L’UGT1A6 humaine appartient à la famille multigénique des UDP-glucuronosyltransférases (UGTs) qui sont responsables de la biotransformation des xénobiotiques et des substances endogènes. Cette isoforme joue un rôle important en pharmaco-toxicologie car elle est impliquée dans la métabolisation de médicaments et de substances phénoliques polycycliques. L’UGT1A6 catalyse le transfert de l’acide glucuronique, à partir du substrat donneur l’acide UDP-a-D-glucuronique, sur des phénols accepteurs hydrophobes. Le mécanisme réactionnel postulé est de type SN2 et fait appel à une base catalytique capable d’activer l’accepteur par déprotonation. Il s’ensuit une attaque nucléophile sur le carbone 1 de l’acide glucuronique et conduit à la formation d’un ß-D-glucuronide hydrosoluble avec inversion de configuration et libération d’UDP facilitée par la présence d’un cation magnésium. Le but de notre travail est d’identifier les acides aminés qui sont impliqués dans la catalyse enzymatique et dans la reconnaissance des substrats. Nous avons cherché dans un premier temps la base catalytique. Le rôle des 15 acides aminés aspartique / glutamique hautement conservés de toute la séquence codante de l’UGT1A6 humaine a été évalué par mutagenèse dirigée systématique, modification chimique et modélisation par homologie avec les glycosyltransférases dont la structure 3-D est résolue. Nous avons montré que, sauf pour les résidus aspartique Asp150 et Asp488, la substitution des résidus carboxyliques par alanine a conduit à des mutants actifs mais présentant une diminution de l’activité enzymatique et une baisse d’affinité pour le substrat accepteur et / ou le substrat donneur. En outre, la comparaison de séquences des UGTs et l’homologie avec les glycosyltransférases suggèrent que l’Asp150 joue un rôle de base catalytique. Dans un second temps, nous avons identifié l’acide aminé (His38) de l’UGT1A6 comme résidu pivot dans la reconnaissance des substrats accepteurs. L’étude a tiré profit de l’existence de 2 isoformes présentant 93% d’homologie et des spécificités de substrats très différentes : l’UGT1A4 qui métabolise que des amines et l’UGT1A3 qui métabolise les phénols, acides carboxyliques mais pas les amines. La comparaison de séquences de la famille UGT1A fait apparaître un résidu histidine très conservé dans toute les isoformes, sauf dans l’UGT1A4 ou il est remplacé par une proline. La substitution de Pro40 de l’UGT1A4 par His élargit l’activité enzymatique aux composés phénoliques et carboxyliques (spécificité de type UGT1A3). Inversement, lorsque le résidu His40 de l’UGT1A3 est remplacé par la proline, cette isoforme conjugue les amines et pas les phénols et acides carboxyliques, comme l’UGT1A4. Cette étude constitue une avancée importante sur la compréhension des mécanismes moléculaires de la glucuronoconjugaison des xénobiotiques et des médicaments. Enfin, dans une dernière partie nous avons entrepris une étude visant à établir la panoplie des UGTs présentes dans les cellules chondrocytaires articulaires chez l’homme qui sont la cible de médicaments de type anti-inflammatoires non stéroïdiens carboxyliques et d’estrogènes connus pour affecter l’homéostasie du cartilage. Les résultats montrent que plusieurs isoformes sont présentes à l’état de transcrits, à des niveaux très faibles, ne permettant pas pour l’instant de les caractériser par immunodosage ou par mesure de l’activité enzymatique. / The human UDP-glucuronosyltransferase UGT1A6 is the primary phenol-metabolizing UGT isoform. It catalyzes the nucleophilic attack of phenolic xenobiotics on UDP-glucuronic acid, leading to the formation of water-soluble glucuronides. The catalytic mechanism proposed for this reaction is an acid-base mechanism that involves an aspartic/glutamic acid and/or histidine residue. Here, we investigated the role of fifteen highly conserved aspartic/glutamic acid residues over the entire sequence of human UGT1A6 by site-directed mutagenesis. We showed that, except for aspartic residues D150 and D488, the substitution of carboxylic residues by alanine led to active mutants but with decreased enzyme activity