Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Medicina Preventiva Animal / El circovirus porcino tipo 2 (PCV2) es un virus que tiene estrecha relación con importantes enfermedades en el ganado porcino y es por ello que ha sido de gran interés de estudio el buscar las mejores alternativas posibles para poder disminuir el impacto de este agente en la industria porcina. Una de estas alternativas es disponer de mejores vacunas contra PCV2, entregando así una eficaz protección inmunológica frente a este agente. La mayoría de las vacunas contra PCV2 poseen una formulación inyectable y aunque son eficaces, no están exentos de problemas asociados a su administración. Es por ello que resulta de gran iteres de estudio el poder evaluar la respuesta de una vacuna experimental de mucosa (oral/intranasal) contra PCV2 en un plantel porcino, midiendo la carga viral y respuesta humoral resultante de la inmunización de cerdos con esta vacuna. Material y Método: Se utilizaron 4 grupos de cerdos, un grupo control placebo, otro inmunizado con una vacuna comercial inyectable contra PCV2 (Circumvent) y los otros dos grupos fueron inmunizados con una vacuna contra PCV2 basada en extracto crudo de levadura, enriquecida con VLPs de PCV2 microencapsulada con quitosano sulfatado (QS), utilizando la vía oral/intranasal e inyectable. Se analizaron muestras sanguíneas midiendo asi la carga viral mediante qPCR y anticuerpos totales por ELISA para cada grupo de tratamiento. Resultados: La inmunización contra PCV2 bajo una formulación de microencapsulación de antígenos VLPs utilizando quitosano funcionalizado, logró ser mas eficaz en bajar la carga viral en su formato inyectable en comparación a los demás grupos. En cuanto a la generación de anticuerpos, si bien los tres grupos inmunizados tuvieron mejores resultados que el grupo placebo, la formulación comercial obtuvo diferencias significativas por sobre el resto. Conclusión: Si bien la vacuna experimental genera protección contra PCV2, no fue posible en este estudio identificar de manera certera la vía inmunológica con la cual la vacuna protege al animal. Lo mas probable es que sea mas bien por una respuesta inmune celular contra PCV2. / Porcine circovirus type 2 (PCV2) is a virus that is closely related to major diseases in pigs and it has been of great interest to study the find the best possible alternatives to reduce the impact of this agent in the industry swine. One such alternative is for better vaccines against PCV2, thus delivering an effective immune protection against this agent. Most PCV2 vaccines have an injectable formulation and while effective, are not exempt from problems associated with its administration. That is why it is of great Turistic of study to evaluate the response of an experimental vaccine mucosa (oral / intranasal) against PCV2 in a pig campus, measuring viral load and humoral response resulting from immunization of pigs with this vaccine. Material and Methods: 4 groups of pigs, a placebo control group, another immunized with an injectable commercial vaccine against PCV2 (Circumvent) and the other two groups were used were immunized with a vaccine against PCV2 based crude extract of yeast, enriched with VLPs PCV2 microencapsulated with sulfated chitosan (QS) using oral / intranasal and injectable route. blood samples were analyzed by measuring the viral load so by qPCR and total antibody by ELISA for each treatment group. Results: Immunization against PCV2 under a microencapsulation formulation VLPs antigens using functionalized chitosan, managed to be more effective in lowering the viral load in its injectable form compared to the other groups. As for the generation of antibodies, although the three immunized groups did better than the placebo group, the commercial formulation obtained significant differences over the rest. Conclusion: Although the experimental vaccine generates protection against PCV2, it was not possible in this study to accurately identify the immunological pathway with which the vaccine protects the animal. It is more likely to be due to a cellular immune response to PCV2. / Financiamiento: Proyecto Fondef No. IT13I20021.

Zugl.: Giessen, Universiẗat, Diss., 2007.

