La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurologique progressive caractérisée par des dysfonctionnements moteurs se manifestant par des tremblements, de la bradykinésie, de la rigidité musculaire ainsi que de l’instabilité posturale. Ces manifestations physiques sont causées par la dégénérescence des neurones dopaminergiques (DAergiques) de la voie nigrostriatale. Ces dysfonctions motrices sont généralement précédées, jusqu’à 10 ans avant leur apparition, par d’autres symptômes, dont des altérations gastro-intestinales. La dégénérescence des neurones DAergiques dans le plexus myentérique serait à l’origine des dysfonctions gastro-intestinales. Plusieurs problématiques associées à la MP peuvent entraver la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques. D’abord, les causes menant à l’initiation de la pathologie et la neurodégénérescence demeurent largement inconnues, et ce, malgré la mise en évidence de certains mécanismes impliqués dans la pathogenèse de la maladie, dont l’inflammation. Un second obstacle constitue le manque de biomarqueurs permettant le diagnostic précoce de la maladie au cours de son développement, puisque la pathologie se manifeste lorsque la dégénérescence atteint 60 à 70% des neurones DAergiques. Conséquemment, les traitements disponibles actuellement concernent uniquement les options thérapeutiques symptomatiques tandis qu’aucun traitement n’est disponible afin de modifier le cours évolutif du processus dégénératif amorcé plusieurs années avant le diagnostic. Ce projet doctoral s’inscrit donc dans une thématique globale ciblant plusieurs aspects de la problématique soulevée ci-dessus, en s’attardant principalement à mieux comprendre la contribution du système immunitaire innée dans la dégénérescence des neurones au niveau du plexus myentérique dans un modèle de souris parkinsoniennes. En premier lieu, nous avons caractérisé la réponse immunitaire engendrée par la neurotoxine 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6- tétrahydropyridine (MPTP) dans le plexus myentérique de souris sauvages et partiellement déficientes en immunité innée (MyD88 -/-) La découverte de l’infiltration de monocytes proinflammatoires dans le plexus myentérique nous a menés à étudier le rôle de ce type cellulaire dans l’altération des neurones DAergiques au niveau du plexus myentérique et du système nerveux central de souris traitées au MPTP. Les résultats obtenus nous ont permis de tester une nouvelle cible thérapeutique permettant de moduler la réponse inflammatoire afin de limiter les dommages neuronaux induits par la neurotoxine. / Parkinson’s disease (PD) is a progressive neurological disorder characterized by motor dysfunctions, which include tremor, muscle rigidity, postural instability and bradykinesia. The slow and progressive degeneration of dopaminergic (DAergic) neurons of the nigrostriatal pathway constitutes a key element at the origin of clinical motor manifestations. Non-motor symptoms are also observed and could preceed their motor counterparts by several years. The former include gastrointestinal problems such as delayed gastric emptying, constipation and defecatory dysfunctions. The degeneration of DAergic neurons in the myenteric plexus is at the origin of gastrointestinal impariments. Major issues encountered in PD research currently impede the development of appropriate medication. First, the factors behind PD initiation that lead to neurodegeneration remain largely unknown, despite the discovery of several mechanisms involved in its pathogenesis, notably inflammation, which has been given considerable attention in recent years. A second hurdle is the lack of biomarkers to diagnose the disease earlier in its development. Indeed, most motor symptoms are manifested when approximately 60 to 70 % of DAergics neurons are degenerated. As a result of these caveats, PD patients currently only have access to symptomatic treatment options, since no therapy is available to modify degenerative processes primed several years before diagnosis. My doctoral research project is built into a global thematic approach targeting several aspects of the issues raised above, but more specifically to investigate the role of the innate immune response and the contribution of macrophages to neuronal degeneration in the myenteric plexus in a murine model of PD. First we characterized the innate immune response occurring in the enteric nervous system secondary to 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) lesioning of wild-type and immune deficient (MyD88 -/-) mice. Our findings about proinflammatory monocytes infiltration in the myenteric plexus lead us to investigate on the role of the innate immune response relatively with neurodegeneration occurring in the central nervous system and myenteric plexus in response to MPTP. Our promising results provide us with the chance to test a new therapeutic target that modulates the innate immune response and limits MPTP-induced neuronal damages.