and lower affinity for acceptor and/or donor substrate. Further analysis including mutation of the corresponding residue in other UGT1A isoforms suggests that D150 play a major catalytic role. In this report, we also identified a single active site residue important for glucuronidation of phenols and carboxylic acid substrates by UGT1A enzyme family. Replacing P40 of UGT1A4 by histidine expanded the glucuronidation activity of the enzyme to phenolic and carboxylic compounds, therefore leading to UGT1A3-type isoform in terms of substrate specificity. Conversely, when H40 residue of UGT1A3 was replaced with proline, the substrate specificity shifted toward that of UGT1A4 with loss of glucuronidation of phenolic substrates. Furthermore, mutation of H39 residue of UGT1A1 (H40 in UGT1A4) to proline led to loss of glucuronidation of phenols but not of estrogens. This study provides a step forward to better understand the glucuronidation mechanism and substrates recognition, which is invaluable for a better prediction of drug metabolism and toxicity in human. In the last part of the work, we determined the UGT isoforms that are expressed in human articular chondrocytes, and which are involved in the glucuronidation of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and estrogens known to affect cartilage homeostasy. The results showed that several isoforms were indeed expressed as a transcript, but at a very low level, making the characterisation of the enzyme via their activity or immunodosage unsuccessful.

La structure coiffe est une structure protectrice retrouvée à l'extrémité 5' des ARN messagers (ARNm). Elle est requise pour la stabilité, le transport, l'épissage et la traduction des ARNm.La coiffe est synthétisée par trois activités enzymatiques successives : les activités ARN 5'-triphosphatase, ARN guanylyltransférase et ARN (guanine-7) méthyltransférase. Cette structure doit de plus être dégradée par des enzymes spécifiques pour permettre le recyclage des ARNm. Plusieurs protéines virales ont été découvertes possédant l'une ou l'autre de ces diverses activités de synthèse et de dégradation de la structure coiffe. Ces enzymes viraux représentent donc des modèles très intéressants pour étudier ces activités catalytiques, permettant soit de mieux comprendre les mécanismes similaires chez les métazoaires, ou de cibler ces activités chez les virus à l'aide de molécules inhibitrices. Cette thèse présente l'étude des plus petites ARN 5'-triphosphatases et ARN guanylyltransférase connues à ce jour, les protéines A449R et A103R du virus Paramecium bursaria chlorella de type 1, ainsi que du premier enzyme viral de dégradation de la structure coiffe découvert : la protéine D10 du virus de la vaccine. L'étude de l'ARN 5'-triphosphatase A449R a permis de déterminer l'implication des acides aminés Glu24, Glu26 et Glu165 dans l'interaction avec des ions divalents au centre catalytique de l'enzyme, ainsi que leur nature essentielle pour l'activité ARN 5'-triphosphatase. De plus, les résultats obtenus démontrent que l'interaction de l'enzyme avec les ions ne stabilise pas l'interaction de l'enzyme avec son substrat d'ARN, tel que précédemment observé avec l'ARN triphosphatase de la levure Saccharomyces cerevisiae. Chez A449R, la liaison des ions semble plutôt positionner les acides aminés du centre catalytique pour la catalyse. Ces données démontrent que des enzymes reliés au niveau phylogénique possèdent des mécanismes distincts pour une même activité essentielle de synthèse de la structure coiffe. Ces particularités pourraient être ciblées pour le développement d'antiviraux ou d'antifongiques spécifiques. Parallèlement, une caractérisation cinétique complète de toutes les étapes du mécanisme d'ARN guanylyltransférase de la protéine A103R a été entreprise.La production d'un schéma de l'énergie libre impliquée dans le déroulement de la réaction a permis de préciser l'étape limitante du mécanisme, ainsi que la nature spontanée de la réaction in vitro . Les ARN guanylyltransférases étant très conservées entre les métazoaires, levures et virus, cette caractérisation a permis d'acquérir