Linfection par le circovirus du pigeon (PiCV) observée régulièrement chez le jeune pigeon voyageur et de chair a été décrite dans le monde entier et est généralement considérée comme un facteur important du déclenchement du syndrome de la maladie des jeunes pigeons (YPDS). En utilisant un test sensible damplification en chaîne par polymérase (PCR), la présence de lacide désoxyibonucléique (ADN) viral du PiCV a été mise en évidence chez 13 embryons sur les 66 examinés. Par contre, aucune mise en évidence de lADN viral na été possible à partir des écouvillons de jabot prélevés chez 64 pigeons adultes nourrissant des jeunes âgés de 1 à 10 jours. LADN circoviral a également été détecté chez un nombre élevé de sujets adultes (30 sur 39 pigeons examinés) et a été le plus souvent détecté dans les organes respiratoires, incluant la trachée, le pharynx et les poumons, puis dans les tissus de la rate, des reins et du foie. Il a également été détecté dans lovaire et/ou les testicules de quelques sujets. Les tests réalisés sur des écouvillons cloacaux et pharyngés et des échantillons de sang récoltés immédiatement avant leuthanasie des pigeons adultes nont pas permis de détecter tous les oiseaux trouvés positifs lors des examens réalisés post mortem. Des tests complémentaires réalisés par PCR sur des écouvillons cloacaux prélevés séquentiellement sur 19 jeunes pigeons ont montré que 4 sujets excrétaient du virus à lâge de 15 jours pour un seul au moment du sevrage, à lâge de 28 jours. Par contre la détection de lADN viral dans les écouvillons cloacaux a atteint 100 % chez les jeunes âgés de 51 jours. Lors de la vaccination de jeunes pigeons naturellement infectés au moyen du Colombovac Paratyphus®, aucun signe clinique ni aucune différence statistique nont pu être mis en évidence entre le nombre de pigeons vaccinés et de témoins non vaccinés quant aux écouvillons et échantillons sanguins prélevés sur les oiseaux vivants et trouvés positifs par PCR, ainsi que sur les tissus examinés lors de lautopsie. Une méthode PCR quantitative basée sur la technologie SYBR Green a été développée et la validation de cette méthode sur divers échantillons tissulaires issus de jeunes pigeons présentant des symptômes du YPDS a révélé des quantités importantes de copies de génome dans certains tissus, jusque 2,88 x 10^8 copies par milligramme de foie, 5,57 x 10^8 par milligramme de rate et jusque 2,07 x 10^9 copies par milligramme de bourse de Fabricius (BF). Pour le foie, la BF et le sérum, la charge virale était significativement plus élevée chez les pigeons malades que chez les oiseaux apparemment en bonne santé. De lADN circoviral a également été mis en évidence en grande quantité dans le sperme (jusque 1,0 x 10^7 copies par éjaculat) et sur les écouvillons cloacaux prélevés chez de jeunes pigeons (jusque 3,6 x 10^10 copies par écouvillon)confirmant par un apport chiffré les observations faites lors des deux premières études sur la transmission verticale et horizontale du virus. Lanalyse de sérums de pigeons prélevés en 1991 en Belgique a montré la présence du virus six ans avant le premier diagnostic histologique. Un test dimmunofluorescence indirecte (IIF) basé sur la détection de la protéine de capside du PiCV obtenue en utilisant le système baculoviruscellules dinsecte et permettant la titration des anticorps dirigés contre la capside du PiCV a été développé. Vingt-sept des 28 sérums examinés et provenant de pigeons naturellement infectés par le PiCV, dont 4 présentaient des symptômes du YPDS, ont été trouvés positifs à des titres exprimés en logarithme de base 2 variant de 4 à 8 unités. Seul un jeune pigeon malade âgé de 4 semaines était dépourvu danticorps mesurés par IIF. Enfin, la mise au point dun vaccin plasmidique codant la protéine de capside du PiCV a été réalisée en clonant le gène ORF C1 du PiCV dans le plasmide pcDNA 3.1/H5-HIS/TOPO. Lexpression de la protéine de capside a été mise en évidence par IIF après transfection de cellules PK15. Deux groupes de 5 souris femelles, âgées de 6 à 8 semaines (BALB/c) ont été immunisées par voie intramusculaire (IM), dont un groupe vacciné avec le plasmide adjuvé par le phosphate daluminium. Après 2 et 4 immunisations les anticorps ont été mesurés par IIF et il a été noté que ladjuvant avait stimulé la réponse immunitaire de manière conséquente. Ces résultats constituent un premier pas encourageant pour lobtention dun vaccin potentiel chez le pigeon. En conclusion, limportance du mode de transmission verticale du circovirus du pigeon essentiellement via loeuf embryonné a été démontrée. Néanmoins, la plupart des jeunes sinfectent dans le colombier pendant la période de postsevrage. Les tests réalisés sur les futurs reproducteurs ne permettent pas lexclusion des pigeons adultes infectés des programmes de reproduction et rendent donc léradication du virus difficile. La vaccination au moyen du Colombovac Paratyphus® ne doit pas être considérée comme un facteur modifiant le déroulement de linfection par le PiCV. La détection de quantités relativement importantes dADN viral pourrait être corrélée au statut clinique du pigeonneau infecté par le PiCV. Le rôle de limmunité humorale spécifique devra être précisé quant à lexpression ou non de linfection. Enfin, les modalités dapplication du vaccin plasmidique, testé sur souris, doivent encore être déterminées expérimentalement chez le pigeon.

