Les nucleotides sont des molécules organiques essentielles à la vie qui participent à diverses fonctions des organismes vivants comprenant le stockage de l'information génétique (ADN), sa transcription (ARNm), sa traduction (ARNr, ARNt) en protéine et la régulation de cette traduction (miARN) ainsi qu'au contrôle de l'activité de certaines protéines comme les protéines kinases (ATP) et au stockage de l'énergie chimique (ATP, GTP). Les nucleotides peuvent aussi être relâchés dans le milieu extracellulaire et servir de signaux autocrines et paracrines en activant des récepteurs P2 spécifiques. Leur concentration est contrôlée par des ecto-nucléotidases qui hydrolysent les nucleotides en nucleosides. Ces enzymes peuvent ainsi influencer l'activation des récepteurs P2. Dans cette thèse, j'introduirai d'abord de façon globale la signalisation par les nucleotides, les nucleosides et les molécules qui contiennent des nucleotides (c'est-à-dire NAD, FAD, NpnN) et décris ensuite de façon plus spécifique l'importance de cette signalisation dans le processus inflammatoire. Par la suite, , je présenterai le travail que j'ai entrepris afin de mieux comprendre le rôle joué par les ecto-nucléotidases en approfondissant la caractérisation biochimique des nucleosides triphosphates diphosphohydrolases (NTPDases) et en analysant le rôle de l'une d'entre elles, la NTPDasel, dans le macrophage murin. Ensuite, je présenterai la caractérisation d'une nouvelle ecto-nucléotidase, la NTPDase8 (chapitre 2), et la comparaison des propriétés biochimiques des quatre NTPDases humaines et murines présentes au niveau de la membrane plasmique soit les NTPDasel, 2, 3 et 8 (Chapitre 3). Ces enzymes peuvent contrôler la concentration des différents agonistes des récepteurs P2 de façon fine et distincte. Au chapitre 4, je présenterai la caractérisation de l'ARL 67156, un inhibiteur potentiel de la NTPDasel. Parmi les différentes ecto-nucléotidases hydrolysant l'ATP extracellulaire, cette molécule inhibe de façon compétitive les NTPDasel et NTPDase3 ainsi que la nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase-1 (NPP1). Finalement, je montrerai que la NTPDasel est la principale ecto-nucléotidase des macrophages murins où elle contrôle l'activation du récepteur P2X₇ et les fonctions qui lui sont associées telles que la mort induite par l'ATP, l'ouverture d'un pore et la relâche d'IL-iβ et d'IL-18, deux cytokines précoces de l'inflammation.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’ATP est l’agoniste naturel du récepteur P2Y11. Ce nucléotide ne peut cependant pas être utilisé comme agent thérapeutique car, in vivo, il s’hydrolyse rapidement en ADP ou en AMP qui ne possèdent qu’une faible activité pour le récepteur. D’où l’intérêt de disposer d’analogues de synthèse moins sensibles à l’hydrolyse et possédant une affinité égale ou supérieure à celle de l’ATP. Le premier objectif que nous nous sommes fixés au cours de notre thèse de doctorat fut de mettre au point un schéma de synthèse permettant d’obtenir des analogues de l’adénosine-5’-triphosphate [1] portant un motif thioalkyle ou thioaryle en position 2 de la base ainsi qu’un groupement dichlorométhylène entre les phosphores b et g de la chaîne polyphosphate. En effet, ces composés présentent une activité agoniste vis-à-vis du récepteur P2Y11, leurs synthèses sont bien décrites dans la littérature et les produits de départ sont beaucoup moins onéreux qu’en série 2’-désoxy. De plus, ces synthèses permettront de mettre les différentes réactions au point avant de synthétiser les analogues de la 2’-désoxyadénosine. Ces composés présentant une activité agoniste vis-à-vis du récepteur P2Y11 systématiquement supérieure à leurs homologues de la série 2’-OH, leur synthèse fera l’objet de la deuxième partie de ce travail. Deux schémas de synthèse en sept étapes ont été imaginés pour effectuer la synthèse des dérivés [101] à [105], l’un au départ d’adénosine [12] et l’autre au départ de guanosine [39]. Le schéma au départ d’adénosine ne nous a pas permis d’obtenir les analogues désirés en raison des difficultés de reproductibilité des réactions ainsi qu’en raison du faible rendement de la deuxième étape du schéma de synthèse. Le schéma au départ de la guanosine a permis quant à lui d’obtenir les analogues de l’adénosine-5’-triphosphate [101] à [105] avec des rendements globaux compris entre 10 et 20 %. Les tests d’activité agoniste ont montré que le dérivé [105] active le récepteur P2Y11 de la même manière que l’ATPgS avec des concentrations trois fois moindre. La deuxième partie de ce travail consista en la synthèse d’analogues du 2-thiodésoxynucléotide-5’-triphosphate. Un schéma de synthèse analogue à celui utilisé pour la synthèse des dérivés [101] à [105] au départ de la 2’-désoxyguanosine [40] aurait pu permettre l’obtention de tels dérivés. Cependant, les problèmes de dégradation rencontrés que le problème lié à l’introduction d’un motif thioalkyle (troisième étape) nous ont contraint à abandonner cette stratégie de synthèse. Les dérivés [106] à [110] ont finalement été synthétisés au départ du 2-désoxyribose [50]. Nous avons ensuite engagé ces analogues dans la réaction de phosphorylation. C’est lors de cette réaction que nous avons rencontré des problèmes importants de purification et de dégradation. Afin de résoudre ces problèmes, nous avons adopté pour une autre stratégie de synthèse afin d’obtenir les analogues triphosphate. Cette stratégie consiste en l’introduction d’un naphtoate en position 3’ afin de modifier la polarité de la molécule et espérer ainsi pouvoir obtenir une meilleure séparation. Les phosphorylations sur ces dérivés ont été effectuées dans les mêmes conditions que précédemment n’ont pas permis d’aboutir aux monophosphates correspondants. Dans ces conditions, l’ester naphtoïque et le lien glycosidique sont hydrolysés.

Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La maladie d'Alzheimer (MA) est une pathologie neurodégénérative progressive et lente. Elle se caractérise par des troubles de la mémoire à court terme, des fonctions d'exécutives et de l'orientation dans le temps et l'espace, ce qui conduit le patient à perdre progressivement son autonomie ainsi que ses facultés cognitives et intellectuelles. Les principales manifestations neuropathologiques de la MA sont l'atrophie cérébrale, les plaques amyloïdes et les dégénérescences neurofibrillaires formées de la protéine Tau hyperphosphorylée et anormalement phosphorylée. Cette altération de la phosphorylation de Tau peut être expliqué par un déséquilibre entre les kinases et les phosphatases. Malheureusement, aucun traitement efficace n'existe à l'heure actuelle. Les thérapies ne produisent qu'un ralentissement du déclin cognitif. Il persiste un manque de compréhension des mécanismes conduisant au déclenchement de la pathologie. Les récepteurs A2 d'adénosine (A2AR) pourraient représenter une cible thérapeutique potentielle et viable dans la MA, car ils sont impliqués dans les processus cognitifs, la mémoire et le vieillissement. L'hypothèse est que le traitement avec le MB204, un nouvel antagoniste sélectif de l'A2AR dérivé fluoriné de l'Istradéfylline, permettra de réduire la pathologie Tau dans des modèles cellulaires et murins d'hyperphosphorylation de tau. Il a été démontré que l'hypothermie induite par l'anesthésie chez les souris entraîne une hyperphosphorylation de la protéine tau. Étant donné que les niveaux accrus de phosphorylation de Tau sont un biomarqueur des maladies neurodégénératives comme la MA, ce modèle d'induction de l'hyperphosphorylation de Tau peut être utilisé pour tester des médicaments anti-neurodégénératifs potentiels, tels que le MB204. L'objectif est donc d'évaluer l'efficacité thérapeutique du MB204 dans la réduction de l'hyperphosphorylation de la protéine Tau. Un protocole de traitement a été établi dans le modèle aigu de la MA, qui utilise un modèle de l'induction de la phosphorylation par la diminution de la température induite par l'anesthésie chez les souris CD1, avec chlorure de lithium (25,4mg/kg, intrapéritonéale) comme contrôle positif. Il a été vérifié qu'aucun des traitements n'interférait avec l'induction de l'hypothermie par l'anesthésie. La quantification des Western blots a révélé que le traitement avec le MB204 permettait de réduire l'hyperphosphorylation de tau sur les épitopes AT8, Thr205 et AT270, comparé au groupe anesthésié non traité. De plus, l'analyse a pris en compte l'implication des kinases et des phosphatases, notamment celles qui affectent le plus la phosphorylation de la protéine Tau. Grâce à cette technique, il a été