Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Medicina Preventiva Animal / El circovirus porcino tipo 2 (PCV2) es un virus que tiene estrecha relación con importantes enfermedades en el ganado porcino y es por ello que ha sido de gran interés de estudio el buscar las mejores alternativas posibles para poder disminuir el impacto de este agente en la industria porcina. Una de estas alternativas es disponer de mejores vacunas contra PCV2, entregando así una eficaz protección inmunológica frente a este agente. La mayoría de las vacunas contra PCV2 poseen una formulación inyectable y aunque son eficaces, no están exentos de problemas asociados a su administración. Es por ello que resulta de gran iteres de estudio el poder evaluar la respuesta de una vacuna experimental de mucosa (oral/intranasal) contra PCV2 en un plantel porcino, midiendo la carga viral y respuesta humoral resultante de la inmunización de cerdos con esta vacuna. Material y Método: Se utilizaron 4 grupos de cerdos, un grupo control placebo, otro inmunizado con una vacuna comercial inyectable contra PCV2 (Circumvent) y los otros dos grupos fueron inmunizados con una vacuna contra PCV2 basada en extracto crudo de levadura, enriquecida con VLPs de PCV2 microencapsulada con quitosano sulfatado (QS), utilizando la vía oral/intranasal e inyectable. Se analizaron muestras sanguíneas midiendo asi la carga viral mediante qPCR y anticuerpos totales por ELISA para cada grupo de tratamiento. Resultados: La inmunización contra PCV2 bajo una formulación de microencapsulación de antígenos VLPs utilizando quitosano funcionalizado, logró ser mas eficaz en bajar la carga viral en su formato inyectable en comparación a los demás grupos. En cuanto a la generación de anticuerpos, si bien los tres grupos inmunizados tuvieron mejores resultados que el grupo placebo, la formulación comercial obtuvo diferencias significativas por sobre el resto. Conclusión: Si bien la vacuna experimental genera protección contra PCV2, no fue posible en este estudio identificar de manera certera la vía inmunológica con la cual la vacuna protege al animal. Lo mas probable es que sea mas bien por una respuesta inmune celular contra PCV2. / Porcine circovirus type 2 (PCV2) is a virus that is closely related to major diseases in pigs and it has been of great interest to study the find the best possible alternatives to reduce the impact of this agent in the industry swine. One such alternative is for better vaccines against PCV2, thus delivering an effective immune protection against this agent. Most PCV2 vaccines have an injectable formulation and while effective, are not exempt from problems associated with its administration. That is why it is of great Turistic of study to evaluate the response of an experimental vaccine mucosa (oral / intranasal) against PCV2 in a pig campus, measuring viral load and humoral response resulting from immunization of pigs with this vaccine. Material and Methods: 4 groups of pigs, a placebo control group, another immunized with an injectable commercial vaccine against PCV2 (Circumvent) and the other two groups were used were immunized with a vaccine against PCV2 based crude extract of yeast, enriched with VLPs PCV2 microencapsulated with sulfated chitosan (QS) using oral / intranasal and injectable route. blood samples were analyzed by measuring the viral load so by qPCR and total antibody by ELISA for each treatment group. Results: Immunization against PCV2 under a microencapsulation formulation VLPs antigens using functionalized chitosan, managed to be more effective in lowering the viral load in its injectable form compared to the other groups. As for the generation of antibodies, although the three immunized groups did better than the placebo group, the commercial formulation obtained significant differences over the rest. Conclusion: Although the experimental vaccine generates protection against PCV2, it was not possible in this study to accurately identify the immunological pathway with which the vaccine protects the animal. It is more likely to be due to a cellular immune response to PCV2. / Financiamiento: Proyecto Fondef No. IT13I20021.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El uso de micropartículas (MPs) de polímeros naturales ha sido descrito como una innovadora técnica de formulación de adyuvantes para diversas vacunas. Para esta memoria de título se utilizó quitosano (Qo) como polímero natural el cual se funcionalizó con grupos azufrados para preparar quitosano tiolado (QT) y sulfonado (QS). Con estos quitosanos se formularon micropartículas de quitosano tioladas (MPQT) y de quitosano sulfonadas (MPQS) cargadas con el antígeno del circovirus porcino tipo II (PCV2). Las micropartículas de quitosano (MPQ) formuladas y cargadas fueron obtenidas mediante técnicas de gelificación iónica y secado por atomización. Se determinó la presencia de grupos azufrados en las MPQ mediante Espectroscopía infrarroja transformada de Fourier (FTIR) y se caracterizaron en cuanto a morfología, tamaño y cantidad de carga mediante microscopía electrónica de barrido o Scanning Electron Microscope (SEM) y potencial Zeta. Por otro