Le circovirus porcin de type 2 est responsable de la maladie d’amaigrissement du porcelet. Il est différent du circovirus porcin de type 1 qui est non pathogène. Nous disposons de peu de données pouvant expliquer pourquoi le virus PCV2 est pathogène et le virus PCV1 ne l’est pas. De plus les bases moléculaires soutenant la pathogénicité du PCV2 et l’immunodépression induite par le PCV2 sont mal comprises. Dans cette étude nous avons montré que la protéine gC1qR était capable d’interagir de façon différentielle avec les protéines de capside (Cap) de circovirus pathogène PCV2 et non pathogène PCV1. La protéine de capside de PCV1 isolée d’un porcelet issu d’un élevage était incapable d’interagir avec la protéine gC1qR. Il a été également montré que la région de la protéine Cap PCV2 impliquée dans l’interaction avec gC1qR était comprise dans les 59 acides aminés N-terminaux, région riche en arginine. Il a été également mis en évidence que les transcrits de gC1qR étaient sous-régulés in vitro et in vivo après une infection par le virus PCV2 au temps court de l’infection. Une sous-régulation de gC1qR induite par ARN interférence en cellules permissives rénales de porc PK15 n’induisait cependant ni une diminution de la réplication du virus PCV2, ni une diminution de formation de ses particules infectieuses. Ce travail apporte de nouveaux éléments pour comprendre l’adaptation des souches de circovirus porcins à leur hôte ainsi que son interaction avec les protéines de son hôte. / The porcine circovirus type 2 is the causal agent of the post-weaning multisystemic wasting syndrome. It is different from porcine circovirus type 1 which is non-pathogenic. We have little data that could explain why the PCV2 is pathogenic and PCV1 is not. The molecular basis supporting the pathogenicity of PCV2 and the induced immune-depression is misunderstood. It has been shown that the capsid protein (Cap) of the porcine circovirus was able to interact differentially with the capsid protein of the pathogenic circovirus PCV2 and nonpathogenic PCV1. Cap proteins from PCV1 virus isolated from a piglet was unable to interact with gC1qR. It has also been shown that the Cap PCV2 region involved in the interaction with gC1qR was included among the 59 N-terminal amino acids, an arginine-rich region. It was also shown that gC1qR transcripts were down-regulated in vitro and in vivo after infection with PCV2 virus at the beginning of infection. A siRNA-mediated downregulation of gC1qR in the PK15 permissive cells did not induce a modification of the replication of PCV2 virus and neither the production of infectious viral particles. This work provides new evidence for understanding the adaptation of porcine circovirus strains to their host as well as its interaction with its host proteins.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / El circovirus porcino tipo 2 (PCV-2) es un virus muy pequeño (17 nm. de diámetro), de estructura icosaédrica y con ADN circular simple. Se conoce ampliamente por ser el agente causal de una compleja lista de enfermedades multifactoriales denominadas PCVAD (del inglés, Porcine circovirus associated diseases). Entre estas, una de las más importantes en términos económicos y sanitarios para la industria porcina intensiva, es el PMWS (del inglés, Postweaning multisystemic wasting syndrome), que se caracteriza clínicamente por adelgazamiento progresivo, retraso del crecimiento y desmedro. La infección por si sola por PCV-2 es necesaria, pero no suficiente para desencadenar el cuadro clínico, existen otros factores, tanto individuales como prediales, que participan en el desarrollo del síndrome. Por lo tanto, es más común encontrar individuos infectados con una presentación subclínica, inmunocomprometidos y mayormente susceptibles a coinfecciones. En el presente estudio, se caracterizan los perfiles serológicos de 11 granjas de producción porcina, cuya ubicación geográfica es representativa de la producción a nivel nacional. Un perfil serológico es un estudio efectuado a grupos de animales de diferentes edades o etapas productivas, para detectar la presencia de anticuerpos contra algún patógeno en particular y determinar patrones de infección. De cada granja se tomaron 16 muestras de suero en 3 edades (3-4, 10 y 18-20 semanas). Cada muestra fue evaluada mediante una prueba de ELISA para la detección de anticuerpos anti PCV-2. A modo complementario, los títulos de anticuerpos a las 3 semanas fueron transformados