La galectine-3, une protéine cytosolique de l’hôte est impliquée dans la réponse immunitaire contre Leishmania major, un parasite protozoaire causant une infection cutanée. Lors d’une infection avec la souche LV39 de L. major, la galectine-3 se libère dans le milieu extracellulaire et participe au recrutement de neutrophiles au site d’infection. La galectine-3 ne semble cependant pas impliquée lors d’infections avec la souche L. major Friedlin qui possède un arrangement de saccarides différent sur ses phosphoglycans. In vitro, les deux souches de L. major sont en mesure de cliver la galectine-3, mais LV39 semble plus efficace. Différents essais ont été effectués in vivo afin de vérifier si les galectines-7 et 9 peuvent aussi avoir un rôle à jouer lors d’infection avec L. major. Alors qu’aucun effet significatif n’a pu être attribué à la galectine-9, l’absence de galectine-7 semble apporter une guérison plus rapide des lésions engendrées par L. major Friedlin. / Our recent data suggest that galectin-3, a host cytosolic protein is involved in the immune response against the Leishmania major strain LV39, which induces cutaneous infection. Following infection with this parasite, galectin-3 is released in the extracellular space and plays a role in neutrophil recruitment. In contrast, in another L. major strain called Friedlin, which expresses a different glycan structure on the phosphoglycans, galectin-3 has no impact on the host immune response and disease outcome. Our laboratory previously reported that L. major LV39 cleaves galectin-3. Our data suggest that both L. major strains are able to cleave galectin-3 in vivo, although the cleavage by LV39 is more efficient than that by Friedlin. We also addressed the role of galectins-7 and 9 in a murine L. major infection model. Lack of galectin-9 did not alter the pathogenesis of Leishmania infection. In contrast, lack of galectin-7 contributed to improve healing process.

Parmi les contaminants environnementaux reconnus pour leur toxicité et leur propagation à travers le monde, les métaux lourds sont certainement d'une première préoccupation. Des études démontrent que les métaux lourds peuvent altérer différents systèmes dont le système immunitaire. Ils peuvent induire des effets immunomodulateurs qui pourront avoir comme conséquences, l'augmentation de la susceptibilité à des agents infectieux, l'apparition de maladies néoplasiques et de maladies auto-immunes. Afin de se protéger de cette agression, les cellules immunitaires induisent des thiols (cystéines, glutathion, métalloprotéines) qui sont des molécules capables de neutraliser les métaux en s'y liant et ainsi protéger l'organisme des effets néfastes. La pré-activation de ces cellules augmenterait leur contenu intracellulaire en thiols et les rendrait donc plus résistantes à l'effet néfaste des métaux lourds. Dans cette étude, nous avons voulu démontrer, l'effet de la pré-activation des lymphocytes avec la concanavaline A sur la toxicité de certains métaux lourds tels que le mercure (organique et inorganique), le cadmium, le zinc et le sélénium. Nous avons mesuré la prolifération Iymphoblastique, la viabilité, l'apoptose ainsi que le niveau de thiols intracellulaires dans ces cellules pré-activées ou non pré-activées. Pour la prolifération lymphoblastique, les cellules pré-activées ont été significativement plus résistantes que les cellules au repos pour les deux formes de mercure, le cadmium et le zinc. Le niveau de thiols a été significativement augmenté chez les lymphocytes pré-activés de même que la viabilité, alors que l'apoptose a été augmentée dans les lymphocytes pré-activés par rapport à leur contrôle respectif en présence de mercure inorganique, de zinc et de sélénium. Les résultats suggèrent que la pré-activation des lymphocytes entraîne une augmentation du niveau de thiols intracellulaires leur procurant une meilleure protection contre l'effet néfaste des métaux lourds.

