Les Récepteurs aux Rétinoïdes sont impliqués dans le développement et dans l’homéostasie cellulaire. Des altérations de leurs expressions ont été observées dans les cancers bronchiques. Cependant, les essais de chimioprévention utilisant les rétinoïdes dans des populations à risques ont échoué. Par conséquent, avant de procéder à de nouveaux essais cliniques utilisant des rétinoïdes de seconde génération, il apparaît nécessaire de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la signalisation des rétinoïdes. Tel est ici notre objectif en présentant la validation d’outils de recherches destinés à l’étude de ces récepteurs, et en particulier à celle du Récepteur à l’Acide Rétinoïque ß, dont le rôle majeur dans le cancer du poumon est documenté. Des outils bioinformatiques ont été utilisés afin de reconstituer in silico l’organisation génomique de RARß. Les caractéristiques d’un promoteur potentiel P1’-RARß ont été étudiées expérimentalement. Des mesures spécifiques, réalisées dans des essais de qRT-PCR Syber Green et avec un triplex de sondes Taqman, ont été validées extensivement afin d’établir des valeurs de référence de l’expression ARNm des Récepteurs aux Rétinoïdes dans les cellules épithéliales bronchiques humaines normales. Les expressions relatives des différentes isoformes ARNm RRs ont ensuite été quantifiées dans des échantillons de tumeurs bronchiques ainsi que dans plusieurs lignées de cellules cancéreuses. Enfin, un anticorps reconnaissant toutes les isoformes protéiques RARß, a été conçu et validé extensivement par western-blot et immunoprécipitation. Aucune activité promotrice n’a pu être démontrée pour P1’-RARß. Une augmentation des quantités d’ARNm P2-RARß signe la différenciation normale de l’épithélium bronchique, alors qu’une diminution significative de ces ARNm est observée dans la plupart des lignées de cellules cancéreuses bronchiques. Une sous-régulation concomitante de RARß et RXRß a également été mise en évidence dans les tumeurs bronchiques. En utilisant des extraits nucléaires de cellules BEAS-2B et de cellules bronchiques normales, seule l’isoforme protéique longue RARß2 a été reconnue par notre anticorps. Un traitement rigoureux des échantillons ainsi qu’une analyse bioinformatique exhaustive sont les points clés de cette étude. Des valeurs ARNm de référence ainsi que des outils validés sont maintenant disponibles pour faire progresser la recherche sur le signal rétinoïde dans les cellules bronchiques. / Retinoid Receptors are involved in development and cell homeostasis. Alterations of their expressions have been observed in lung cancer. However, retinoid chemoprevention trials in populations at risk to develop such tumours have failed. Therefore, the pertinence of new clinical trials using second generation retinoids requires prior better understanding of the molecular mechanisms involved in the retinoid signalling. This is our aim when validating extensively research tools, focused on the Retinoic Acid Receptor ß, whose major role in lung cancer is documented. Biocomputing was used to draw in silico an updated RARß genomic organisation. Features of a putative P1'-RARß promoter were investigated experimentally. Specific measures realised, with qRT-PCR Syber Green assays and a triplex of Taqman probes, were extensively validated to establish Retinoid Receptors mRNAs reference values for normal human bronchial epithelial cells. Relative expressions of the different RRs mRNA isoforms were further quantified in lung tumour samples and in several cancer cell lines. Finally, an antibody recognising all the RARß protein isoforms, was generated and extensively validated by western-blot and immunoprecipitation. No promoter-like activity was found for P1'-RARß. P2-RARß mRNA increase signs the normal differentiation of the human bronchial epithelium while a significant decrease is observed in most lung cancer cell lines. Accordingly, it is also, along with RXRß, down-regulated in lung tumours. When using nuclear extracts of BEAS-2B and normal lung cells, only the P2-long RARß2 protein isoform was recognised by our antibody. Rigorous samples processing and extensive biocomputing, were the key factors for this study. mRNA reference values and validated tools are now available to advance researches on retinoid signalling in the lung.