a valores de IPMA (técnica de inmunoperoxidasa en monocapa de cultivo celular), a modo de evidenciar posible interferencia materna con la vacunación. Finalmente, se realizó una recopilación de información respecto a las granjas muestreadas y mediante un Análisis de Varianza (ANOVA) en el programa estadístico Infostat, los factores: status PRRS, vacunación, sistema y tamaño fueron analizados, a modo de establecer posibles diferencias significativas entre las granjas al considerar estos factores. Los resultados muestran un comportamiento característico de los perfiles serológicos, con un alto título de anticuerpos a las 3 semanas, los cuales disminuyen drásticamente en el tiempo, lo que sugiere un eficiente traspaso de inmunidad materna, pero se cuestiona la efectividad en la generación de anticuerpos a través de la vacunación. Además, se observa una alta presencia del fenómeno de interferencia de la inmunidad materna con la vacunación. Por último, los resultados del análisis estadístico muestran que todos los factores analizados generan diferencias significativas entre los perfiles serológicos de las granjas. El estudio permite concluir robustamente que existe evidencia serológica de PCV-2 en todas las granjas analizadas y que existen diferencias estadísticamente significativas entre ellas al considerar ciertos factores prediales, aceptándose la hipótesis de este estudio / Porcine circovirus type 2 (PCV-2) is a very small virus (17 nm of diameter), of icosahedral structure and simple circular DNA. PCV-2 is widely known to be the causative agent of several multifactorial diseases named PCVAD (Porcine circovirus asociated diseases). The most economic important disease caused by PCV-2 is the Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS), which is characterized by progressive emaciation, growth retardation and wasting. PCV-2 infection is necessary but not sufficient to trigger the clinical presentation, there are other factors, individual and predial, that are involved in the development of the syndrome. Therefore, it is more common to find individuals infected with a subclinical presentation, immunocompromised and most susceptible to coinfections. In the present study, the serological profiles of 11 pig farms were characterized, whose geographic location is representative of production at the national level. A serological profile is a study carried out on groups of animals at different ages, to detect the presence of antibodies against PCV-2, and to determine patterns of infection. From each farm, sera was collected in 3-4 weeks; 10 weeks and 18-20 weeks old pigs, obtaining 16 samples per age. Each sample was evaluated by a comercial PCV-2 ELISA test for antibody detection. Additionally, antibody titres at 3 weeks were transformed to IPMA equivalent values (inmunoperoxidase monolayer assay), in order to evidence possible maternal interference with vaccination. Also, information about farms characteristics and management such as; PRRS status, vaccination, type of production system and size, were collected. All variables were statistically analyzed in order to establish if there were significant differences between the farms when considering these factors. The results show a characteristic behavior of the serological profiles, with a high antibody titre in 3 weeks old pigs, which decrease drastically over time, suggesting an efficient transfer of maternal immunity, but the effectiveness of the vaccination to generate antibodies is questioned. In addition, there is a high presence of the phenomenon of interference of maternal immunity with vaccination. Finally, the results of the statistical analysis show that all the analyzed factors generate significant differences between the serological profiles of the farms. The study allows us to conclude robustly that there is serological evidence of PCV-2 in all farms analyzed and that there are statistically significant differences between them when considering certain property factors, accepting the hypothesis of this study / Financiamiento: Proyecto Zoetis-Favet PCV2.