L'émergence du phénotype MDR (« multidrug resistance») des cellules cancéreuses est souvent corrélée à la surexpression de protéines membranaires appartenant à la superfamille ABC (« ATP binding cassette »). Ces protéines couplent l'hydrolyse de l'ATP au transport d'agents chimiothérapeutiques vers l'extérieur des cellules. Chez les bactéries, des transporteurs homologues ont été impliqués dans certains cas de résistance aux antibiotiques.<br />Deux nouveaux transporteurs ABC bactériens, Rv1747 de Mycobacterium tuberculosis et YheI/YheH de Bacillus subtilis, potentiellement impliqués dans la résistance aux antibiotiques, ont été étudiés ici en réalisant une expression hétérologue chez Escherichia coli et en isolant des vésicules de membrane inversées. Ce système s'est avéré inapproprié pour l'étude du transporteur Rv1747, à cause vraisemblablement des différences entre E. coli et M. tuberculosis dans l'usage des codons. En revanche, nous avons obtenu un degré important de surexpression de YheI/YheH qui nous a permis de caractériser son activité de transport et d'hydrolyse de l'ATP. Nous avons ainsi montré que les deux protéines, YheI et YheH, s'associent pour former un exportateur hétérodimérique capable de transporter de multiples drogues, et que le rôle des deux sous-unités n'est pas identique dans le mécanisme catalytique du transporteur. Enfin, nous avons réussi à purifier le transporteur YheI/YheH avec un rendement élevé et dans un état fonctionnel stable, permettant d'approfondir sa caractérisation biochimique ainsi que d'obtenir des cristaux bidimensionnels pour une étude structurale par microscopie électronique.

L'acquisition du phénotype de résistance des cancers est souvent corrélée à l'expression de transporteurs membranaires appartenant à la superfamille des transporteurs ABC (« ATP-Binding Cassette »). Un de ces transporteurs, MRP1 (« Multidrug Resistance Protein 1 »), permet l'efflux de nombreux substrats, de type anioniques, conjugués au GSH, glucuronates ou sulfates, ou en co-transport avec le GSH.<br />Dans un premier temps, ce travail a porté sur l'étude des domaines de fixation des nucléotides isolés. Une étude biochimique a montré leur caractère fonctionnel asymétrique concernant les nucléotides, prouvant que seul la séquence primaire de ces NBD est responsable de cette fonctionnalité différentielle. L'étude de la fixation de substrats sur les NBD, a montré que ceux-ci pourraient, de part leur proximité avec les domaines transmembranaires, avoir un rôle dans la fixation des substrats.<br />La deuxième étape de ce travail a concerné la caractérisation de l'activité des énantiomères du vérapamil. Les résultats ont montré que le S-vérapamil est l'isomère responsable de la stimulation du transport du GSH, conduisant à la mort des cellules surexprimant MRP1. Le R-vérapamil est caractérisé comme un inhibiteur de MRP1. Ces résultats ont des répercussions importantes en terme de thérapie.<br />Deux études préliminaires de relation structure/fonction ont été menées en ce qui concerne des dérivés du vérapamil et des dérivés de flavonoïdes, afin de trouver des molécules plus efficaces contre MRP1.

