Mitochondria are intracellular organelles in control of numerous biological functions (e.g.,from energy supply to steroidogenesis and programmed cell death by apoptosis). Evolutively, mitochondria are considered as derived from the endosymbiosis between an α-proteobacterium and a primitive eukaryotic cell. Due to its origin, the organelle displays prokaryotic motifs such as a circular double-stranded hypomethylated DNA (i.e., mtDNA) and N-formylated peptides. Intact or damaged mitochondria, as well as mitochondrial components may be extruded in the extracellular space upon cell activation or death. These features, as well as several biomolecules localized within the mitochondrion (e.g.,ATP, cytochrome C) are able to be recognized by the innate immune system as mitochondrial damage-associated molecular patterns, thus eliciting a proinflammatory response. A humoral immune response comprising anti-mitochondrial antibodies (AMA) is also described in various autoimmune conditions, such as AMA-M2 in primary biliary cirrhosis (i.e., PBC). Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease characterized by the alternance of flares and phases of remission, due to the deposition of antibody-antigen scaffolds (i.e., immune complexes) within tissues, leading to various clinical manifestations (e.g., neuropsychiatric, hematological or dermatological disorders). The antiphospholipid syndrome (i.e., APS) is an autoimmune disease, with thromboembolic and/or obstetrical manifestations, that can either be found alone or along with SLE. While the immunogenicity of cardiolipin (i.e., a phospholipid uniquely synthetized by mitochondria In humans) is well described in SLE and APS (i.e., anticardiolipins), mitochondrial proteins targeted by autoantibodies are still poorly known. The present doctoral thesis follows my masters' project during which I developed ELISAs allowing for the detection of AMA targeting intact mitochondria (i.e., AwMA) or mtDNA (i.e., AmtDNA)¹. The present project aims aims to characterize the mitochondrial immunogenicity in SLE and APS. The University of Toronto Lupus Clinic cohort comprise sera from patients with SLE or APS (n=175 and n=12 respectively). AwMA and AmtDNA levels were assessed in these samples, as well as in sera from healthy volunteers (n=43) or patients with PBC (n=12). I observed that all patients had increased AwMA, compared to healthy individuals. AmtDNA were only increased in SLE patients and were associated with increased past reports of lupus nephritis (p=0.01). These results were published in March 2019 in Scientific Reports². During the acquisition of these data, I observed that patients' sera also presented immunoreactivity against mitochondrial RNA (i.e., mtRNA). I thus adapted my assays to detect autoantibodies against mtRNA (i.e., AmtRNA), and assessed their levels in sera from patients includes in the systemic autoimmune rheumatic disease biobank and data repository (i.e., SARD-BDB. Healthy:n=30, SLE:n=87). AmtRNA were significantly elevated in SLE (IgG: p<0.0001, IgM:p=0.0493). Surprisingly, AmtRNA-IgG were associated with decreased reports of past lupus nephritis (p=0.03) and carotid plaque (p=0.04). This study was published in Frontiers in Immunology in May 2019³. As each AMA assessed displayed biostatistical associations with antiphospholipids, I replicated these protocols, using sera from patients with APS, included in the SARD-BDB (n=27). AmtRNA (IgG:p=0.0005, IgM:p=0.01) and AmtDNA-IgM were increased in APS (p=0.009). However, only AmtDNA-IgM were associated with reports of arterial thromboses (p=0.047). This pilot study was published in Lupus in August 2020⁴. In a a recent study, accepted in Arthritis & Rheumatology in January 2022⁵, we identified by mass spectrometry 1345 proteins associated with AwMA, 431 of with were assigned to the mitochondrial proteome. These results allowed to identify two candidates: C1qBP and Mfn-1. IgGs to C1qBP were increased in (p=0.0167) and associated with positivity to the lupus anticoagulant (p=0.049) in SLE. IgGs against Mfn-1 are interesting candidates for the prediction of the disease (p=0.0052) and are associated with positivity to antiphospholipids (p=0.011) and antibodies against double-stranded DNA (p = 0.0005). These results highlight the immunogenicity of the organelle in SLE and APS. Mitochondrial antigens are interesting candidates for the development of novel clinical assays allowing improved prognosis, diagnosis, or disease stratification, ultimately contributing to the improvement of medical care for people with autoimmune conditions. / Les mitochondries sont des organelles intracellulaires considérées comme issues de l'endosymbiose entre une α-protéobactérie et une cellule eucaryote primitive. L'organelle exprime ainsi des motifs moléculaires en lien avec son origine procaryote tels qu'un ADN hypométhylés (i.e., mtDNA) ou des peptides N-formylés. Des mitochondries ou bien des composantes mitochondriales pourront être libérées dans le milieu extracellulaire