quantité d'information sur ce mécanisme catalytique peu connu. Cette étude nous mène au questionnement des implications pour la cellule de la synthèse exclusive d'une coiffe guanosine par les ARN guanylyltransférases. Finalement, la caractérisation du mécanisme d'action de la protéine D10 ainsi que la modélisation du site actif de l'enzyme ont permis de générer le premier modèle mécanistique pour un enzyme viral de dégradation de la structure coiffe. Ce mécanisme est régi par la présence de deux ions divalents et d'une molécule d'eau coordonnée par les acides aminés Glu141, Glu145 et Glu132 respectivement. Étant donné le peu de conservation de la séquence primaire entre cet enzyme viral et les enzymes de dégradation de la coiffe des métazoaires, il est possible que le mécanisme utilisé par ces enzymes diffère du mécanisme découvert pour la protéine D10. Cet enzyme deviendrait donc une cible virale potentielle supplémentaire.La caractérisation de ces trois protéines virales a permis d'accroître significativement notre connaissance mécanistique fondamentale des activités catalysées par ces enzymes retrouvés tant chez les virus que chez l'humain et les levures. L'étude de l'ARN 5'-triphosphatase A449R a démontré que des enzymes très proches au niveau phylogénique peuvent posséder des mécanismes divergents. De plus, des études futures pourront démontrer dans quelles mesures les mécanismes découverts pour l'ARN guanylyltransférase A103R et l'enzyme de dégradation de la coiffe D10 seront applicables à d'autres enzymes de même famille présents chez d'autres organismes. Il serait intéressant de poursuivre ces études en incorporant une utilisation accrue de la bioinformatique pour la modélisation des structures tertiaires des enzymes viraux, ainsi que l'utilisation de collections d'analogues de nucléotides pour caractériser les sites actifs des enzymes et ouvrir la voie au développement d'inhibiteurs.

La résistance bactérienne aux antibiotiques est un problème majeur de santé publique. Un moyen de la combattre est de viser des cibles non encore exploitées pour retarder l’apparition de la résistance. Dans ce contexte, nous avons entrepris la caractérisation sur les plans biochimique et structural de l’enzyme MraY, une protéine intégrale de membrane, membre d’une famille de transférases membranaires. MraY catalyse la première étape membranaire de la biosynthèse du peptidoglycane bactérien à savoir, le transfert du motif N-acétylmuramoyl-pentapeptide du précurseur cytoplasmique UDP-MurNAc-pentapeptide sur le transporteur membranaire, l’undécaprényl-phosphate aboutissant à la formation du lipide I. Aucune structure 3D de cette enzyme n’est disponible actuellement et aucun antibiotique en utilisation clinique ne la cible. D’une part nous avons entrepris la caractérisation structurale de cette enzyme par des approches de biophysique. Des essais de cristallisation 2D dans des systèmes membranaires ont permis d’observer au microscope électronique des dimères de MraY (taille de 70Å/50Å). Des expériences de diffusion des rayons X (SAXS) montrent un rayon de giration d’environ 42Å. Les résultats issus des expériences de SAXS ont été combinés à des approches de modélisation afin déterminer l’état d’oligomérisation de cette protéine en présence de détergents. Enfin, en vue de faciliter la cristallogenèse 3D, des chimères de MraY en fusion avec des protéines hydrosolubles de structure 3D résolues (mCherry et GFP) ont été construites. Des essais de cristallisation de la protéine seule et des chimères construites ont été effectués.D’autre part, nous avons élucidé le mécanisme catalytique de l’enzyme MraY et de son paralogue WecA. Au cours de ma thèse, j’ai pu montrer que cette famille de transférase membranaire présente un mécanisme catalytique commun qui procède en une seule étape par attaque directe d’un oxyanion du substrat lipidique, préalablement déprotoné par un résidu aspartate invariant, sur le phophate Beta du substrat nucléotidique. Cela conduit à la formation du produit lipidique et libération de l’UMP. / The growing emergence of multiresistance of pathogenic bacteria to currently