Le cancer superficiel de la vessie (CSV) est caractérisé par un taux de récidive élevé (60%). L’immunothérapie non-spécifique au BCG est actuellement le traitement le plus utilisé pour contrer les récidives du CSV. Un vaccin ciblant spécifiquement un antigène tumoral pourrait être plus efficace que le traitement BCG. Nous avons montré que l’antigène tumoral MAGE-A9 est exprimé dans 63% des tumeurs superficielles et que son expression était associée à la récidive et à la progression. Cette étude visait à mieux caractériser l’immunogénicité de MAGE-A9 en identifiant les épitopes reconnus par les lymphocytes T CD4+ et en analysant la séroprévalence anti-MAGE-A9 chez des patients atteints de CSV. Des peptides candidats, identifiés in silico, ont été testés en essais de prolifération avec des T CD4+ de souris transgéniques HLA-A2/DR1 présensibilisées à l’antigène. Pour analyser la séroréactivitié anti-MAGE-A9, la protéine a été produite et purifiée à partir du système d’expression Baculovirus. Les résultats obtenus et les réactifs développés au cours de ce travail seront utiles pour l’élaboration d’une immunothérapie contre le CSV.

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Les objectifs de ce projet étaient d'identifier les propriétés immunomodulatrices de produits obtenus par la fermentation du lactosérum à l'aide de souches sélectionnées de Lactobacillus kefiranofaciens développées par la compagnie Technologies BiolActis lnc. Différentes préparations d'une matrice protéique malléable (MPM), contenant des substances solubles et des bactéries ont été générées par fermentation et leurs effets sur les macrophages et les cellules épithéliales intestinales ont été évalués in vitro par analyse de la production de cytokines inflammatoires ainsi que l'étude des voies de signalisation intracellulaire impliquées. Nous avons aussi vérifié l'efficacité anti-inflammatoire in vivo des MPMs et de la souche bactérienne lors de colites expérimentales aigues chez des animaux afin d'identifier les cytokines et cellules suppressives impliquées. Des groupes de souris ont été traitées simultanément ou de façon préventive avec des produits choisis afin d'en vérifier les effets anti-inflammatoires lors de l'induction de la colite expérimentale par le sulfate de dextran. De nombreux paramètres biologiques et immunologiques ont été évalués, tels que le poids, le taux d'hématocrite, la densité du côlon, les niveaux de production de cytokines par des tests ELISA ou par RT-PCR en temps réel ainsi que plusieurs immunomarquages des diverses populations lymphocytaires dans les tissus intestinaux analysés par cytofluorométrie. Les résultats obtenus in vitro indiquent que les produits de fermentation du lactosérum modulent la production de cytokines macrophagiques pro-inflammatoires et anti-inflammatoires. Certains produits de fermentation augmentent la production de l'IL-6 induite par le PEP ou diminuent la production de la PGE2 sans affecter significativement la production de l'IL-10. Ces produits exercent leurs effets surtout par l'activation des voies dépendant des MAPK p38 et ERK1/2 ainsi que de la COX-2. La souche bactérienne R2C2 induit aussi bien la production d'IL-6 que celle de l'IL-10 chez les macrophages. Tous les produits de fermentation ont diminué la production de la chimiokine IL-8 par les cellules épithéliales intestinales impliquées dans l'induction de la réponse inflammatoire. Lors de la colite expérimentale induite par le DSS, l'administration simultanée de MPM a corrigé la perte de poids des animaux et rétablit la perte de lymphocytes B dans les tissus épithéliaux. L'utilisation préventive du MPM et de la bactérie R2C2 a empêché l'anémie induite par le DSS mais a aggravé la perte de poids et l'inflammation du côlon malgré la production accrue d'IL-10 et la stimulation de lymphocytes T suppresseurs. Ces effets ont été accompagnés de l'activation d'une nouvelle classe de lymphocytes, les Th17. Les effets anti-inflammatoires semblent plus intéressants lors d'une utilisation simultanée, suggérant la prise de ces produits lors de troubles gastro-intestinaux légers. D'autre part, les modifications dans les conditions de production pourraient expliquer les différences observées dans l'efficacité anti-inflammatoire des produits. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Colite, DSS, Inflammation, Intestin, Lactobacilles, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactosérum, IL-6, IL-10, IL-17, IL-23, Macrophages, PGE-2, TNP-α.