observé que le traitement permettait d'induire une diminution significative de l'hyperphosphorylation de la protéine Tau induite par l'anesthésie, renforçant ainsi son potentiel thérapeutique pour la MA. Toutefois, cela ne semble pas être le cas dans les cellules isolées surexprimant la protéine Tau humaine non mutée. Des recherches plus approfondies sont nécessaires, néanmoins le MB204 présente un potentiel thérapeutique prometteur pour la MA. / Alzheimer's disease (AD) is a progressive and slow evolving neurodegenerative disorder. It is characterized by impairments in short-term memory, executive functions and orientation in time and space. This progression will result in the gradual loss of cognitive and intellectual faculties and autonomy. The main neuropathological conditions of AD include brain atrophy, amyloid plaques and neurofibrillary tangles composed of hyperphosphorylated and abnormally phosphorylated Tau protein. This alteration in Tau phosphorylation can be explained by an imbalance between kinases and phosphatases. Unfortunately, there is no effective treatment available. The current therapies only slow the progression of cognitive decline. A lack of understanding remains regarding the mechanisms leading to the onset of the pathology. Since A2 adenosine receptors (A2AR) could represent a potential therapeutic target in AD due to their involvement in cognitive processes, memory and aging, the hypothesis is that treatment with MB204, a new selective A2AR antagonist derivative from Istradéfylline, will reduce Tau pathology in cellular and murine models of Tau hyperphosphorylation. It has been demonstrated that anesthesia-induced hypothermia in mice promotes hyperphosphorylation of Tau protein. Since increased levels of Tau protein phosphorylation are a biomarker for neurodegenerative diseases like AD, this model of Tau hyperphosphorylation induction can be used to test potential anti-neurodegenerative drugs, such as MB204. The objective is to evaluate the therapeutic effacacy of MB204 in reducing Tau protein hyperphosphorylation. A treatment protocol was established using a rapid model of Tau hyperphosphorylation induced isoflurane anesthesia in CD1 mice, with lithium chloride (25.4 mg/kg, intraperitoneally) as a positive control. It was verified that none of the treatments interfered with the induction of hypothermia by anesthesia. The quantification of Western blots revealed that treatment with MB204 reduced tau hyperphosphorylation on the epitopes AT8, Thr205, and AT270, compared to the untreated anesthetized group. Furthermore, the analysis took into account the involvement of kinases and phosphatases, particularly those that most affect tau protein phosphorylation. This technique demonstrated that MB204 induced a significant reduction in tau hyperphosphorylation induced by anesthesia, thereby reinforcing its therapeutic potential for Alzheimer's disease. Western blot analysis revealed that the treatment induced a significant reduction in Tau protein hyperphosphorylation caused by anesthesia, reinforcing its therapeutic potential for AD, although this effect was not observed in isolated cells that overexpressing Tau protein. Further research is required, however, MB204 demonstrates promising therapeutic potential for AD.

L'adénosine, la PGE2 ou l'AMP cyclique intracellulaire mènent toutes à des actions antiinflammatoires chez le neutrophile en inhibant par exemple la phagocytose, la production d'ions superoxydes, l'adhésion et la libération de cytokines. Par contre, les mécanismes moléculaires régulant ces actions anti-inflammatoires ne sont pas bien connus. Dans cette étude, nous avons étudié l'impact que ces agents ont sur le profil d'expression des gènes du neutrophile. L'expression génique a été étudiée par Genechip puis les résultats obtenus ont été validés par la technique du peR en temps réel. Avec cette approche, une quinzaine de gènes dont l'expression était altérée par ces agents ont été identifiés. Remarquablement, les trois agents utilisés ont eu un impact fort similaire sur le profil d'expression, suggérant un mécanisme commun permettant de limiter l'activation cellulaire. Nous avons donc identifié lors de ce projet un ensemble de gènes qui peuvent constituer d'importants signaux d'arrêt de l'activation du neutrophile.