used antibiotics is a major public health problem that requires the development of new therapeutic compounds and the identification and exploitation of novel targets. In this context, we undertook the biochemical and structural characterization of MraY enzyme, an integral membrane protein, member of the polyprenyl-phosphate N-acetylhexosamine 1-phosphate transferase superfamily. The MraY transferase catalyzes the first membrane step of bacterial cell wall peptidoglycan biosynthesis, namely the transfer of the N-acetylmuramoyl-pentapeptide moiety of the cytoplasmic precursor UDP-MurNAc-pentapeptide to the membrane transporter undecaprenyl phosphate, yielding C55-PP-MurNAc-pentapeptide (lipid I). To date, no crystal structure has been reported for this enzyme. On the one hand we have undertaken the structural characterization of this enzyme by differents biophysical approaches. Electron microscopic images after two-dimensional crystallization of the protein displayed a dimeric organisation of the MraY enzyme (size 70Å/50Å). Small X-ray scattering (SAXS) experiments have shown a radius of gyration of about 42A. The results of SAXS experiments were combined with modeling approaches to determine the oligomerization state of the protein in the presence of detergents. Finally, in order to facilitate 3D crystallisation of MraY, fusion proteins of MraY and mCherry/GFP were constructed. Crystallization trials of MraY alone and the constructed chimeras were made. On the other hand, we have elucidated the catalytic mechanism of the MraY transferase and its paralog WecA. In this study, we have shown that this family of membrane transferases has a common catalytic mechanism that proceeds by a single step displacement. During this “one-step” mechanism, the oxyanion of the poly-prenyl phosphate attacks the β phosphate of the nucleotide substrate, leading to the formation of lipid product and the liberation of UMP.

Les NO-synthases sont des flavohémoprotéines responsables de la production de NO• chez les mammifères (mNOS). Elles se composent d’un domaine réductase, qui lie les cofacteurs FMN et FAD et le co-substrat NADPH, et d’un domaine oxygénase qui lie l’hème, le substrat L-arginine et le cofacteur redox essentiel tétrahydrobioptérine H4B. Ces quinze dernières années, plusieurs NOS d’origine bactérienne (bacNOS) ont été caractérisées et il a été montré qu’elles étaient semblables au domaine oxygénase de leurs homologues mammifères. Il existe cependant des différences significatives entre mNOS et bacNOS, la plus importante étant l’absence de domaine réductase chez les NOS d’origine bactérienne. De plus, le(s) mécanisme(s) catalytique(s) de ces dernières ainsi que leur(s) fonction(s) in vivo restent actuellement à déterminer. Plusieurs études publiées montrent que la substitution Val/Ile à proximité du site actif, conservée entre mNOS et bacNOS, est partiellement responsable des différences observées au niveau catalytique entre ces deux groupes. Dans le cadre de cette thèse, j’ai utilisé les spectroscopies d’absorption UV-visible et RPE, ainsi que des techniques de cinétiques rapides comme le stopped-flow et le freeze-quench, pour caractériser les deux mutants complémentaires bsNOS I224V et iNOS V346I afin de mieux comprendre l’influence de cette mutation. J’ai ainsi montré qu’il existait des différences fondamentales entre bacNOS et mNOS qui ne sont pas liées à la substitution Val/Ile et que ces deux familles d’enzymes suivent probablement des mécanismes catalytiques différents pour l’étape d’oxydation du NOHA. Ces résultats sont confirmés par l’étude de la NOS thermostable issue de Geobacillus stearothermophilus. Lorsqu’on s’intéresse au fonctionnement in vivo des bacNOS, se pose également la question de la nature du cofacteur redox puisque de nombreuses bactéries possédant une NOS n’ont pas la machinerie nécessaire à la synthèse de H4B ; c’est par exemple le cas de Deinococcus radiodurans pour qui l’utilisation du tétrahydrofolate H4F a été proposée. J’ai donc étudié et caractérisé deiNOS de manière approfondie en présence de différents cofacteurs afin de mieux comprendre leurs