Le cancer de la vessie est au niveau mondial le 9ème cancer en importance avec 430 000 nouveaux cas diagnostiqués en 2014. Les tumeurs vésicales infiltrant le muscle représentent environ 25% des tumeurs au premier diagnostic, alors que les tumeurs vésicales non infiltrant le muscle représentent environ 75% de ces tumeurs. Ces dernières sont généralement associées à un bon pronostic mais sont caractérisées par un taux élevé de récidive et de progression, alors que les premières sont d’emblée agressives et présentent un risque élevé de progression vers les stades avancés de la maladie. Parmi les différentes thérapies disponibles pour la prise en charge des tumeurs vésicales on retrouve l’immunothérapie non-spécifique par le Bacillus de Calmette-Guérin (BCG) pour les tumeurs non-infiltrant le muscle et, depuis peu, les inhibiteurs de point de contrôle immunologique (PCI) pour les tumeurs à des stades avancés. Le cancer de la vessie est un des rares cancers à bien répondre à l’immunothérapie, mais malgré cela ces traitements ne sont pas optimaux. L’objectif principal de mon projet était de développer de nouvelles approches immunothérapeutiques plus efficaces pour lutter contre les cancers de la vessie. Pour ce faire, trois approches complémentaires ont été investiguées dans des modèles murins de cancer de la vessie. Dans un premier temps, nous avons évalué in vitro et in vivo le potentiel du poly(I:C), un agoniste du TLR3, utilisé seul ou en combinaison avec le BCG. Alors que le poly(I:C) a induit une diminution de la prolifération et une induction de l’apoptose dans des cellules de cancer de la vessie traitées in vitro, la combinaison poly(I:C)/BCG a induit, in vivo, une régression tumorale complète chez 28% des souris traitées. Par la suite, nous avons évalué le potentiel de deux combinaisons d’inhibiteurs de PCI dans deux modèles murins différents de cancer de la vessie. La première combinaison étudiée est celle du blocage simultané des PCI PD-1 et TIM-3 testée dans le modèle MBT-2 puisque que la caractérisation des tumeurs MBT-2 a montré que ces deux récepteurs étaient des PCI fréquemment exprimés dans ces tumeurs. Le blocage in vivo de ces voies de signalisation a révélé que, dans les tumeurs MBT-2, PD-1 est associé à une activité pro-tumorale, alors que de façon étonnante, TIM-3 est associé à une activité anti-tumorale, révélant des fonctions opposées de ces deux PCI dans ces tumeurs. La seconde combinaison étudiée est celle des PCI PD-1 et LAG-3 testée cette fois-ci dans le modèle MB49. La caractérisation des tumeurs MB49 a démontré que PD-1 et LAG-3 étaient des PCI importants dans ces tumeurs. L’étude in vivo a démontré que l’inhibition conjointe des voies PD-1 et LAG-3 doublait le taux de survie, puisque 67% des souris démontraient une régression tumorale complète alors que les taux de survie étaient respectivement de 33% et 0% lorsque les anti-PD-1 et anti-LAG-3 étaient administrés en monothérapie. Finalement, puisque les androgènes semblent jouer un rôle important dans le cancer de la vessie, nous avons testé une approche combinant l’inhibition de PD-1 et du récepteur aux androgènes (AR). Nous avons démontré que l’enzalutamide et le seviteronel, des anti-androgènes de deuxième génération, induisaient in vitro une diminution de la prolifération des cellules de cancer de la vessie humaines et murines. In vivo, la combinaison d’enzalutamide et d’anti-PD-1 a démontré un taux de survie de 66%, soit un taux bien supérieur au taux de 16% observé lors de l’utilisation de l’enzalutamide ou de l’anti-PD-1 utilisés en monothérapie. Ces études ont ainsi permis d’identifier différentes avenues possibles, pour augmenter la réponse immune anti-tumorale, qui pourraient être testées en essais cliniques. Elles démontrent également que la combinaison d’approches thérapeutiques est très prometteuse pour l’avenir de l’immunothérapie du cancer de la vessie. / Bladder cancer (BCa) is the ninth most common cancer in the world, with 430 000 new cases diagnosed in 2014. Muscle-invasive bladder cancer represents about 25% of bladder tumors, while non-muscle-invasive bladder cancer represents about 75% of these tumors. The latter are usually associated with a favorable prognosis but are characterized by a high rate of recurrence and progression while the former are aggressive from the onset and are at high risk of progression toward advanced disease. Among the various therapies available for the management of bladder tumors is non-specific immunotherapy using bacillus Calmette-Guerin (BCG) for the treatment on non-muscle invasive bladder tumors and, more recently, inhibitors of immune checkpoint (IC) for the treatment of advanced bladder tumors. BCa is one of the rare cancers to respond well to immunotherapy but, nevertheless, these treatments are suboptimal. The main objective of my project was to develop new immunotherapeutic approaches to fight more efficiently against BCa. To achieve this, three complementary approaches were investigated in murine BCa models. We first assessed in vitro and in vivo the potential of poly(I:C), a TLR3 agonist, used alone or in combination with BCG. While poly(I:C) induced anti-proliferative and apoptotic effects on BCa cells in vitro, the combination of poly(I:C) and BCG induced in vivo a complete tumor regression in 28% of treated mice. Then, we evaluated the potential of two combinations of IC inhibitors in two murine BCa models. The first combination studied was that of the simultaneous blockade of PD-1 and TIM-3 tested in the MBT-2 model because the characterization of the MBT-2 tumors showed that these two receptors where frequently IC expressed in these tumors. In vivo blockade of these pathways revealed that in MBT-2 tumors, PD-1 is associated to a pro-tumoral activity, whereas, TIM-3 is associated with anti-tumoral activity, revealing opposite functions of these IC in these tumors. The second combination studied was that of PD-1 and LAG-3 tested in the MB49 BCa model. The characterization of MB49 tumors showed that PD-1 and LAG-3 were important IC in these tumors. The in vivo study showed that the simultaneous blockade of PD-1 and LAG-3 increased the survival rate, since 67% of mice showed a complete tumor regression while the survival rates were 33% and 0% when anti-PD-1 and anti-LAG-3, respectively, were used in monotherapy. Finally, since androgens seem to play an important role in BCa, we tested an approach combining the inhibition of PD-1 and of the androgen receptor (AR). We showed that enzalutamide and seviteronel, two second generation antiandrogens, induced in vitro a decrease of the proliferation of human and murine BCa cells. In vivo, the combination of enzalutamide with anti-PD-1 showed a 66% overall survival rate, a rate that is much higher than the 16% rate observed when enzalutamide or anti-PD-1 were used alone. Thus, these studies allowed us to identify various possible ways to increase anti-tumor immune response that could be tested in clinical trials. They also show that the combination of therapeutic approaches is very promising the future of BCa immunotherapy.