L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie complexe, progressive et fatale, définie cliniquement par la présence d'une pression artérielle pulmonaire moyenne supérieure à 20mmHg au repos, résultant d'une vasoconstriction soutenue et d'un remodelage vasculaire pulmonaire important des artères pulmonaires (AP) distales. Les thérapies actuelles spécifiques de l'HTAP ciblent essentiellement la balance vasoconstriction/vasodilatation et ne sont pas curatives, laissant la transplantation pulmonaire comme seule option thérapeutique. Face à ce constat, il est devenu une priorité d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans le but de faire régresser le remodelage vasculaire. L'introduction du premier agent « anti-remodelant », le Sotatercept, semble promoteur, néanmoins ses effets secondaires indésirables graves justifient de poursuivre nos études visant à mieux comprendre la physiopathologie de la maladie; un prérequis à l'élaboration de nouveaux outils thérapeutiques. Le remodelage vasculaire est largement attribué à une survie accrue et à une prolifération excessive des cellules musculaires lisses (CML) de l'AP (CMLAP), phénotype ressemblant à celui des cellules cancéreuses. Ce phénotype anormal est entretenu par une dérégulation épigénétique et métabolique (glycolyse et biosynthèse des lipides). L'acétyl-CoA, produit via la glycolyse, occupe une position critique au carrefour du métabolisme et de la dynamique de la chromatine. En effet, l'acétyl-CoA sert de précurseur clé pour dans la biosynthèse lipidique dans le cytoplasme alors que sa disponibilité dans le noyau favorise l'acétylation des histones médiée par les histones acétyltransférases (HAT) et par conséquent l'activation de la transcription génique. L'acétyl-CoA est synthétisé à partir du clivage du citrate par l'enzyme ATP Citrate Lyase (ACLY). Du fait de sa localisation nucléocytoplasmique, ACLY produit l'acétyl-CoA dans ces deux compartiments. Dans divers types de tumeurs, l'activité et l'expression d'ACLY sont anormalement élevées et son inhibition diminue la progression tumorale. Compte tenu du rôle crucial d'ACLY à l'interface du métabolisme et de l'épigénétique et des similitudes entre le cancer et l'HTAP, ***nous avons émis l'hypothèse qu'ACLY contribue au remodelage vasculaire pulmonaire en HTAP en favorisant la prolifération et la résistance à l'apoptose des CMLAP.*** Dans notre étude nous avons démontré une surexpression/activité d'ACLY dans les tissus pulmonaires et dans les CMLAP de patients HTAP ainsi que dans notre modèle expérimentale d'HTAP le Sugen/Hypoxie (Su/Hx). L'inhibition moléculaire (siARN) et pharmacologique (BMS) d'ACLY dans les CMLAP-HTAP a entrainé une diminution de leur prolifération, de leur survie et de leur migration. Ces effets ont été associé à une réduction de la glycolyse et de la biosynthèse des lipides ainsi qu'une diminution de nombreux gènes impliqués dans la progression du cycle cellulaire et de la synthèse de lipides constaté grâce à une approche transcriptomique par séquençage des ARN. Au niveau nucléaire, l'inhibition d'ACLY s'est traduit par une hypoacétylation des histones due à une baisse des niveaux d'acétyl-CoA nucléaire. A l'aide de la littérature et de la bio-informatique, nous sommes parvenus à identifier la HAT GCN5 et le facteur de transcription FOXM1 comme étant des facteurs impliqués dans le contrôle de l'expression génique par ACLY. D'un point de vue translationnel, nous avons montré qu'un inhibiteur pharmacologique d'ACLY (BMS) améliorait les paramètres hémodynamiques et diminuait le remodelage vasculaire pulmonaire dans un modèle de rat Su/Hx mimant la pathologie. En complément, nous avons montré chez la souris que l'inactivation d'*Acly* ciblée aux CML prévenait et corrigeait les anomalies vasculaires pulmonaires provoquées par l'exposition aux Su/Hx. Pour finir, les résultats préliminaires obtenus dans un modèle ex-vivo de culture de tranches de poumon humain semblent confirmer les effets bénéfiques de l'inhibition d'ACLY sur le remodelage pulmonaire. En conclusion, par une approche multidisciplinaire, nous avons démontré qu'ACLY jouait un rôle clé dans le processus de remodelage vasculaire pulmonaire en HTAP et que son inhibition constitue une avenue thérapeutique prometteuse. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a complex, progressive and fatal disease, clinically defined by the presence of a mean pulmonary arterial pressure greater than 20mmHg at rest, resulting from sustained vasoconstriction and significant pulmonary vascular remodeling of the distal pulmonary arteries (PA). Current specific therapies for PAH mainly target the vasoconstriction/vasodilation balance and are not curative, leaving lung transplantation as the only therapeutic option. Given this observation, it has become a priority to identify new therapeutic targets in order to reverse vascular remodeling. The introduction of the first "anti-remodeling" agent, Sotatercept, seems promising, however its serious adverse side effects justify continuing our studies aimed at better understanding the pathophysiology of the disease, a prerequisite for the development of new therapeutic tools. Vascular remodeling is largely attributed to increased survival and excessive proliferation of PA smooth muscle cells (SMCs) (PASMCs), a phenotype resembling that of cancer cells. This abnormal phenotype is maintained by epigenetic and metabolic (glycolysis and lipid biosynthesis) dysregulation. Acetyl-CoA, produced via glycolysis, occupies a critical position at the crossroads of metabolism and chromatin dynamics. Indeed, acetyl-CoA serves as a key precursor for lipid biosynthesis in the cytoplasm while its availability in the nucleus promotes histone acetylation mediated by histone acetyltransferases (HATs) and consequently activation of gene transcription. Acetyl-CoA is synthesized from the cleavage of citrate by the enzyme ATP Citrate Lyase (ACLY). Due to its nucleocytoplasmic localization, ACLY produces acetyl-CoA in both compartments. In various tumor types, ACLY activity and expression are abnormally elevated, and its inhibition decreases tumor progression. Given the crucial role of ACLY at the interface of metabolism and epigenetics and the similarities between cancer and PAH, ***we hypothesized that ACLY contributes to pulmonary vascular remodeling in PAH by promoting proliferation and resistance to apoptosis of PASMCs.*** In our study, we demonstrated an overexpression/activity of ACLY in lung tissues and PAMSCs of PAH patients as well as in our experimental PAH model, Sugen/Hypoxia (Su/Hx). Molecular (siRNA) and pharmacological (BMS) inhibition of ACLY in PAMSCs-PAH resulted in a decrease in their proliferation, survival, and migration. These effects were associated with a reduction in glycolysis and lipid biosynthesis as well as a decrease in many genes involved in cell cycle progression and lipid synthesis observed using a transcriptomic approach by RNA sequencing. At the nuclear level, ACLY inhibition resulted in histone hypoacetylation due to a decrease in nuclear acetyl-CoA levels. Using literature and bioinformatics, we were able to identify the HAT GCN5 and the transcription factor FOXM1 as factors involved in the control of gene expression by ACLY. From a translational perspective, we showed that a pharmacological inhibitor of ACLY (BMS) improved hemodynamic parameters and decreased pulmonary vascular remodeling in a Su/Hx rat model mimicking the pathology. In addition, we showed in mice that SMC-targeted inactivation of *Acly* prevented and corrected pulmonary vascular abnormalities caused by Su/Hx exposure. Finally, preliminary results obtained in an ex-vivo model of human lung slice culture seem to confirm the beneficial effects of ACLY inhibition on pulmonary remodeling. In conclusion, through a multidisciplinary approach, we demonstrated that ACLY plays a key role in the pulmonary vascular remodeling process in PAH and that its inhibition constitutes a promising therapeutic avenue.