lado, además se evaluaron parámetros de Eficiencia de encapsulación (EE) y Rendimientos de la producción (R), se determinó también la presencia de antígeno mediante Dot Blot y se realizaron estudios in vitro de mucoadhesividad. Los resultados obtenidos por FTIR indicaron la aparición de nuevos picos de absorción que coinciden con los grupos -SH, con enlaces C-O-S y para grupos S=O. Mediante SEM se observó la formación de MPs de Qo con formas más o menos esféricas, bordes definidos, superficie lisa a rugosa, y tamaños que variaron entre 1 y 50 µm. Mediante potencial Zeta las MPQC y MPQT presentaron carga neta positiva mientras que las MPQS presentaron carga neta negativa. Todas las MPs poseen valores de EE superiores a 80%, R sobre 30% para MPs 1X y son positivas a la presencia de antígeno Cap de PCV2 al análisis por Dot Blot. Finalmente, los ensayos de mucoadhesividad mostraron que las MPQT y MPQS presentaron mejor mucoadhesividad respecto a MPQC. En conclusión, se logró preparar y caracterizar Qo funcionalizado con grupos tiol y sulfonato, formular tres tipos de MPs de Qo cargadas con antígeno Cap de PCV2 y caracterizadas en su totalidad. / The use of microparticles (MPs) of natural polymers has been described as an innovative technique of formulating adjuvants for various vaccines. For this title memory chitosan (Qo) was used as the natural polymer which was functionalized with sulfur groups to prepare thiolated (QT) and sulfonated chitosan (QS). With these chitosans, thiolated chitosan microparticles (MPQT) and sulphonated chitosan microparticles (MPQS) loaded with the porcine circovirus type II (PCV2) antigen were formulated. The formulated and loaded chitosan microparticles (MPQ) were obtained by ionic gelation and spray drying techniques. It was determined the presence of sulfur groups in the MPQ by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and these MPs were characterized in terms of morphology, size and amount of charge by means of Scanning Electron Microscope (SEM) and Zeta potential, besides evaluating such parameters such as encapsulation efficiency (EE) and yields of production (R), the presence of antigen was also evaluated by Dot Blot and finally in vitro mucoadhesivity studies were performed. The results obtained by FTIR indicate the occurrence of new absorption peaks that coincide with the groups -SH, with C-O-S bonds and for S = O groups. By SEM the formation of MPs of Qo with more or less spherical shapes, defined edges, smooth to rough surface, and sizes varying between 1 and 50 μm are observed. By means of zeta potential the MPQC and MPQT presented positive net load while the MPQS presented negative net load. All MPs have EE values higher than 80%, R about 30% for 1X MPs and are positive for the presence of PCV2 Cap antigen at Dot Blot analysis. Finally, mucoadhesivity assays show that MPQT and MPQS had better mucoadhesivity with respect to MPQC. In conclusion, it is possible to prepare and characterize Qo functionalized with thiol and sulfonate groups, to formulate three types of Qo MPs loaded with PCV2 Cap antigen and to characterize them in their entirety. / Financiamiento: Proyecto Fondef It13120021 & Fondecyt 1140660

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / El circovirus porcino tipo 2 (PCV-2) es un virus muy pequeño (17 nm. de diámetro), de estructura icosaédrica y con ADN circular simple. Se conoce ampliamente por ser el agente causal de una compleja lista de enfermedades multifactoriales denominadas PCVAD (del inglés, Porcine circovirus associated diseases). Entre estas, una de las más importantes en términos económicos y sanitarios para la industria porcina intensiva, es el PMWS (del inglés, Postweaning multisystemic wasting syndrome), que se caracteriza clínicamente por adelgazamiento progresivo, retraso del crecimiento y desmedro. La infección por si sola por PCV-2 es necesaria, pero no suficiente para desencadenar el cuadro clínico, existen otros factores, tanto individuales como prediales, que participan en el desarrollo del síndrome. Por lo tanto, es más común encontrar individuos infectados con una presentación subclínica, inmunocomprometidos y mayormente susceptibles a coinfecciones. En el presente estudio, se caracterizan los perfiles serológicos de 11 granjas de producción porcina, cuya ubicación geográfica es representativa de la producción a nivel nacional. Un perfil serológico es un estudio efectuado a grupos de animales de diferentes edades o etapas productivas, para detectar la presencia de anticuerpos contra algún patógeno en particular y determinar patrones de infección. De cada granja se tomaron 16 muestras de suero en 3 edades (3-4, 10 y 18-20 semanas). Cada muestra fue evaluada mediante una prueba de ELISA para la detección de anticuerpos anti PCV-2. A modo complementario, los títulos de anticuerpos a las 3 semanas fueron transformados a valores de IPMA (técnica de inmunoperoxidasa en monocapa de cultivo celular), a modo de evidenciar posible interferencia materna con la vacunación. Finalmente, se realizó una recopilación de información respecto a las granjas muestreadas y mediante un Análisis de Varianza (ANOVA) en el