ABCB1 (ou P-gp pour "glycoprotéine-P"), ABCC1 (ou MRP1 pour "Multidrug Resistance Protein 1") et ABCG2 (ou BCRP pour "Breast Cancer Resistance Protein") sont les trois transporteurs ABC humains les plus impliqués dans la chimiorésistance de certaines cellules cancéreuses. Deux stratégies sont possibles pour éradiquer cette résistance : 1) l'élimination ciblée des cellules surexprimant ces transporteurs, grâce au talon d'Achille qu'elles ont développé comme conséquence de leur chimiorésistance : la sensibilité collatérale (ou hypersensibilité), et 2) l'identification et l'optimisation d'inhibiteurs spécifiques. Lors de ce projet, nous nous sommes particulièrement intéressés au transporteur ABCG2. Dans un premier temps, comme la sensibilité collatérale avait été décrite dans le cas de la surexpression d'ABCB1 ou d'ABCC1, nous voulions vérifier son implication éventuelle dans le cas de la surexpression d'ABCG2. Sans pouvoir finalement conclure sur son existence, nous avons démontré que le mécanisme d'action ne pouvait pas impliquer un efflux massif de glutathion par la protéine, comme c'est le cas pour ABCC1, contrairement à certaines données de la littérature. Dans le cadre de la seconde approche, nous avons criblé différentes séries de composés, apparentés aux flavonoïdes, pour identifier des inhibiteurs spécifiques d'ABCG2. Nous avons ainsi pu mettre en évidence des relations structure-activité démontrant l'importance de certains substituants, notamment des groupements méthoxy, non seulement pour l'inhibition de l'activité du transporteur mais aussi pour la cytotoxicité des molécules. Ces études nous ont également permis de classer les inhibiteurs identifiés en 4 familles distinctes, quant à leur mécanisme d'action à la fois sur l'efflux de drogues comme la mitoxantrone et l'activité ATPasique d'ABCG2. Enfin, le meilleur inhibiteur spécifique d'ABCG2 décrit à ce jour, la chromone 6g (ou MBL-II-141) a été caractérisé plus en détails. Son efficacité in vivo pour empêcher la croissance de tumeurs humaines xénogreffées chez la souris nous incite à être optimistes sur la possibilité de proposer un inhibiteur d'ABCG2 comme candidat médicament pour de futures études précliniques

Notre projet vise à déterminer la structure 3D du transporteur BmrA de Bacillus subtilis. La protéine a été purifiée dans six détergents différents. L'utilisation de foscholine 12, a conduit à cristalliser OmpF, une porine de la membrane externe d'E. coli. Nous montrons que les conditions de cristallisation influencent directement l'empilement cristallin d'OmpF. Le protocole de purification de BmrA, optimisé en utilisant du triton X100 à l'extraction puis un mélange β-D-dodecyl maltoside-cholate pour les étapes chromatographiques nous a permis d'obtenir à 4°C des cristaux, pour lesquels nous avons vérifié qu'ils sont constitués de BmrA. Ces cristaux ont permis d'obtenir un jeu complet jusqu'à 7 Å. Ces données de diffraction constituent une avancée significative pour résoudre à court terme la structure 3D de BmrA. Nous avons développé une nouvelle méthode de dosage des détergents qui est basée sur la détermination par spectrométrie de masse de type MALDI du ratio d'isotopes deutérés/ protonés. La méthode a été validée avec la FC12, le DDM, le β-OG, le LMNG, le CHAPS, le cholate et des détergents calix[4]aréniques, en mesurant la concentration de ces détergents dans différentes conditions d'extraction/purification, de concentration, dialyse et gel filtration, de différentes protéines membranaires. Cette méthode nous a permis (i) d'estimer la taille de la ceinture de détergent associée à BmrA et d'autres protéines membranaires (ii) de moduler cette taille en fonction de mélange de détergents et (iii) d'apporter des informations sur le comportement des complexes protéine-détergent / Our project aims to determine the 3D structure of BmrA from Bacillus subtilis. The protein was purified in six different detergents. Using foscholine 12, led to crystallize OmpF, an outer membrane porin of E. coli. We show that the crystallization conditions directly influence the crystal packing of OmpF. The BmrA purification protocol optimized by using Triton X100 at the extraction and a mixture β-D-dodecyl-maltoside cholate for chromatographic steps allowed us to get to 4°C crystals, for which we verified they consist of BmrA. These crystals have yielded full data to 7 Å. These diffraction data are a significant advance in the short term to resolve the 3D structure of BmrA. We have developed a new detergents dosage assay which is based on the determination by MALDI-type mass ratio of deuterated isotopes / protonated. The method was validated with the FC12, the DDM, the β-OG, the LMNG, CHAPS, cholate detergents and calix [4] aréniques by measuring the concentration of these detergents in different conditions of extraction/ purification, concentration, dialysis and gel filtration, of different membrane proteins. This method allowed us (i) to estimate the size of the detergent belt associated to BmrA and other membrane proteins (ii) to modulate this size in terms of the detergent mixture and (iii) to provide information on the behavior of complex protein-detergent