rôles redox et structural. Ceci a notamment permis de proposer un mécanisme catalytique légèrement différent de celui suivi par bsNOS ce qui suggère que ces enzymes pourraient avoir différentes fonctions in vivo. Enfin, la première caractérisation in vitro d’une NOS de plante, issue de l’algue verte unicellulaire Ostreococcus tauri est présentée dans ce manuscrit. Les résultats suggèrent que celle-ci aurait effectivement une activité NO-synthase in vivo. / NO-synthases are flavohemoproteins responsible for NO• production in mammals (mNOS). They are comprised of a reductase domain, that binds FMN, FAD and NADPH, and an oxygenase domain, that binds heme, the substrate L-arginine and the essential redox active tetrahydrobiopterin cofactor H4B. In the last 15 years, several bacterial NOS (bacNOS) have been characterized and shown to resemble the oxygenase domain of their mammalian counterpart. However bacNOS exhibit significant differences from mNOS, the most striking one being the lack of a reductase domain, and their catalytic mechanism(s) and in vivo function(s) are currently poorly understood. Previously published studies suggest that a conserved Val to Ile substitution near the active site is at least partially responsible for the differences in catalysis observed between mNOS and bacNOS. During my PhD I characterized the mutants on this particular position, bsNOS I224V and iNOS V346I, using UV-visible and EPR spectroscopies as well as rapid-kinetic technics such as stopped-flow spectrophotometry and rapid-freeze quench, to better understand the influence of this substitution. This showed that mammalian and bacterial enzymes are fundamentally different and probably follow different mechanisms for NOHA oxidation. Results from studying the thermostable NOS from Geobacillus stearothermophilus further confirm these observations. Another important issue regarding bacNOS functioning in vivo concerns the nature of the redox active cofactor since many NOS-containing bacteria do not have the machinery for H4B biosynthesis; this is for instance the case of Deinococcus radiodurans for which the use of tetrahydrofolate H4F has been proposed. I therefore performed an extensive characterization of deiNOS in the presence of various cofactors to better understand their redox and structural roles. This allowed proposing a slightly different mechanism for deiNOS, compared to bsNOS, suggesting different function(s) in vivo. Finally, the first in vitro characterization of a plant NOS from the unicellular green alga Ostreococcus tauri is reported in this manuscript. The results suggest that this NOS-like protein is indeed a genuine NO-synthase.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les Méthionine sulfoxyde réductases (Msr) catalysent la réduction spécifique des méthionine sulfoxydes (Met-O) en méthionines (Met). Elles sont impliquées dans la résistance des cellules à un stress oxydant et dans la virulence des bactéries pathogènes du genre Neisseria. Cette famille d'enzyme se compose de trois classes, les MsrA et B, structuralement distinctes, et présentant une stéréosléctivité respectivement pour l'isomère S et R de la fonction sulfoxyde du substrat. Une troisième classe, découverte récemment, et appelée fRMsr, catalyse la réduction spécifique de la forme libre de l'isomère R de la fonction sulfoxyde. La fRMsr appartient à la famille des domaines GAF, généralement impliqués dans la signalisation cellulaire, et les fRMsr représentent le premier domaine GAF présentant une activité enzymatique. Les études réalisées au cours de ma thèse sur la fRMsr de Neisseria meningitidis ont permis de montrer que : 1) fRMsr de N. meningitidis présente un mécanisme catalytique identique à MsrA/B avec la formation d'au moins un pont disulfure intramoléculaire Cys84-Cys118 réduit par la thiorédoxine (Trx) ; 2) La Cys118 est le résidu catalytique sur lequel l'intermédiaire acide sulfénique doit se former ; 3) L'étape réductase est l'étape cinétiquement déterminante du mécanisme à deux étapes conduisant à la formation du pont disulfure Cys84-Cys118. La combinaison de l'analyse des résultats