programa estadístico Infostat, los factores: status PRRS, vacunación, sistema y tamaño fueron analizados, a modo de establecer posibles diferencias significativas entre las granjas al considerar estos factores. Los resultados muestran un comportamiento característico de los perfiles serológicos, con un alto título de anticuerpos a las 3 semanas, los cuales disminuyen drásticamente en el tiempo, lo que sugiere un eficiente traspaso de inmunidad materna, pero se cuestiona la efectividad en la generación de anticuerpos a través de la vacunación. Además, se observa una alta presencia del fenómeno de interferencia de la inmunidad materna con la vacunación. Por último, los resultados del análisis estadístico muestran que todos los factores analizados generan diferencias significativas entre los perfiles serológicos de las granjas. El estudio permite concluir robustamente que existe evidencia serológica de PCV-2 en todas las granjas analizadas y que existen diferencias estadísticamente significativas entre ellas al considerar ciertos factores prediales, aceptándose la hipótesis de este estudio / Porcine circovirus type 2 (PCV-2) is a very small virus (17 nm of diameter), of icosahedral structure and simple circular DNA. PCV-2 is widely known to be the causative agent of several multifactorial diseases named PCVAD (Porcine circovirus asociated diseases). The most economic important disease caused by PCV-2 is the Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS), which is characterized by progressive emaciation, growth retardation and wasting. PCV-2 infection is necessary but not sufficient to trigger the clinical presentation, there are other factors, individual and predial, that are involved in the development of the syndrome. Therefore, it is more common to find individuals infected with a subclinical presentation, immunocompromised and most susceptible to coinfections. In the present study, the serological profiles of 11 pig farms were characterized, whose geographic location is representative of production at the national level. A serological profile is a study carried out on groups of animals at different ages, to detect the presence of antibodies against PCV-2, and to determine patterns of infection. From each farm, sera was collected in 3-4 weeks; 10 weeks and 18-20 weeks old pigs, obtaining 16 samples per age. Each sample was evaluated by a comercial PCV-2 ELISA test for antibody detection. Additionally, antibody titres at 3 weeks were transformed to IPMA equivalent values (inmunoperoxidase monolayer assay), in order to evidence possible maternal interference with vaccination. Also, information about farms characteristics and management such as; PRRS status, vaccination, type of production system and size, were collected. All variables were statistically analyzed in order to establish if there were significant differences between the farms when considering these factors. The results show a characteristic behavior of the serological profiles, with a high antibody titre in 3 weeks old pigs, which decrease drastically over time, suggesting an efficient transfer of maternal immunity, but the effectiveness of the vaccination to generate antibodies is questioned. In addition, there is a high presence of the phenomenon of interference of maternal immunity with vaccination. Finally, the results of the statistical analysis show that all the analyzed factors generate significant differences between the serological profiles of the farms. The study allows us to conclude robustly that there is serological evidence of PCV-2 in all farms analyzed and that there are statistically significant differences between them when considering certain property factors, accepting the hypothesis of this study / Financiamiento: Proyecto Zoetis-Favet PCV2.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / El síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS), es una enfermedad exclusiva del cerdo, la cual causa las mayores pérdidas económicas en la industria porcina a nivel mundial. El virus es transmitido por diferentes fuentes, principalmente a través de contacto con cerdos contaminados, semen entre otros. Una de las vías posibles de transmisión, corresponde a la transmisión oral mediante el consumo de carne de cerdo contaminada. En Chile el virus fue re-introducido en 2013, desconociéndose su forma de ingreso; sin embargo, está estrechamente relacionado con cepas de USA del 2012, identificadas durante actividades de vigilancia. Para evaluar la posible transmisión a través de la carne, se analizaron 72 muestras de carne de cerdo importada, mediante RT-PCR en tiempo real y aislamiento viral. Seis de las 72(8%) muestras resultaron positivas a RT-PCR en tiempo real y 7(10%) sospechosas, con Ct promedio de 34,9. La muestra con el Ct más bajo fue de 33,09 y el máximo (sospechoso) 36,5. Estos resultados confirman la presencia frecuente de material genético de virus PRRS en carnes importadas. Por otro lado, en ninguna de las muestras positivas fue posible aislar el virus PRRS. Su viabilidad no pudo ser demostrada, lo puedo verse influenciado debido a problemas del aislamiento viral, ya que los cultivos fueron