Le facteur d'inhibition de la migration des macrophages (MIF) joue un rôle important dans la régulation du système immunitaire inné et adaptatif. Le MIF est impliqué dans plusieurs maladies inflammatoires chroniques dû à sa capacité à induire la sécrétion du facteur nécrosant tumoral (TNF-a) et de l'interleukine-12 (IL-12), en plus de favoriser l'expression des récepteurs de type Toll (TLR) 4 chez les macrophages. Paradoxalement, la neutralisation du MIF augmente l'activation des lymphocytes T cytotoxiques et diminue la réponse humorale in vivo qui sont des résultats inattendus considérant le rôle du MIF comme pro-inflammatoire et inducteur d'IL-12. Étant donné que la sécrétion de MIF est induite chez les souris BALB/c infectées avec Plasmodium chabaudi adami (DK) et que la résolution de cette infection nécessite une réponse Th1 couplée à une production d'IFN-y, nous avons évalué l'effet de la déficience en MIF sur la cinétique d'infection ainsi que sur l'activation des lymphocytes CD4+. Nos résultats montrent un meilleur contrôle de l'infection avec Plasmodium chabaudi adami (DK) chez des souris déficientes en MIF (MIF/KO), caractérisé par un pic et une parasitémie cumulative significativement plus faible. D'autre part, une anémie plus modérée, déterminée par une plus faible expression des précurseurs érythroïdes et des réticulocytes a aussi été mesurée chez des souris MIF/KO lors de l'infection. Au jour 4 post-infection, le pourcentage et le nombre absolu de cellules CD4+ spléniques activées était plus important chez les souris MIF/KO, de plus, ces cellules sécrétaient plus d'IFN-y, moins d'IL-10 et d'IL-4. De manière intéressante, la production précoce d'IL-4 par une population des cellules spléniques non B et non T (possiblement des basophiles) a été fortement inhibée chez les souris MIF/KO lors de l'infection. Une observation collatérale dans notre étude a été la surexpression du facteur de transcription T-bet chez des cellules T CD4 + naïves déficientes en MIF. Étant donné que les lymphocytes CD4+ déficients en MIf sécrètent plus d'IFN-y et moins d'IL-4 suite à leur stimulation in vitro, nos résultats suggèrent que le MIF module la capacité des lymphocytes CD4+ à sécréter des cytokines de type Th1. De plus, elle suggère aussi la présence d'une corrélation entre l'expression plus forte de T-bet et le phénotype Th1 accentué chez les lymphocytes CD4+ déficients en MIF. Par contre, cette régulation n'impliquerait pas la voie des récepteurs TLR étant donné qu'aucune modulation de ces récepteurs par le MIF n'a été observée. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : MIF, Plasmodium, IFN-y, IL-4, Lymphocyte

La production porcine joue un rôle très important dans l'économie et l'alimentation de nombreux pays. En 2010, environ 1 billion de porcs ont été produits à une échelle mondiale. Cette intensification de l'élevage rend de plus en plus difficile le maintien d'une biosécurité optimale et démontre l'importance de développer des vaccins efficaces contre les pathogènes porcins. Les vaccins conventionnels sont à base d'organismes entiers vivants atténués ou inactivés par un processus chimique. Toutefois, un regain de la virulence pour les premiers types de vaccins, résultant alors en des maladies au lieu de la protection espérée, ou encore un processus inapproprié d'inactivation et une réponse immunitaire faible pour les deuxièmes sont d'autant d'inconvénients importants auxquels les intervenants en santé animale et les éleveurs