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El circovirus porcino tipo 2 (PCV-2), es un virus pequeño (1768 nucleótidos), ubicuo y resistente en el ambiente. PCV-2 es considerado como el agente etiológico necesario, mas no suficiente para la presentación del Síndrome multisistemico de desmedro postdestete (PMWS). Este síndrome se caracteriza por provocar una severa inmunosupresión, además de un retraso en el crecimiento de los cerdos. Una de las medidas sanitarias efectivas que se reconoce a la hora de disminuir los efectos provocados por el PCV-2 es la inmunización a través de vacunas. Estas en su mayoría son administradas de forma parenteral y han demostrado mejorar índices productivos como ganancia de peso diario y disminución de la mortalidad. En este estudio se evaluó la carga viral de PCV-2 en suero de cerdos, que fueron inmunizados con una vacuna experimental de administración oral que utiliza como agente antigénico la proteína CAP de PVC-2 versus una vacuna comercial de administración parenteral y un grupo control sin inmunizar. Los resultados indican que no existe diferencia significativa en la carga viral de los tres grupos estudiados en los distintos días de muestreo. / Porcine circovirus type 2 (PCV-2) is a small virus (1768 nucleotides), ubiquitous and resistant in the environment. PCV-2 is considered as the necessary, but not sufficient, etiologic agent for post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). This syndrome is characterizes by causing severe immunosuppression and delayed growth of pigs. One of the effective sanitary measures recognized when decreasing the effects caused by PCV-2 is immunization through vaccination. These are mostly parenterally administered and have shown to improve production rates such as daily weight gains and decreased mortality. This study evaluated the viral load of PCV-2 in serum from pigs which were immunized with and experimental oral vaccine that use the CAP protein as an antigenic agent versus a commercial vaccine for parenteral administration and a control group unimmunized. The results indicate no significant difference in viral load of the three groups during different days of testing. / Financiamiento: : Proyecto Fondef IT13120021.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / No autorizada por los autores para ser publicada a texto completo / Proyecto Fondecyt 11110135

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La producción de cerdos representa la mayor producción de carne del país, por lo tanto se hace cada vez más necesario innovar para controlar de manera preventiva las enfermedades prevalentes en los planteles. Una de estas patologías, es el síndrome de desmedro multisistémico post destete (PMWS), este síndrome es multifactorial y uno de sus causantes más importante es el circovirus porcino tipo II (PCV-2), el cual se encuentra en cerca del 100% de los planteles productivos de cerdos a nivel mundial. Esta situación ha elevado la importancia de la vacunación dentro de la producción, siendo hasta el momento la vacunación parenteral la predilecta. Aunque eficaces, las vacunas parenterales tienen ciertas desventajas, incluyendo estrés animal e inmunosupresión concomitante, además de la implicancia de procedimientos laboriosos asociados. Debido a esto, se están explorando rutas alternativas de administración de vacunas, como la oral, para inmunizar contra el PCV-2. Las vacunas orales, potencialmente suministradas en el alimento o agua bebida, representan una mejora tecnológica en el suministro de antígeno, superando los problemas relacionados con el manejo de la inyección y facilitando el reforzamiento del antígeno cuando la inmunidad de los animales está por debajo del umbral protectivo. En este estudio se prospectó el desarrollo de una vacuna oral contra PCV2, recubriendo el antígeno de la cápside viral con moléculas de quitosano, polímero natural que otorga protección frente a los efectos nocivos del sistema digestivo del cerdo, para una entrega eficiente del antígeno a nivel de la mucosa intestinal. Finalmente, se probó a escala piloto la vacuna oral dentro de un plantel comercial, evaluando dos variables productivas, ECA y GDP, comparándolas versus animales sin inmunizar y animales vacunados con una vacuna comercial intramuscular. Como resultado se obtuvo que la GDP fue mayor en el grupo inoculado con la formulación comercial, y la ECA no mostró diferencias entre los tres grupos. / Proyecto Fondecyt 11110135