cinétiques, et de la structure tridimensionnelle de la fRMsr de N. meningitidis en complexe avec le substrat ont permis de montrer : 1) L'existence d'un site de reconnaissance oxyanion impliqué dans la stabilisation de la fonction carboxylate ; 2) Un rôle de la fonction carboxylate du résidu Asp143 dans la catalyse de l'étape réductase ; 3) Le résidu Glu125 est impliqué dans la reconnaissance et/ou le positionnement du substrat Met-O probablement via la stabilisation du groupement NH3+ ; 4) Un rôle du résidu Asp141 dans le positionnement des résidus Asp143 et Glu125 ; 5) le noyau indole du Trp62 est impliqué dans la stabilisation du groupe méthyle-[epsilon] / Methionine sulfoxide reductases (Msr) catalyze the specific reduction of methionine sulfoxides (Met-O) into methionine (Met). They are involved in cell defences against oxidative stress and virulence of pathogenic bacteria of Neisseria genius. This family of enzymes consists of three classes, MsrA and MsrB, structurally-unrelated, Specific for the S and the R epimer of the sulfoxide function of the substrate, respectively. A third class, recently discovered and called fRMsr, selectively reduce the free form of the R epimer of the sulfoxide function. The fRMsr belongs to the family of GAF domains, they are usually involved in cell signaling, and fRMsr represent the first GAF domain to show enzymatic activity. The studies of the Neisseria meningitidis fRMsr have shown that: 1) The Neisseria meningitidis fRMsr have a identical catalytic mechanism to MsrA and MsrB with the formation of at least one intramolecular disulfide bond, Cys84-Cys118 reduced by thioredoxin (Trx) ; 2) The Cys118 is demonstrated to be the catalytic Cys on which a sulfenic acid is formed ; 3) The Reductase step is the rate determining step of the mechanism leading to the formation of the disulfide bond Cys84-Cys118. The combination of the biochemical and kinetics data, and the examination of the 3D structure of the N. meningitidis fRMsr in complex with its substrate shown: 1) an oxyanion hole involved in the accommodation of the carboxylate group ; 2) the carboxylate group of the Asp143 residue involved in the catalysis of step reductase, and 3) The Glu125 residue involved in the recognition and/or positioning of the Met-O probably by the stabilization of the NH3+; 4) the Asp141 residue involved in the positioning of Asp143 and Glu125 residues ; 5) the indole ring of the Trp62 residue involved in stabilizing of the epsilon-methyl group

L'émergence du phénotype MDR (« multidrug resistance») des cellules cancéreuses est souvent corrélée à la surexpression de protéines membranaires appartenant à la superfamille ABC (« ATP binding cassette »). Ces protéines couplent l'hydrolyse de l'ATP au transport d'agents chimiothérapeutiques vers l'extérieur des cellules. Chez les bactéries, des transporteurs homologues ont été impliqués dans certains cas de résistance aux antibiotiques.<br />Deux nouveaux transporteurs ABC bactériens, Rv1747 de Mycobacterium tuberculosis et YheI/YheH de Bacillus subtilis, potentiellement impliqués dans la résistance aux antibiotiques, ont été étudiés ici en réalisant une expression hétérologue chez Escherichia coli et en isolant des vésicules de membrane inversées. Ce système s'est avéré inapproprié pour l'étude du transporteur Rv1747, à cause vraisemblablement des différences entre E. coli et M. tuberculosis dans l'usage des codons. En revanche, nous avons obtenu un degré important de surexpression de YheI/YheH qui nous a permis de caractériser son activité de transport et d'hydrolyse de l'ATP. Nous avons ainsi montré que les deux protéines, YheI et YheH, s'associent pour former un exportateur hétérodimérique capable de transporter de multiples drogues, et que le rôle des deux sous-unités n'est pas identique dans le mécanisme catalytique du transporteur. Enfin, nous avons réussi à purifier le transporteur YheI/YheH avec un rendement élevé et dans un état fonctionnel stable, permettant d'approfondir sa caractérisation biochimique ainsi que d'obtenir des cristaux bidimensionnels pour une étude structurale par microscopie électronique.

