Les protéines associées aux microtubules (MAP) de structures, telles que celles appartenant à la famille des MAP1 sont connues pour contrôler la stabilité et la dynamique des microtubules (MTs). Elles sont aussi connues pour interagir avec des protéines post-synaptiques telles que les récepteurs GABAergique ou glutamatergique. Cependant, leur rôle pré-synaptique dans la libération de neurotransmetteurs a été très peu étudié. Dans cette thèse, j'utilise l'avantage du modèle Drosophila melanogaster dans lequel il n'y a qu'un seul homologue des MAP1 des vertébrés, nommé Futsch. J'ai étudié la fonction de Futsch à la jonction neuromusculaire (JNM) de larve, où cette protéine n'est trouvée que dans la partie pré-synaptique. Ici, j'ai montré qu'en plus de sa fonction connue sur la morphologie de la JNM (Roos et al., 2000; Gogel et al., 2006), Futsch est également important pour la physiologie de la JNM, par le contrôle de la libération de neurotransmetteurs ainsi que de la densité des zones actives (ZAs). J'ai montré que l'effet physiologique de Futsch n'est pas la conséquence de l'altération du cytosquelette de MTs ou d'un défaut de transport axonal, mais doit être la conséquence d'un effet local de Futsch à la terminaison synaptique. J'ai utilisé la microscopie d'éclairage structuré 3D (3D-SIM) pour étudier plus précisément la localisation de Futsch et des MTs au niveau de la ZA. Futsch et les MTs se trouvent presque toujours à proximité des ZAs, avec Futsch en position intermédiaire entre les MTs et les ZAs. En utilisant la technique de « proximity ligation assays », j'ai aussi démontré la proximité fonctionnelle de Futsch avec Bruchpilot un composant de la ZA, ce qui n'est pas le cas des MTs. En conclusion, mes données sont en faveur d'un modèle pour lequel Futsch stabilise localement les ZAs, en renforçant leur lien avec le cytosquelette de MTs sous-jacent. / Structural microtubule associated proteins like those belonging to the MAP1 family are known to control the stability and dynamics of microtubules (MTs). They are also known to interact with postsynaptic proteins like GABA or glutamate receptors. However, their presynaptic role in neurotransmitter release was barely studied. Here, we took advantage of the Drosophila model in which there is only one MAP1 homologue, called Futsch. We studied the function of Futsch at the larval neuromuscular junction (NMJ), where this protein is found presynaptically only. Here, we show that, in addition to its known function on NMJ morphology (Roos et al., 2000; Gogel et al., 2006), Futsch is also important for NMJ physiology, by controlling neurotransmitter release as well as active zone density. We show that this physiological effect of Futsch is not the consequence of disrupted microtubule bundle and disrupted axonal transport, but must be the consequence of a local effect of Futsch at the synaptic terminal. We used 3D-Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) to further study the localization of Futsch and MTs with respect to active zones. Both Futsch and MTs are almost systematically present in close proximity active zones, with Futsch being localized in-between MTs and active zones. Using proximity ligation assays, we further demonstrated the functional proximity of Futsch, but not MTs, with the active zone component Bruchpilot. Altogether our data are in favor of a model by which Futsch locally stabilizes active zones, by reinforcing their link with the underlying MT cytoskeleton.

AtMAP65-4 est une protéine associée aux microtubules appartenant à la famille des AtMAP65s qui compte 9 membres identifiés chez Arabidopsis thaliana. Ces protéines appartiennent à une famille conservée au cours de l'évolution, les MAP65s. Ainsi, des protéines homologues sont présentes chez de mammifères (PRC1), chez la levure (Ase1p) ou chez la drosophile (FEO). Jusqu'ici l'étude des propriétés moléculaires et fonctionnelles des AtMAP65s s'est portée essentiellement sur l'étude d'AtMAP65-1 et AtMAP65-5. La principale caractéristique de ces protéines est d'induire la formation de faisceaux de microtubules in vitro. La distribution des AtMAP65s in vivo est très régulée, celle-ci sont localisées avec des réseaux des microtubules bien définis. Ainsi, leur rôle supposé est de mettre en place ces réseaux puis de participer à leur maintient. La localisation d'AtMAP65-4 apparait comme très intéressante car elle est strictement associée avec les microtubules du fuseau mitotique. D'après les résultats obtenus au cours de ce travail, nous avons suggéré que la fonction in vivo d'AtMAP65-4 est de participer à la mise en place et au maintient des microtubules en faisceaux dans les fibres kinétochoriennes lors de la division cellulaire. Lors d'une étude in vitro nous avons montré qu'AtMAP65-4 modifie les paramètres dynamiques de polymérisation des microtubules. Outre sa capacité à former des faisceaux, AtMAP65-4 permet une croissance régulière des microtubules au sein des faisceaux qu'elle induit. Le mécanisme d'action de la MAP à l'échelle moléculaire a été analysé à travers une étude bioinformatique où nous avons modélisé l'activité d'AtMAP65-4. Les données obtenues montrent qu'AtMAP65-4 peut bloquer les évènements de dépolymérisation des microtubules. Par ailleurs, l'activité d'AtMAP65-4 pourrait être régulée in vivo par des modifications post traductionnelles. En effet, nous avons montré et étudié l'effet de la phosphorylation d'AtMAP65-4 par les kinases Auroras. Cette phosphorylation pourrait être impliquée dans la régulation de l'activité d'AtMAP65-4 au cours de la mitose.