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Las enfermedades asociadas a circovirus porcino tipo 2 (PCV-2) son consideradas el problema productivo y económico más grande de la industria porcina mundial. Además de mejorar la gestión y las prácticas de manejo (mejor higiene, menor hacinamiento y mejor ventilación), la disponibilidad de vacunas anti-PCV-2 representa la opción inmunológica más eficaz para paliar el impacto de estas enfermedades. Para el presente estudio y con la finalidad de estudiar el patrón de seroconversión contra PCV-2 entre cerdos vacunados con una vacuna comercial versus cerdos infectados naturalmente, se montó un ensayo de ELISA indirecto, usando como sustrato específico una versión recombinante de la subunidad proteica involucrada con el ensamblaje de la cápside viral (Cap). De estos análisis se concluyó, en primera instancia, que dicha estructura pudo ser reconocida en forma específica tanto por los sueros de los animales vacunados como no vacunados infectados naturalmente, analizados a distintos periodos de tiempo: 30, 50, 70, 90, 110 y 130 días, siendo posible analizar el patrón de seroconversión IgM/IgG anti-PCV-2 en dichos animales. En este estudio se concluye que el efecto diferenciador de la prueba montada de ELISA indirecto entre animales vacunados o no vacunados, depende si es que el animal cuenta o no con inmunidad de base materna anti-PCV-2, pudiendo ser esta una condición interferente con la vacunación temprana. Así, fue posible organizar y dividir los datos del patrón de seroconversión IgM/IgG anti-PCV-2 bajo cuatro escenarios distintos de resultados: 1, animales vacunados con baja inmunidad de base; 2, animales vacunados con alta inmunidad de base; 3, animales no vacunados con alta inmunidad de base y 4, animales no vacunados con baja inmunidad de base. Si bien en el presente estudio la determinación de la presencia de anticuerpos totales contra PCV-2, no resultó ser útil para diferenciar anticuerpos neutralizantes, los resultados presentados y discutidos en esta memoria son de utilidad para evaluar el status de seroconversión general contra PCV-2 de un plantel nacional de producción porcina / Fondecyt 11110135

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las enfermedades asociadas a circovirus porcino tipo 2 (PCV2) son consideradas el problema económico más grande de la industria porcina mundial. Además de mejorar la gestión y las prácticas de manejo (mejor higiene, menor hacinamiento y mejor ventilación), la disponibilidad de vacunas anti-PCV2 representa la opción inmunológica más eficaz para paliar el impacto de estas enfermedades. La proteína de la cápside de PCV2 (Cap) es un importante antígeno para el desarrollo de vacunas. Actualmente, la mayoría de las vacunas comerciales anti-PCV2 se producen como formulaciones inyectables de este antígeno. Aunque eficaces, estas vacunas tienen ciertas desventajas, incluyendo estrés animal e inmunosupresión concomitante, además de la implicancia de procedimientos laboriosos asociados y consumidores de tiempo. En este estudio, una cepa recombinante de la levadura Saccharomyces cerevisiae fue utilizada como vector y vehículo para entregar el antígeno de la cápside viral proveniente de un aislado nacional de PCV2. Este procedimiento se realizó con el fin de obtener datos dirigidos a estudiar el desarrollo de una vacuna oral contra el virus. De esta forma, el potencial inmunogénico de este sistema fue probado en ratones BALB/c, después de la administración de la levadura recombinante vía oral, bajo dos formulaciones distintas, como cepa viva y como extracto sonicado. Para esto, el gen cap químicamente sintetizado con la preferencia codogénica optimizada de la levadura (opt-cap) fue replicado en Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae a través del vector, pYES2. La expresión de la proteína Cap en la levadura fue confirmada a través de Western Blot con suero anti PCV2. Posteriormente, resultados de experimentación in vivo confirmaron que la administración oral en ratones de extractos sonicados de la levadura recombinante, estimulan la inducción de anticuerpos séricos y fecales específicos contra el antígeno Cap más eficientemente que la cepa viva. Estos resultados demostraron que es factible utilizar la levadura S. cerevisiae como un sistema seguro y simple de producir antígenos virales de PCV2, y de esta manera, su entrega vía oral podría ser una estratégica alternativa para inducir eficientemente anticuerpos anti-PCV2. Los resultados obtenidos en esta memoria en un modelo murino, están dirigidos a realizar investigación adicional en cerdos, el hospedero natural de PCV2 / Financiamiento: Proyecto Fondecyt de Iniciación en Investigación No. 1111013 y el Proyecto de Iniciación en Investigación de la Vicerrectoría de Investigación y Desarrollo de la Universidad de Chile, VID I 07/15-2