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La vitamine A et ses dérivés actifs (les rétinoïdes) sont des molécules essentielles à la vie et ce dès la période embryonnaire. Molécules de choix dans de nombreuses applications thérapeutiques, notamment dans les domaines de la dermatologie et de l’ophtalmologie, elles sont le plus couramment utilisées pour leurs propriétés pro-cicatrisantes. Malgré cette utilisation courante en clinique, les mécanismes cellulaires et moléculaires permettant aux rétinoïdes de promouvoir un processus de cicatrisation restent encore mal connus. Afin de mieux appréhender ces mécanismes, mais aussi afin d’élargir leur utilisation clinique à la rupture prématurée des membranes (RPM), je me suis intéressée aux propriétés pro-cicatrisantes de l’atRA (l’un des dérivés actifs de la vitamine A) sur les membranes fœtales. Alors que l’amnios et le chorion sont physiologiquement incapables d’initier un processus de cicatrisation suite à une lésion, nos résultats démontrent un effet positif de l’atRA sur la migration des cellules épithéliales amniotiques (amniocytes primaires), conduisant ainsi à une potentialisation de la cicatrisation de plus de 80% in vitro. Ce travail, complété par une analyse transcriptomique réalisée sur des membranes fœtales et des amniocytes primaires traités ou non à l’atRA, a permis d’identifier de nombreux gènes régulés par l’atRA au sein de l’amnios et des amniocytes. Parmi ces gènes, je me suis intéressée à un membre de la famille des lysyl oxydases, LOXL4, qui joue un rôle clé dans la dynamique de la matrice extracellulaire en régulant la réticulation du collagène. Une étude de régulation transcriptionnelle associée à de la promotologie ont tout d’abord permis de montrer que l’atRA induisait l’expression du gène LOXL4 de manière directe. Puis, l’inhibition de la protéine LOXL4 lors de tests de blessure (par le β-aminopropionitrile et par un siARN spécifique) nous a permis de démontrer que l’effet pro-cicatrisant de l’atRA était médié, au moins en partie, par la rétino-induction deLOXL4. Ces nouveaux éléments apportés par ce travail dans la compréhension des mécanismes moléculaires utilisés par l’atRA afin de promouvoir la cicatrisation permettent d’envisager son utilisation future dans la prise en charge clinique des ruptures prématurées. / Vitamin A and its active derivates (retinoids) are essential molecules for life from the embryonic development to the adulthood. Because of these numerous functions and especially because of their pro-healing properties, they are commonly used in clinic in dermatology and ophthalmology in particular. Despite this routine clinical use, the molecular and cellular mechanisms used by retinoids to promote a healing process remain unclear. To better understand these mechanisms, but also to expand its clinical use to the premature rupture of fetal membranes (PROM), we looked to pro-healing properties of atRA (active derivative of vitamin A) on the human fetal membranes. While amnion and chorion are unable to initiate a physiological process of healing after injury, our results demonstrate a positive effect of atRA on the migration of primary amniocytes, leading to an healing improvement of up to 80% in vitro. This work, completed by a transcriptomic analysis performed on fetal membranes and primary amniocytes treated or not with atRA, allowed the identification of many genes regulated by atRA within the amnion and the amniocytes. Among these genes, we looked to a member of the lysyl oxidase family, LOXL4, which plays a key role in the dynamic of the extracellular matrix by regulating collagen crosslinking. First, transcription and promotology experiments have shown that atRA strongly induced the expression of LOXL4 in a direct manner. Then, the inhibition of the LOXL4 protein in scratch assay experiments (using β-aminopropionitrile or a specific siRNA) allowed us to demonstrate that the pro-healing effect of atRA was mediated, at least in part, by the retinoid-induction of this gene. Besides providing new elements to understand how atRA exerts their pro-healing properties, this work proposes atRA as a promising candidate to improve the clinical management of premature rupture of the fetal membranes by promoting re-epithelialization of the amnion.