La chitotriosidase (CHIT1) est une chitinase humaine appartenant à la famille glycosyl hydrolase 18 (GH18) qui hydrolyse la chitine. CHIT1 présente plusieurs caractéristiques enzymatiques conservées dans la famille GH18 qui ne sont pas complètement comprises. Pour renforcer nos connaissances sur le mécanisme catalytique de CHIT1 et de la famille GH18, j'ai amélioré la résolution des structures obtenues par diffraction de rayon-X du domaine catalytique de CHIT1. Ces structures correspondent à la forme apo de CHIT1, pseudo-apo ainsi qu’en complexe avec la chitobiose ont été obtenues à des résolutions comprises entre 0.95Å et 1.10Å. Mes résultats m’ont permis de proposer un nouveau mécanisme d’hydrolyse des chaines chito-oligosaccharidiques. En outre, grâce à une nouvelle stratégie de cristallisation, la première structure cristalline de CHIT1 complète a pu être obtenue à une résolution de 1.95Å. Mon étude donne de nouvelles perspectives sur le mode d'action de CHIT1 et les caractéristiques enzymatiques conservées dans la famille GH18. / Chitotriosidase (CHIT1) is a human chitinase belonging to the glycosyl hydrolase family 18 (GH18), a highly conserved enzyme family. GH18 enzymes hydrolyze chitin, a N-acetyl glucosamine polymer. CHIT1 is characterized by many enzymatic features that are conserved in GH18 and not completely understood. To increase our knowledge on the catalytic mechanism in CHIT1 and GH18 family, I improved the X-ray resolution crystal structure of CHIT1 catalytic domain in apo and pseudo apo forms as well as in complex with a synthetic substrate to a resolution range between 0.95Å and at 1.10Å. My results allow me to suggest a new mechanism for chito-oligosaccharide chains hydrolysis. Moreover, thanks to a new a crystallogenesis strategy, I obtained the first crystal structure of full length CHIT1 at 1.95Å resolution. My study presents many structural and mechanistic aspects of CHIT1 which gives new insights onto its mode of action and shed light into the conserved enzymatic features in GH18 chitinase family.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les fructose-1,6-bisphosphate aldolases (FBPA) sont des enzymes glycolytiques (EC 4.1.2.13) qui catalysent la transformation réversible du fructose-1,6-bisphosphate (FBP) en deux trioses-phosphates, le glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P) et le dihydroxyacétone phosphate (DHAP). Il existe deux classes de FBPA qui diffèrent au niveau de leur mécanisme catalytique. Les classes I passent par la formation d’un intermédiaire covalent de type iminium alors que les classes II, métallodépendantes, utilisent généralement un zinc catalytique. Contrairement au mécanisme des classes I qui a été très étudié, de nombreuses interrogations subsistent au sujet de celui des classes II. Nous avons donc entrepris une analyse détaillée de leur mécanisme réactionnel en nous basant principalement sur la résolution de structures cristallographiques. De nombreux complexes à haute résolution furent obtenus et ont permis de détailler le rôle de plusieurs résidus du site actif de l’enzyme. Nous avons ainsi corrigé l’identification du résidu responsable de l’abstraction du proton de l’O4 du FBP, une étape cruciale du mécanisme. Ce rôle, faussement attribué à l’Asp82 (chez Helicobacter pylori), est en fait rempli par l’His180, un des résidus coordonant le zinc. L’Asp82 n’en demeure pas moins essentiel car il oriente, active et stabilise les substrats. Enfin, notre étude met en évidence le caractère dynamique de notre enzyme dont la catalyse nécessite la relocalisation du zinc et de nombreux résidus. La dynamique de la protéine ne permet pas d’étudier tous les aspects du mécanisme uniquement par l’approche cristallographique. En particulier, le résidu effectuant le transfert stéréospécifique du proton pro(S) sur le carbone 3 (C3) du DHAP est situé sur une boucle qui n’est visible dans aucune de nos structures. Nous avons donc développé un protocole de dynamique moléculaire afin d’étudier sa dynamique. Validé par l’étude d’inhibiteurs de la classe I, l’application de notre protocole aux FBPA de classe II a confirmé l’identification du résidu responsable de cette abstraction chez Escherichia coli (Glu182) mais pointe vers un résidu diffèrent chez