usualmente contaminados por bacterias presentes en la carne limitando la técnica. Futuros estudios son necesarios para entender mejor esta vía de transmisión, una de las maneras de mejorar el estudio de viabilidad podría ser el uso de animales centinela / The porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS), is a mayor disease causing the highest economic losses in the pork industry worldwide. The virus only affects pigs, the main transmission sources are the infected pigs and semen. Another source of infection may be pork, by oral ingestion. In Chile PRRS virus was re-introduced in 2013. The virus is close related genetically with strains detected in USA in 2012. The introduction source is still unknown. The goal of this study was to assess the pork as a possible source of PRRS virus. Seventy-two pork samples were tested by real time RT-PCR and viral isolation was attempted in positive samples. Six (8%) out of 72 were positive and 7 (10%) were suspect. The average of Ct values was 34,9 excluding negative samples. The lowest Ct reported was 33.09 and the highest suspect Ct value was 36.5. The PCR results indicate that RNA of PRRS virus can be frequently found in pork samples. In other hand, the viral isolation was negative in all samples tested at first passage. Therefore, the PRRS viability was not confirmed. These results may be affected by cell culture contamination by bacteria present in the pork samples. Further studies are necessary to better understand this source of contamination, to improve the assess viability the animal bioassay could be used / Financiamiento Proyecto Fondef ID14I10201, ASPROCER, Laboratorio de Virología Animal.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El virus de la influenza porcina o SIV (Swine Influenza Virus), es un patógeno que afecta el sistema respiratorio y produce una de las enfermedades más prevalentes a nivel de industria porcina. Está distribuido en todo el mundo y genera importantes pérdidas económicas. Además, SIV se considera un patógeno zoonótico con potencial pandémico. A partir del brote de influenza humana A H1N1 ocurrida el año 2009, ha surgido la necesidad de conocer y entender las dinámicas de evolución y transmisión de este virus, para beneficio de la salud humana y animal. Realizar un estudio en Chile adquiere especial relevancia, ya que se necesita conocer la realidad actual de SIV en los planteles de producción intensiva de cerdos. El presente estudio tiene como objetivo detectar y aislar virus de Influenza A en la población de cerdos de la zona central de Chile, territorio en donde se concentra la gran mayoría de los planteles de producción intensiva. Para esto se obtuvieron muestras de hisopos nasales y fluidos orales desde 6 granjas ubicadas en esta zona (regiones V, RM, VI y VII) entre el año 2014-2015 en distintas épocas del año. Se utilizó RT-PCR en tiempo real para detectar el virus y se aisló mediante cultivo celular usando células MDCK. Los resultados obtenidos demostraron la presencia del virus en todos los planteles muestreados. Hubo al menos dos muestras positivas a RT-PCR en tiempo real por granja. De las muestras sometidas a RT-PCR en tiempo real un 22,26% de ellas fueron positivas. Además se lograron aislar con éxito un total de 20 virus desde hisopos nasales y 2 desde fluidos orales, que corresponden a un 8,30% de las muestras obtenidas. Estos resultados indican que SIV es un patógeno frecuentemente encontrado en planteles de producción intensiva en Chile y altamente distribuido a nivel geográfico (desde la V a la VII región), por tanto podría considerarse endémico. / Swine Influenza virus (SIV) is an important respiratory pathogen in intensive pig population, generating significant economic losses for the industry. Also, SIV is a zoonotic pathogen with pandemic potential. Since the 2009 human pandemic caused by a swine origin Influenza virus H1N1, the concern about this pathogen in pigs has been increased. Then, is urgent to understand the dynamics of evolution and transmission of this virus, for animal and public health. The information about SIV in Chile is scarce; therefore any effort to understand or evidence SIV in the country is highly valuable. The aim of this study was the detection and isolation of SIV in intensive swine farms in central Chile, place where most of the pig are raising. Nasal swabs and oral fluids were collected from six farms (V, RM, VI and VII Regions) during 2014-2015 at different seasons through the year. Samples were tested by real time RT-PCR and virus isolation was attempted in canine kidney cells (MDCK). The results showed the presence of SIV in all farms tested. At least 2 samples per farm tested positive by real time RT-PCR. Overall results by real time RT-PCR have shown a 22.3% positive samples. Also, virus isolation was succeeding in 20 nasal swabs and 2 oral fluids, corresponding to 8.30% of the samples collected. Results indicate that SIV is widespread in pig population in the region can be considered endemic. / Financiamiento: Proyecto Aislamiento, diagnóstico y caracterización de virus influenza A en producción intensiva porcina nacional, 2014 Zoetis-Favet Etapa 1.