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Dans le cerveau adulte, la signalisation liée à l’adénosine facilite ou inhibe la libération vésiculaire de neurotransmetteurs suite à l’activation des récepteurs de l’adénosine de type 2A ou 1 (A2AR ou A1R), respectivement. Cependant, son rôle dans le développement est mal connu. Au cours de ma thèse, j’ai étudié le rôle de la signalisation adénosine dans la synaptogenèse GABAergiques de l’hippocampe. Nous avons mis en évidence (i) une sécrétion activité-dépendante accrue d’adénosine et d’ATP pendant la période de synaptogenèse, (ii) un pic d’expression de l’enzyme limitant la formation de l’adénosine à partir de l’ATP extracellulaire, l’ecto-5’-nucleotidase, aux synapses pendant cette période critique, et (iii) un pic d’expression péri/post- synaptique du A2AR concomitant de la période de synaptogenèse. Cette expression développementale des molécules clés de la signalisation adénosine dépendante du A2AR corrélait avec un rôle de ce récepteur dans la stabilisation des synapses GABAergiques naissantes, une régulation restreinte à la période de synaptogenèse. De plus, la suppression de A2AR par une approche shRNA dans des neurones isolés conduisait à une perte de synapses GABAergiques équivalente à celle observée après un blocage pharmacologique de l’activité du A2AR, signifiant que la stabilisation synaptique médiée par le A2AR est un processus « cellule autonome » indépendant de l’activité du réseau neuronal et qu’elle requiert l’activation du A2AR dans la cellule post-synaptique.L’ATP et l’adénosine sont secrétés par la glie et les neurones ; cependant, nous avons montré in vitro que la libération neuronale activité-dépendante suffit à stabiliser les synapses GABAergiques naissantes. En utilisant la vidéomicroscopie sur cellules vivantes, nous avons montré que la signalisation adénosine stabilise les synapses actives. Puis, nous avons caractérisé le mécanisme moléculaire sous-jacent. Nous rapportons la contribution de la cascade adénylate cyclase/adénosine monophosphate cyclique/protéine kinase A et nous avons identifié une ciblé clé, la géphrine, la molécule d’ancrage postsynaptique des récepteurs GABAA. Enfin, nous avons mis en évidence que la stabilisation de l’élément présynaptique requiert probablement le complexe trans-synaptique Slitrk3-PTPd.Puisque le GABA exerce une fonction similaire au cours du développement et que le GABA et l’adénosine sont co-libérés à certaines synapses, j’ai étudié l’interaction entre ces deux voies de signalisation. Mes résultats favorisent l’hypothèse que la signalisation GABA, en activant la calcium-calmoduline, converge vers la signalisation adénosine en potentiant les adenylates cyclases sensibles au calcium. Mon travail m’a permis de proposer que, au cours d’une période clé du développement, les A2ARs postsynaptiques agissent comme des senseurs de l’activité des terminaisons présynaptiques GABAergiques pour stabiliser les synapses actives. En absence d’activité et donc de libération d’adénosine/ATP, les synapses seraient éliminées. / In the adult brain, adenosine signaling facilitates or inhibits neurotransmitter vesicular release mainly through activation of type 2A or 1 adenosine receptors (A2AR or A1R), respectively. However, its role in development remains to be elucidated. During my PhD, I addressed the role of A2AR-mediated signalling in GABAergic synaptogenesis in the hippocampus. We found (i) a larger activity-dependent release of ATP and adenosine during the period of synaptogenesis in the hippocampus, (ii) a peak of expression of the ecto-5’-nucleotidase, the rate-limiting enzyme for the formation of adenosine from extracellular ATP in synapses during this critical period, and (iii) a peak of peri/post-synaptic expression of A2AR concomitant with the period of synaptogenesis. This developmental expression of the key molecules of the adenosine A2AR signalling pathway correlated with a role of A2AR in the stabilization of nascent GABA synapses, a regulation restricted to the period of synaptogenesis. Furthermore, suppressing A2AR with a shRNA approach in isolated neurons led to a loss of synapses equivalent to that seen upon A2AR activity blockade, reporting that the A2AR-mediated synapse stabilization is a cell autonomous process that requires A2AR activation in the