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Lors de leur différenciation, les neurones développent deux types de prolongements cytoplasmiques, dendrites et axones. L'élaboration de ces prolongements est médiée par les éléments du cytosquelette, plus particulièrement, les microtubules et les microfilaments d'actine (actine-F). L'expression de la protéine associée aux microtubules-2 (MAP-2) est nécessaire au développement des neurites mineures, les premiers prolongements cytoplasmiques émis par un neurone. Ceux-ci n'ont pas une identité dendritique ou axonale. Par la suite, l'expression de MAP2 est nécessaire au développement et au maintien des dendrites. L'expression de MAP2 est régulée par épissage alternatif au cours de la différenciation neuronale. Il existe quatre isoformes de la protéine MAP2, MAP2a, MAP2b, MAP2c et MAP2d. MAP2b et MAP2c sont les isoformes les mieux caractérisées. Elles peuvent être subdivisées en deux domaines: un domaine de liaison aux microtubules situé en C-terminal et un domaine de projection en N-terminal. Le domaine de liaison aux microtubules est responsable de l'interaction de MAP2 avec les microtubules alors que le rôle du domaine de projection n1est toujours pas clairement défini. MAP2c est exprimée dans les neurones immatures alors que MAP2b est présente dans les neurones immatures et matures. Dans les neurones immatures, ces deux isoformes se retrouvent dans les neurites mineures et elles sont ciblées préférentiellement dans les dendrites au cours de la différenciation neuronale. Le rôle respectif de MAP2b et MAP2c dans l'élaboration de prolongements cytoplasmiques par un neurone demeure inconnu. MAP2b et MAP2c diffèrent par la présence d'une séquence additionnelle de 1372 acides aminés dans le domaine de projection de MAP2b. L'insertion d'une séquence aussi importante dans le domaine de projection de MAP2b indique que ce domaine joue un rôle important. Le but de la présente étude consiste à mieux comprendre le rôle de cette séquence dans la fotmation de prolongements cytoplasmiques. Pour cette analyse fonctionnelle, nous avons produit six formes tronquées de MAP2b qui contiennent des délétions dans le domaine de projection de MAP2b. Ces formes tronquées de MAP2b ont été exprimées dans les cellules ovariennes Spodoptera frugiperda (Sf9). En effet, ce système cellulaire est très intéressant puisque nous avons démontré que l'expression de MAP2b et MAP2c dans ces cellules résulte en la formation de prolongements cytoplasmiques. Cependant, ces deux isoformes de MAP2 induisent des patterns distincts de formation de prolongements cytoplasmiques. 60% des cellules qui expriment MAP2c développent des prolongements alors que 14% des cellules qui expriment MAP2b ont des prolongements. De plus, les cellules qui expriment MAP2c ont la tendance à développer des prolongements multiples alors que celles qui expriment MAP2b présentent un seul prolongement. Nos présents résultats démontrent que le domaine de projection de MAP2b a un effet inhibiteur sur la capacité du domaine de liaison aux microtubules à induire la formation de prolongements cytoplasmiques. En effet, 53% des cellules qui n'expriment que le domaine de liaison aux microtubules ont des prolongements en comparaison à 14% des cellules qui expriment MAP2b. De plus, l'expression de trois formes tronquées de MAP2b qui ont une délétion partielle de la séquence additionnelle de 1372 acides aminés induit un plus grand pourcentage de cellules avec prolongements (27%, 31 % et 41 % ). Toutefois, la séquence commune à MAP2c et MAP2b qui est située à l'extrémité 5' du domaine de projection semble favoriser la formation de plusieurs prolongements puisque sa délétion résulte en un plus faible pourcentage de cellules avec des prolongements multiples. Nos résultats suggèrent donc que l'insertion de la séquence additionnelle de 1372 acides aminés dans le domaine de projection de MAP2b diminue sa capacité à induire la formation de prolongements cytoplasmiques. Étant donné que MAP2b et MAP2c sont capables de se lier à l'actine-F et aux microtubules, nous avons examiné la distribution de ces deux éléments du cytosquelette dans les cellules Sf9 qui expriment les différentes formes tronquées de MAP2b. Toutes les formes tronquées de MAP2b induisent la formation de faisceaux de microtubules à l'exception des formes tronquées qui correspondent aux domaines de projection de MAP2c et de MAP2b. Dans les cellules qui présentent des prolongements, on note une réorganisation de l'actine-F. Dans les cellules qui expriment la forme mutante correspondant au domaine de projection de MAP2b, l'actine-F est distribuée sous forme d'un anneau sous la membrane plasmique. De plus, le domaine de projection a une distribution similaire. Ceci suggère que le domaine de projection de MAP2b interagit avec l'actine-F. Donc la séquence additionnelle de 13 72 acides aminés pourrait contenir un domaine de liaison à l'actine. En conclusion, nos résultats indiquent que MAP2b aurait une moins grande capacité que MAP2c à promouvoir la formation de neurites mais elle pourrait contribuer à leur stabilisation au cours de la différenciation neuronale par le fait qu'elle contient des domaines additionnels de liaison à l'actine.

