permettre d'amener à un autre niveau la compréhension du mécanisme d'hydrolyse de cette protéine. Des études s'appliquant à modifier différents acides aminés afin de façonner la protéine NS3 pour qu'elle hydrolyse des analogues particuliers ou qu'elle lie des acides nucléiques précis pourraient aussi permettre de mieux comprendre les bases de la reconnaissance des substrats de NS3 en plus de fournir éventuellement des outils moléculaires voués à des fonctions multiples.

La poly(A) polymérase (PAP) est une enzyme essentielle pour le métabolisme de la cellule qui catalyse l'ajout d'une longue séquence de polyadénosines à l'extrémité 3' des ARNm. Cet ajout, effectué par un large complexe multi-protéique de clivage et de polyadénylation est nécessaire pour la stabilité, le transport et la traduction des ARNm. L'ATP est la molécule qui sert de source d'énergie à la PAP et représente aussi son unique substrat pour la réaction de polyadénylation. La PAP est une enzyme hautement conservée de la levure à l'humain et est même encodée dans le génome de certains virus. En effet, elle est aussi retrouvée chez les eucaryotes inférieurs, comme les levures, et même certains virus à ADN encodent une enzyme jouant le même rôle. Le champignon Candida albicans , source d'infections sévères surtout chez les patients immunodéprimés, encode sa propre PAP. L'étude de cet organisme tantôt levure unicellulaire, tantôt champignon mycellaire demeure essentielle en raison de la perte d'efficacité des antibiotiques actuellement disponibles découlant de l'émergence de souches multi-résistantes. La PAP représente une nouvelle cible thérapeutique fort intéressante due à son implication directe dans les étapes de maturation des ARNm, processus essentiel à tout organisme eucaryote. L'étude présentée dans ce mémoire se concentre sur l'étude du site actif de la PAP de C. albicans , plus précisément au niveau des interactions moléculaires associées à la sélection du substrat par l'enzyme. Le but final est de déterminer les groupements fonctionnels favorisant la reconnaissance de l'ATP au niveau du substrat nucléotidique, mais aussi de déterminer les acides aminés de la protéine qui sont potentiellement impliqués dans cette sélection moléculaire. Pour ce faire, une gamme d'analogues de nucléotides, principalement de purines, a été testée pour évaluer la capacité de ceux-ci à compétitionner avec le substrat pour le site actif de l'enzyme. Du côté de la protéine, plusieurs mutants ponctuels ont été produits afin d'évaluer la discrimination de ces mutants envers les différents nucléotides et/ou analogues de nucléotides. La sélection des acides aminés mutés s'est basée sur le modèle bioinformatique de la PAP de C. albicans généré à partir de la radiocristallographie de la PAP d'un autre organisme eucaryote effectué en présence d'ATP et d'ARN, Saccharomyces cerevisiae . Les résultats ont en effet démontré que la présence d'un groupement donneur de pont hydrogène en position 6 d'une purine permet sa liaison au site actif de l'enzyme et son transfert subséquent sur le brin d'ARN. En effet, ceci explique en grande partie la discrimination entre l'ATP et le GTP par la protéine. Aussi, l'apport de certains acides aminés tels Asn-222, Met-306 et Cys-307 dans ce mécanisme de distinction des nucléotides a été démontré. De manière insoupçonnée, certains analogues se sont avérés de bons substrats pour la PAP malgré leur modification chimique, donnant lieu à une queue poly(A) modifiée chimiquement. L'impact de cette modification sur la stabilité et l'efficacité de traduction d'ARNm portant divers types de modification sur la queue poly(A) a donc été évalué en cellules. Il s'avère que la stabilité semble négativement affectée de manière générale alors que l'efficacité de traduction s'est vu être dépendante du type de modification chimique.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le contrôle de la glycosylation des protéines recombinantes présente un enjeu considérable dans le développement de la production de protéines d'intérêt thérapeutique dans des systèmes d'expression hétérologues. La glycosylation joue en effet un rôle essentiel dans leurs propriétés, notamment pharmacocinétiques. Le remodelage de la N-glycosylation des protéines recombinantes a été envisagé via l'utilisation de la glycosynthase Cel7B E197A d'Humicola insolens. Cette enzyme doit tout d'abord être modifiée afin de pouvoir fixer un groupement N-acétylglucosaminyle dans le sous-site accepteur +1. Des études de modélisation moléculaire ont mis en évidence deux acides aminés qui pourraient empêcher le positionnement d'une unité glucosidique substituée en position 2. Différents mutants ont été préparés par mutagénèse dirigée afin d'étudier leur spécificité de substrat. Leurs activités glycosynthases ont été caractérisées, montrant l'influence des mutations introduites. Même si la spécificité de substrat désirée n'a pu être obtenue, une modification de la régiosélectivité de la glycosynthase a été mise en évidence vis-à-vis d'un substrat substitué en position 2 par un groupement de type azido.