H. pylori (Glu149 au lieu de Glu142). Nos validations expérimentales confirment ces observations et seront consolidées dans le futur. Les FBPA de classe II sont absentes du protéome humain mais sont retrouvées chez de nombreux pathogènes, pouvant même s'y révéler essentielles. Elles apparaissent donc comme étant une cible idéale pour le développement de nouveaux agents anti-microbiens. L’obtention de nouveaux analogues des substrats pour ces enzymes a donc un double intérêt, obtenir de nouveaux outils d’étude du mécanisme mais aussi développer des molécules à visée pharmacologique. En collaboration avec un groupe de chimistes, nous avons optimisé le seul inhibiteur connu des FBPA de classe II. Les composés obtenus, à la fois plus spécifiques et plus puissants, permettent d’envisager une utilisation pharmacologique. En somme, c’est par l’utilisation de techniques complémentaires que de nouveaux détails moléculaires de la catalyse des FBPA de classe II ont pu être étudiés. Ces techniques permettront d’approfondir la compréhension fine du mécanisme catalytique de l’enzyme et offrent aussi de nouvelles perspectives thérapeutiques. / Fructose-1,6-bisphosphate aldolases (FBPA) are glycolytic enzymes (EC 4.1.2.13) that catalyze the reversible cleavage of fructose-1,6-bisphosphate (FBP) into the triose phosphates, glyceraldehyde-3-phosphate (G3P) and dihydroxyacetone phosphate (DHAP). There are two classes of FBPAs that differ at the level of their mechanism. Class I FBPAs form a covalent iminium intermediate whereas class II FBPAs, being metalloenzymes, generally use a catalytic zinc in their reaction mechanism. In contrast to the mechanism of the class I FBPAs, which has been thoroughly studied, there are several unresolved inquiries as to the mechanism of class II FBPAs. We have therefore pursued a detailed analysis of the reaction mechanism using as a primary tool the elucidation of crystallographic structures. Several high resolution complexes have been resolved and have provided critical evidence to help us suggest the implication and role of several key residues in the active site. Consequently, we have correctly identified the residue which is responsible for the abstraction of the O4 proton from FBP, a vital step in the reaction mechanism. The residue responsible for this abstraction, which had incorrectly been assigned to Asp82 (in Helicobacter pylori), has been appropriately consigned to His180, a residue which is involved in coordinating the zinc molecule. Nevertheless, Asp82 remains an important residue as it orients, activates and stabilizes substrates. Finally, our study brings to evidence the dynamic character of our enzyme in which catalysis entails the relocalization of the catalytic zinc and several residues. The complexity of this reaction, notably one of the proton exchanges in the mechanism, could not be resolved solely by crystallographic means. In fact, the residue responsible for the stereospecific transfer of the pro(S) proton on carbon 3 (C3) of DHAP is situated on a loop that was not resolved in any of our structures. We therefore developed a molecular dynamics approach to study this intricate movement. After preliminary validation by inhibitor studies with class I FBPAs, the protocol was applied to class II FBPAs and several remarkable observations emerged: the residue responsible for this abstraction in Escherichia coli is Glu182 whereas a different residue, Glu149 (instead of Glu142) appears to assume this role in H. pylori. Our preliminary validations have confirmed this observation and shall be further consolidated in the future. Class II FBP aldolases, although absent from the human proteome, are prevalently found in several pathogens, and have further been found to be essential to a number of these organisms. As such, they are ideal targets for the development of novel anti-microbial agents. Developing new analogues of the cognate substrates of these enzymes is therefore not only advantageous for mechanistic studies, but has endless pharmacological potential. In the context of a collaborative effort involving a group of chemists, a compound that initially had an inhibition constant in the millimolar range was optimized and produced a series of compounds that inhibit in the nanomolar range.