ABCB1 (ou P-gp pour “glycoprotéine-P”), ABCC1 (ou MRP1 pour “Multidrug Resistance Protein 1”) et ABCG2 (ou BCRP pour “Breast Cancer Resistance Protein”) sont les trois transporteurs ABC humains les plus impliqués dans la chimiorésistance de certaines cellules cancéreuses. Deux stratégies sont possibles pour éradiquer cette résistance : 1) l'élimination ciblée des cellules surexprimant ces transporteurs, grâce au talon d'Achille qu'elles ont développé comme conséquence de leur chimiorésistance : la sensibilité collatérale (ou hypersensibilité), et 2) l'identification et l'optimisation d'inhibiteurs spécifiques. Lors de ce projet, nous nous sommes particulièrement intéressés au transporteur ABCG2. Dans un premier temps, comme la sensibilité collatérale avait été décrite dans le cas de la surexpression d'ABCB1 ou d'ABCC1, nous voulions vérifier son implication éventuelle dans le cas de la surexpression d'ABCG2. Sans pouvoir finalement conclure sur son existence, nous avons démontré que le mécanisme d'action ne pouvait pas impliquer un efflux massif de glutathion par la protéine, comme c'est le cas pour ABCC1, contrairement à certaines données de la littérature. Dans le cadre de la seconde approche, nous avons criblé différentes séries de composés, apparentés aux flavonoïdes, pour identifier des inhibiteurs spécifiques d'ABCG2. Nous avons ainsi pu mettre en évidence des relations structure-activité démontrant l'importance de certains substituants, notamment des groupements méthoxy, non seulement pour l'inhibition de l'activité du transporteur mais aussi pour la cytotoxicité des molécules. Ces études nous ont également permis de classer les inhibiteurs identifiés en 4 familles distinctes, quant à leur mécanisme d'action à la fois sur l'efflux de drogues comme la mitoxantrone et l'activité ATPasique d'ABCG2. Enfin, le meilleur inhibiteur spécifique d'ABCG2 décrit à ce jour, la chromone 6g (ou MBL-II-141) a été caractérisé plus en détails. Son efficacité in vivo pour empêcher la croissance de tumeurs humaines xénogreffées chez la souris nous incite à être optimistes sur la possibilité de proposer un inhibiteur d'ABCG2 comme candidat médicament pour de futures études précliniques / ABCB1, ABCC1 and ABCG2 are the 3 human ABC transporters mainly involved in chemoresistance of some cancer cells. Two strategies may eradicate such a resistance: 1) by selectively killing cells overexpressing these transporters thanks to the Achille’s heel they develop consequently to chemoresistance: the so called collateral sensitivity; 2) by the identification and optimization of specific inhibitors. This project has focused on the ABCG2 transporter. Firstly, since collateral sensitivity had already been described in ABCB1- and ABCC1-overexpressing cells, we wanted to verify if it might occur in cases of ABCG2 overexpression. Finally, we could not conclude on its occurence, but we demonstrated that the mechanism could not imply glutathione efflux as it is known to be the case for ABCC1, by contrast with some literature data. Concerning the second approach, we screened different flavonoid compounds to identify new specific ABCG2 inhibitors. We could propose some structure-activity relationships highlighting substituents critical role, particularly concerning methoxy groups, toward both inhibition of the transporter activity and intrinsic cytotoxicity of the molecules. These studies allowed us to propose a classification of the inhibitors into 4 families, thanks to their action mechanism on both inhibition of drug efflux and ATPase activitiy. Finally, the best specific ABCG2 inhibitor, chromone 6g (or MBL-II-141), has been further investigated. Its efficacy to prevent the growth of human tumors xenografted in mice, make us quite optimistic on the possibility to propose an ABCG2 inhibitor as a new drug candidate for future preclinical studies