sont confrontés. Le développement de nouvelles stratégies vaccinales est donc nécessaire afin de contrecarrer les inconvénients liés à l'utilisation des vaccins conventionnels. Parmi les virus affectant les troupeaux porcins, le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (« Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus », PRRSV) demeure celui qui représente le plus gros défi. En effet, bien que le PRRSV soit bien caractérisé et que des outils de contrôle aient été mis en place, les infections par le PRRSV sont répandues dans le monde entier et les éclosions sont récurrentes. Les vaccins disponibles actuellement sur le marché ne permettent pas d'assurer une protection optimale et sécuritaire. Dans la première partie de cette thèse, nous avons proposé une alternative aux procédures vaccinales utilisées jusqu'à maintenant. Cette procédure, basée sur l'induction d'une immunité mucosale et systémique, est totalement innovatrice pour le contrôle du PRRSV. Pour cela, des vaccins sous-unitaires à base d'adénovirus recombinant (rAdVs) réplicatifs mais non disséminatifs ont été générés afin d'exprimer des protéines d'intérêt du PRRSV. Ces protéines étaient la protéine de matrice M et la glycoprotéine d'enveloppe GP5 qui est porteuse des épitopes neutralisants majeures. Différentes mutations ont été également introduites dans la GP5 (GP5m) afin d'augmenter la réponse immunitaire induite. Une stratégie de vaccination combinatoire rAdV/protéine recombinante GP5 (rGP5) a aussi été testée. Nos différentes stratégies de vaccinations ont permis de générer une réponse immunitaire spécifique chez le porc, la stratégie combinatoire rAdV/rGP5 permettant d'induire la meilleure réponse en anticorps. Cependant, suite à une infection expérimentale, les animaux ayant reçu une vaccination à base de rAdVs co-exprimant les protéines M et GP5m sont ceux chez lesquels la virémie était la plus faible. La deuxième partie de cette thèse a consisté à développer des vaccins bivalents ciblant trois pathogènes impliqués dans une entité clinique appelée complexe respiratoire porcin. Ces trois pathogènes étaient le PRRSV, le circovirus porcin de type 2 (PCV2) associé principalement au syndrome de dépérissement post-sevrage (SDPS) et Mycoplasma (M.) hyopneumoniae qui est l'agent de la pneumonie enzootique. Des vaccins à base de rAdVs non réplicatifs ont été développés afin d'exprimer des protéines d'intérêt de chacun des pathogènes. Ces protéines sont la GP5 du PRRSV, la protéine de capside (Cap) du PCV2 et la portion C-terminale de la protéine d'adhésion P97 (P97c) de M. hyopneumoniae. L'immunisation de souris par voie intramusculaire a permis de démontrer la capacité de ces différents vaccins bivalents à générer une réponse en anticorps spécifiques à chacun des antigènes. De plus, la P97c, lorsque fusionnée avec les protéines Cap ou GP5, a permis d'augmenter la réponse en anticorps dirigés contre ces protéines virales suggérant un effet immunopotentiateur de la P97c. En conclusion, ces travaux ont permis de démontrer l'efficacité d'une nouvelle stratégie vaccinale pour lutter contre le PRRSV et l'immunogénicité de vaccins bivalents contre des pathogènes d'importance chez le porc. De plus, ils suggèrent que la protéine P97c de M. hyopneumoniae pourrait avoir un effet adjuvant. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin, Circovirus porcin, Mycoplasma hyopneumoniae, Adénovirus recombinant, Protéines M et GP5, Cap, P97c, Réponse immune, Porc, Souris.