Le cancer superficiel de la vessie (CSV) est caractérisé par un taux de récidive élevé (60%). L’immunothérapie non-spécifique au BCG est actuellement le traitement le plus utilisé pour contrer les récidives du CSV. Un vaccin ciblant spécifiquement un antigène tumoral pourrait être plus efficace que le traitement BCG. Nous avons montré que l’antigène tumoral MAGE-A9 est exprimé dans 63% des tumeurs superficielles et que son expression était associée à la récidive et à la progression. Cette étude visait à mieux caractériser l’immunogénicité de MAGE-A9 en identifiant les épitopes reconnus par les lymphocytes T CD4+ et en analysant la séroprévalence anti-MAGE-A9 chez des patients atteints de CSV. Des peptides candidats, identifiés in silico, ont été testés en essais de prolifération avec des T CD4+ de souris transgéniques HLA-A2/DR1 présensibilisées à l’antigène. Pour analyser la séroréactivitié anti-MAGE-A9, la protéine a été produite et purifiée à partir du système d’expression Baculovirus. Les résultats obtenus et les réactifs développés au cours de ce travail seront utiles pour l’élaboration d’une immunothérapie contre le CSV.

Le cancer de la vessie se caractérise par un taux de récidive de 70% après résection chirurgicale. Les tumeurs récidivantes sont traitées par une immunothérapie intravésicale au BCG dont le mode d'action est peu connu. Bien que donnant des résultats appréciables, cette thérapie est appliquée de façon empirique et reste sans effets pour 30% des patients traités. Afin d'identifier les patients réfractaires au traitement, nous avons analysé différentes caractéristiques tant au niveau des patients, de leurs tumeurs ou encore du schéma d'administration de l'immunothérapie qui seraient reliées au temps de survie sans récidive. Le système immunitaire inné, par l'intermédiaire du gène NRAMP1, est considéré comme un facteur impliqué dans l'effet antitumoral de l'immunothérapie. La distribution de plusieurs polymorphismes de ce gène a été comparée parmi différentes cohortes de patients montrant des risques variables de récidive. L'expression de l'ARNm de ce gène fut évaluée par hybridation in situ dans des spécimens de tumeurs ou par RT-PCR parmi plusieurs lignées tumorales d'origines diverses. L'analyse de l'expression d'autres antigènes fut aussi pratiquée par immunohistochimie sur des spécimens de tumeurs de patients traités au BCG. Parmi les différents marqueurs analysés, la distribution du polymorphisme D543N et la quantité de cellules tumorales exprimant l'antigène 19A211 furent associées à la survie sans récidive après immunothérapie. L'expression de NRAMP1 ne fut retrouvée dans aucune lignée cellulaire de vessie testée, même si 3 autres lignées cancéreuses (côlon et utérus) exprimaient ce gène spontanément. De plus, l'hybridation in situ a montré une expression inattendue de ce gène dans le tissu tumoral vésical. Quant au traitement d'entretien, les patients qui l'ont toléré pour au moins 1 an ont obtenu les meilleurs temps de survie sans récidive. Ainsi les résultats de ce projet semblent montrer qu'il existe des différences caractéristiques entre les patients atteints de tumeurs récidivantes et ceux traités par une simple résection transuréthrale. Ceci pourrait fournir des indications quand à pratiquer ou non une immunothérapie. / Superficial bladder cancer recurrences occur in 70% of cases. Intravesical immunotherapy is applied to prevent those recurrences but it fails in about 30% of cases. This study tried to ascertain characteristics which could be used to discriminate patients according to their recurrence risk after treatment. As the NRAMP1 gene was tied to the immune System activation, we suspected it played a role in BCG treatment efficacy. We analysed its polymorphisms distribution among patients showing variable recurrence risk and its expression in tumoral cells through in situ hybridization and RTPCR. The treatment schedule is still empirical and needs to be optimized, so we analysed the impact of long-term maintenance treatment on tumor recurrence. D543N polymorphism distribution and expression of the 19A211 antigen were significantly associated with recurrence-free survival time. Even if NRAMP1 was not found to be expressed on any bladder tumor cell lines analysed, in situ hybridization did reveal an expression of this gene mRNA in tumor cells. Moreover it was shown that patients with the best recurrence free survival time were those who tolerated maintenance treatment for at least a year. We did show that it was possible to discriminate patients through characteristics which could indicate recurrence free survival after immunotherapy.