postsynaptic cell. ATP/adenosine can be secreted by both glia and neurons; however, we found that activity-dependent release of neuronal adenosine is sufficient to stabilize newly formed GABA synapses in vitro. Using live cell imaging, we showed adenosine signalling stabilizes active synapses. We then characterized the molecular mechanism downstream postsynaptic A2AR. We report the contribution of adenylyl cyclase/cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A signalling cascade and we identified a key target, the postsynaptic scaffolding molecule gephyrin. We further showed the A2AR-mediated stabilization of the presynaptic compartment most probably requires the trans-synaptic Slitrk3-PTPd complex. Since GABA exerts a similar function during development and GABA and adenosine are co-released at some synapses, I further investigated the interplay between these two pathways. My results support the hypothesis that GABA signalling converge onto the adenosine signalling pathway by potentiating calcium-sensitive adenylyl cyclases through the activation of calmodulin.Altogether these results let us propose that, during a key developmental period, postsynaptic A2ARs act as sensors of the activity of GABAergic presynaptic terminals to stabilize active nascent GABAergic synapses. In absence of activity and therefore secretion of adenosine/ATP, synapses will be eliminated.

Étant donné l'émergence de résistance aux molécules antifongiques chez les mycètes pathogènes, un problème qui ne cesse de prendre de l'ampleur, la désaminase de cytosine Fcy1, codée par le gène *FCY1 chez Saccharomyces cerevisiae* et avec laquelle le médicament flucytosine interagit, est à l'étude dans ce projet. Pour mieux comprendre les bases moléculaires de la résistance aux antifongiques en lien avec Fcy1, le principal objectif de ce projet est de caractériser structurellement et fonctionnellement cette désaminase de cytosine de type sauvage et certains mutants de celle-ci. Des orthologues de type sauvage ainsi qu'un mutant de cette protéine, retrouvés chez plusieurs mycètes pathogènes, sont aussi à l'étude dans ce projet de recherche. Tout d'abord, les structures de Fcy1 et ses orthologues chez *Aspergillus niger*, *Candida albicans*, *Candida glabrata* et *Cryptococcus neoformans* ont été résolues. Certaines de ces structures ont permis d'observer les enzymes dans des conformations ouvertes, permettant l'entrée du substrat au site actif. En effet, certaines structures permettent l'observation du segment en C-terminal de ces protéines qui se replie et se place de façon à médier l'entrée au site actif de celles-ci. La structure d'un mutant inactif de Fcy1 a aussi été résolue, montrant comment le remplacement d'un résidu méthionine par un résidu tryptophane force l'enzyme à rester dans une conformation ouverte, cessant ainsi l'activité de celle-ci. De plus, des collègues du laboratoire Landry, qui ont étudié l'expression et l'activité de Fcy1 et de plusieurs mutants, *in-vivo* chez *S. cerevisiae*, ont rapporté que la coexpression de mutants inactifs de cette enzyme menait à la restauration de l'activité enzymatique. Une hypothèse suggérant la formation d'hétérodimères de mutants inactifs de Fcy1, qui rétablissent l'activité de la protéine une fois assemblés, a été mise à l'épreuve par la résolution de la structure d'un de ces hétérodimères constitué de mutants différents de Fcy1. Des mesures d'activité catalytique des protéines à l'étude ont aussi été faites, avec la cytosine et la 5-Fluorocytosine comme substrats, pour mesurer les paramètres de cinétique enzymatique de celles-ci. Aussi, des mesures de température de fusion (T$_\textup{m}$) ont été prises pour les protéines afin d'évaluer leur stabilité. Éventuellement, ce projet permettra de mieux comprendre comment la résistance à la 5-Fluorocytosine se présente lorsque Fcy1, ou un de ses orthologues est impliqué dans ce phénomène via des mutations. Ainsi, ce projet pavera la voie pour davantage de recherches qui visent à mieux comprendre cette problématique chez des pathogènes fongiques émergents, qui possèdent un orthologue de Fcy1.