Le virus Herpétique humain 6 (HHV-6), isolé il y a 20 ans, est un agent infectieux dont l'importance médicale est de plus en plus reconnue. Il existe deux variants distincts de HHV-6; HHV-6A et HHV-6B. Ces virus possèdent des propriétés biologiques différentes, notamment leur capacité à se propager dans diverses lignées cellulaires ainsi que leur association à des conditions pathologiques spécifiques. La maladie la plus commune définie cliniquement et associée au HHV-6B est la roséole universelle infantile (exanthema subitum). Des complications sévères de greffe de moelle osseuse, de cellules souches ou d'organes solides ont également été associées avec HHV-6. Récemment, un lien potentiel entre l'infection par HHV-6A et la maladie neurologique qu'est la sclérose en plaque (MS) a également été établi. HHV-6 est un virus à ADN qui contrôle de manière étroite le processus d'infection par une expression "en cascade" des gènes viraux. Les gènes IE, étant les premiers gènes exprimés suite à l'entrée du virus dans la cellule hôte, initient et contrôlent, non seulement la replication virale, mais également l'environnement cellulaire, de manière à permettre au virus d'établir une infection persistante au sein de l'hôte. Pour ces raisons, et parce qu'il reste beaucoup à comprendre, les protéines IE1 des virus HHV-6 sont devenues le sujet de notre étude. Au cours de nos recherches, nous avons découvert que des cellules qui exprimaient HHV6-IE1 avaient une production d'ARNm d'ifn-β diminuée de 90% suivant l'activation de la voix de l'IFN-β. Nous avons observé une diminution dose-dépendante de la quantité d'IRF3 nucléaire et dimerisé en présence de IE1. De plus, nous avons montré que IE1 perturbait l'"enhanceosome" de l'IFN-β en inhibant l'activité de liaison à l'ADN de IRF3. En présence des deux protéines (IE1A et IE1B), la quantité d'IRF3 lié est drastiquement réduite, ce qui diminue l'efficacité de transcription du gène de l'ifn-β. Stimulés par ces résultats, nous avons évalué la capacité d'IEl à interférer avec la cascade de signalisation de 1TFN de type I. Nous avons déterminé qu'IElB, contrairement à IE1A, possède un rôle inhibiteur et supprime l'induction des gènes répondant à 1TFN de type I. Ceci passe par un assemblage et une liaison non conforme du complexe ISGF3 aux séquences ISRE. IE1B se lie directement à STAT2, causant sa séquestration dans le noyau, et empêchant la formation du complexe actif ISGF3. De plus, nous avons identifié le domaine inhibiteur d'IElB (270-540 a.a.). De façon intéressante, une portion de 41 a.a. de ce domaine, normalement absente de la protéine IE1A, lorsque transféré à IE1A qui, permet a cette protéine d'influencer négativement l'expression des ISGs. De manière générale, ce travail fournit une analyse plus précise du rôle des protéines IE1 en tant qu'éléments viraux capables de réguler la réponse immune durant le processus infectieux.

Le virus Herpès humain de type 6B (HHV-6B) est un virus qui infecte environ 95% de la population mondiale et qui est relativement bénin chez les personnes immunocompétentes mais dont les réactivations sont potentiellement graves chez les immunodéprimés. HHV-6B est l’agent étiologique de la roséole de l’enfant ou exanthème subit. Comme tout virus herpétique, HHV-6B a développé diverses stratégies lui permettant de moduler le système immunitaire à son avantage afin de persister au sein de son hôte. La caractérisation de nouveaux mécanismes d’évitement utilisés par HHV-6B ou l’identification de cibles immunodominantes permettraient de mettre en place de nouvelles stratégies afin de combattre l’infection. Au cours de nos recherches, nous avons identifié que la protéine de tégument U54 d’HHV-6B inhibe la synthèse d’interleukine-2 (IL-2). Nous avons déterminé la voie de signalisation de la calcineurine (CaN) / NFAT comme étant le facteur antagonisé par U54 et caractérisé le mécanisme aboutissant à cette inhibition. De plus, en nous basant sur ces résultats, nous avons testé l’impact d’une abrogation de la voie CaN/NFAT par U54 sur la progression de cellules de cancer du sein. Nous avons démontré que l’expression d’U54 provoque une baisse significative de la proliferation de cellules de cancer du sein MCF-7. Ces résultats ont fait germer l’idée du ciblage de cellules de cancer du sein exprimant la protéine U54 couplé à un protocole d’immunothérapie adoptive anti-cancéreuse. Enfin, l’immunothérapie adoptive antivirale est également un sujet d’étude qui a été abordé. Nous avons identifié des épitopes de la protéine IE1 d’HHV-6B présentés dans le contexte de trois des allèles les plus communs dans la population caucasienne : HLA-A*02, HLA-A*03 et HLA-B*07. Ceci nous a permit de perpétrer une expansion clonale de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) capables de lyser des cellules infectées qui pourraient servir à contrôler d’éventuelles réactivations virales chez des patients immunodéprimés. De manière générale, nos travaux permettent d’étendre les connaissances sur les mécanismes utilisés par HHV-6B pour contourner le système immunitaire de l’hôte mais également d’identifier des cibles permettant de développer un éventuel protocole d’immunothérapie adoptive.