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Chez les vertébrés, la perception de la lumière est possible grâce à la transformation de l'énergie des photons en un signal électrochimique dans les photorécepteurs. La photo-isomérisation du chromophore RAL-11-cis en RAL-tout-trans déclenche une cascade d'événements de transduction du signal et conduit à la perte de la sensibilité à la lumière des photorécepteurs, un processus de recyclage du chromophore visuel entre alors en jeu afin de rétablir cette sensibilité, c'est le cycle visuel de rétinoïdes. Le cycle visuel s'effectue dans les photorécepteurs et l'épithélium pigmentaire rétinien et fait intervenir plusieurs protéines. L'étape limitante de ce cycle est catalysée par la protéine spécifique de l'EPR RPE65. Mieux comprendre la régulation de cette étape permettra d'ouvrir des pistes thérapeutiques pour différentes pathologies liées l'activité du cycle visuel. Notre laboratoire a montré que FATP1, une protéine du métabolisme lipidique, inhibe l'activité de RPE65 in vitro. Dans ce travail, nous avons évalué l'effet de l'absence de FATP1 sur l'activité du cycle visuel et la fonction visuelle dans un modèle murin. La souris ko FATP1 est caractérisée par une baisse des amplitudes des ondes a et b de l'ERG, un retard de régénérescence de l'ERG et d'accumulation de rétinylesters après éblouissement. La formation du RAL-11-cis reste comparable à celle des souris sauvages. Les souris FATP-/- montrent une plus grande susceptibilité aux effets du vieillissement : des anomalies de structure ont été observées au niveau des photorécepteurs, de la membrane de Brüch et de la choroïde, sans accumulation excessive de lipides ou de lipofuscine ni de dégénérescence rétinienne. La perturbation de la fonction visuelle observé en l'absence de FATP1 chez la souris pourrait avoir un effet plus accru chez l'homme qui vie plus longtemps et dont la rétine reçoit plus de lumière. En conclusion, FATP1 pourrait être une composante importante pour le vieillissement de la rétine chez l'homme. / In vertebrates, perception of light is made possible through the conversion of photon energy into an electrochemical signal in photoreceptors. The photo-isomerization of the chromophore 11-cis-RAL into all-trans-RAL triggers a cascade of signal transduction and leads to loss of light sensitivity of photoreceptors, thus, a recycling process of chromophore called the rétinal visual cycle is involved to restore this sensitivity. The visual cycle takes place in the photoreceptors and retinal pigment epithelium and involves several proteins. The limiting step of this cycle is catalyzed by RPE-specific protein RPE65. Better understanding the regulation of this step might open up new ways for treatment of various pathologies related to the visual cycle activity. Our laboratory has shown that FATP1, a protein involved in lipid metabolism, inhibits the activity of RPE65 in vitro. In this study, we evaluated the effect of the lack of FATP1 on the activity of the visual cycle and visual function in a mouse model. FATP1 ko mice are characterized by lower a and b amplitudes of the elctroretinogram, delayed ERG and retinylesters accumulation recovery after bleache. 11-cis-RAL synthesis rates are similar to those of wt mice. FATP1 ko mice show a greater susceptibility to the aging effects: structural abnormalities were observed in the photoreceptors, Bruch's membrane and choroid without excessive accumulation of lipid or lipofuscin or retinal degeneration. The disturbance of visual function which accopagne the lack of FATP1 in mice could have a more increased effect in human who live longer and wich the retina receives more light. In conclusion, FATP1 might be an important component for the aging of the retina in humans.

Les mécanismes de l'emphysème pulmonaire, caractérisé par la destruction des alvéoles pulmonaire, sont incomplètement connus. L'hypothèse défendue par cette thèse est qu'une altération des systèmes d'alvéologénèse et de réparation alvéolaire portés par les fibroblastes pulmonaires contribue au développement des lésions au cours de cette maladie. Les travaux présentés ici ont permis d'établir que les fibroblastes pulmonaires cultivés in vitro à partir de poumon emphysémateux présentaient un phénotype altéré dans le sens d'une perte de leur capacité à participer à la régénération et à la réparation des alvéoles : Ces cellules sécrétaient à un niveau faible ou non stimulable le Hepatocyte Growth Factor et le Keratinocyte Growth Factor (KGF), qui ciblent les cellules épithéliales et endothéliales de l'alvéole. De plus, l'expression par ces cellules de l'élastine, le composant majeur de la matrice extracellulaire pulmonaire, n'était pas induite par l'acide tout-trans rétinoïque, stimulus central de l'alvéologénèse, du fait d'une faible expression de Cellular Retinoic Acid Binding Protein 2 (CRABP2). Le rôle du KGF dans l'homéostasie de l'alvéole a été démontré dans le modèle d'emphysème induit par l'élastase in vivo : Les souris traitées par le KGF avant l'instillation d'élastase étaient protégées de l'emphysème. Les souris dont le gène de CRABP2 était inactivé de façon globale n'étaient pas sensibilisées vis-à-vis de l'emphysème dans ce modèle. Les données physiopathologiques présentées dans ce mémoire pourraient contribuer à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour l'emphysème.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

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