AtMAP65-4 est une protéine associée aux microtubules appartenant à la famille des AtMAP65s qui compte 9 membres identifiés chez Arabidopsis thaliana. Ces protéines appartiennent à une famille conservée au cours de l'évolution, les MAP65s. Ainsi, des protéines homologues sont présentes chez de mammifères (PRC1), chez la levure (Ase1p) ou chez la drosophile (FEO). Jusqu'ici l'étude des propriétés moléculaires et fonctionnelles des AtMAP65s s'est portée essentiellement sur l'étude d'AtMAP65-1 et AtMAP65-5. La principale caractéristique de ces protéines est d'induire la formation de faisceaux de microtubules in vitro. La distribution des AtMAP65s in vivo est très régulée, celle-ci sont localisées avec des réseaux des microtubules bien définis. Ainsi, leur rôle supposé est de mettre en place ces réseaux puis de participer à leur maintient. La localisation d'AtMAP65-4 apparait comme très intéressante car elle est strictement associée avec les microtubules du fuseau mitotique. D'après les résultats obtenus au cours de ce travail, nous avons suggéré que la fonction in vivo d'AtMAP65-4 est de participer à la mise en place et au maintient des microtubules en faisceaux dans les fibres kinétochoriennes lors de la division cellulaire. Lors d'une étude in vitro nous avons montré qu'AtMAP65-4 modifie les paramètres dynamiques de polymérisation des microtubules. Outre sa capacité à former des faisceaux, AtMAP65-4 permet une croissance régulière des microtubules au sein des faisceaux qu'elle induit. Le mécanisme d'action de la MAP à l'échelle moléculaire a été analysé à travers une étude bioinformatique où nous avons modélisé l'activité d'AtMAP65-4. Les données obtenues montrent qu'AtMAP65-4 peut bloquer les évènements de dépolymérisation des microtubules. Par ailleurs, l'activité d'AtMAP65-4 pourrait être régulée in vivo par des modifications post traductionnelles. En effet, nous avons montré et étudié l'effet de la phosphorylation d'AtMAP65-4 par les kinases Auroras. Cette phosphorylation pourrait être impliquée dans la régulation de l'activité d'AtMAP65-4 au cours de la mitose. / AtMAP65-4 is a microtubule-associated protein belonging to the AtMAP65s family that comprises 9 members identified in Arabidopsis thaliana. These proteins belong to a family conserved during evolution, MAP65s. Thus, homologous proteins are present in mammals (PRC1), in yeast (Ase1p) or Drosophila (FEO). So far the study of molecular properties and functional AtMAP65s has focused mainly on AtMAP65-1 and AtMAP65-5. The main feature of these proteins is to induce the formation of microtubule bundles in vitro. In vivo, these AtMAP65s are localized with subsets of microtubule bundles as they are suggested to play a role in establishing and maintaining these networks. From the results we obtained on AtMAP65-4 properties during this work such as the in vivo localization, biochemical properties and functional effetc on the MT polymerization, we suggested that the in vivo function of AtMAP65-4 is involved in setting up and maintaining microtubule bundles within kinetochore fibers during cell division. In vitro studies allowed us to show that AtMAP65-4 changes the dynamic parameters of microtubule. In addition to its ability to form bundles, AtMAP65-4 allows steady growth of microtubules in bundles it induces. The mechanism of action of the MAP at the molecular level was analyzed through a bioinformatics study where we modeled the activity of AtMAP65-4 and concluded that it could block the depolymerization events. Moreover, the activity of AtMAP65-4 could be regulated in vivo by post-translational modifications. Indeed, we have shown that AtMAP65-4 is phosphorylated by Aurora kinases in vitro. The effect of this phosphorylation during mitosis is under investigation.