lors de différents évènements d'activation ou de mort cellulaire. Ces caractéristiques ainsi que certaines biomolécules, spécifiquement localisées dans la mitochondrie (e.g.,ATP, cytochrome C) auront la capacité d'être reconnues comme des motifs de dangers et de stimuler une réponse proinflammatoire de la part des cellules du système immunitaire inné. Une réponse humorale constituée d'anticorps anti-mitochondriaux (AMA) est connue dans différents troubles auto-immuns tels que les AMA-M2 dans la cirrhose biliaire primitive (PBC). Le lupus érythémateux disséminé (SLE) est une maladie auto-immune caractérisée par une succession de phases d'exacerbation et de rémission dues au dépôt d'enchevêtrements d'autoanticorps et de leurs antigènes dans les tissus, aboutissant à une grande variété de manifestations cliniques (e.g.,manifestations neuropsychiatriques, hématologiques, dermatologiques). Le syndrome des antiphospholipides (APS) est une maladie qui peut être distincte ou associée au SLE et présente des manifestations thromboemboliques et/ou obstétriques. Bien que l'immunogénicité de la cardiolipine (i.e., phospholipide uniquement synthétisée dans la mitochondrie chez l'humain) soit connue dans le cadre du SLE et de l'APS (i.e., anticardiolipines), l'antigénicité des protéines mitochondriales reste encore méconnue. Cette thèse de doctorat fait suite à mes travaux de maîtrise au cours desquels, j'ai développé des ELISAs permettant de mesurer des niveaux des IgGs dirigés contre les mitochondries intactes (i.e., AwMA) et le mtDNA (i.e., AmtDNA)¹. Mon projet de thèse vise à caractériser l'immunogénicité mitochondriale dans l'auto-immunité. La cohorte de la University of Toronto Lupus Clinic regroupe des échantillons d'échantillons de séra de patients souffrant de SLE ou d'APS (n=175 et n=12, respectivement). Les AwMA, et AmtDNA ont été mesurés au sein de ces échantillons ainsi que d'échantillons de volontaires sains (n=43) et de donneurs souffrant de PBC (n=12). Les patients souffrant des trois conditions présentaient une augmentation significative des AwMA par rapport aux contrôles sains. Les AmtDNA, uniquement augmentés chez les patients SLE (p=0.0004) ont été associés à des antécédents accrus de néphrite lupique (p=0.01). Ces résultats ont été publiés en mars 2019 dans le journal Scientific Reports² . Durant ces mesures, j'ai observé que les séra de patients présentaient aussi une immunoréactivité dirigée contre l'ARN mitochondrial (mtRNA). J'ai, par la suite, adapté mes tests pour détecter les AMA dirigés contre le mtRNA (i.e., AmtRNA) et les ai mesurés à l'aide de séra inclus dans la cohorte des maladies rhumatismales auto-immunes systémiques (MRAS. Sains:n=30, SLE:n=87). Les d'AmtRNA sont significativement élevés dans le SLE (IgG:p<0.0001 , IgM:p=0.0493). De façon surprenante, les AmtRNA-IgG sont associés avec des historiques réduits de néphrite lupique (p=0.03) et de plaque carotidienne (p=0.04). Ces travaux ont été publiés dans le journal Frontiers in Immunology en mai 2019³. L'ensemble des AMA mesurés présentant des associations biostatistiques avec différents anticorps antiphospholipides. J'ai répliqué mon protocole sur des échantillons de patients souffrant d'APS, inclus dans la cohorte MRAS (n=27). Les AmtRNA (IgG:p=0.0005, IgM:p=0.01) et les AmtDNA-IgM sont augmentés dans l'APS (p=0.009). Seuls les AmtRNA-IgM sont associées avec une diminution des antécédents de thromboses artérielles (p=0.047). Ce projet a fait l'objet d'un article, publié dans Lupus en aout 2020⁴. Dans une autre étude, acceptée dans le journal Arthritis & Rheumatology en janvier 2022⁵, nous avons identifié, par spectrométrie de masse, 1345 protéines associées aux AwMA dont 431 sont associées avec le protéome mitochondrial. Ces résultats m'ont permis d'identifier deux candidats d'intérêts : C1qBP et Mfn-1. Les anti-C1qBP sont significativement augmentés chez les patients lupiques (p=0.0167) et sont associés avec la positivité pour l'anticoagulant lupique (p=0.049). Les anti-Mfn1 constituent de potentiels candidats pour prédire la maladie (p=0.0052). Ils sont, par ailleurs, associés avec la positivité aux antiphospholipides (p=0.011) et aux anti-ADN double brins (p=0.0005). Ces résultats soulignent l'immunogénicité de la mitochondrie dans le SLE et l'APS. Les AMA et leurs cibles constituent de nouvelles avenues d'intérêt dans la mise au point de nouveaux tests cliniques permettant le diagnostic, le pronostic ou la classification de la maladie afin d'améliorer la prise en charge des patients lupiques.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / Le polyéthylène glycol (PEG) est un polymère reconnu comme généralement sécuritaire (GRAS) et son utilisation est très répandue dans plusieurs domaines, dont celui de la pharmaceutique. Ce polymère peut être conjugué à des protéines ou des vecteurs pharmaceutiques transportant des médicaments afin de prolonger le temps de circulation dans l'organisme. Bien que le PEG ait été considéré comme non immunogène, des études récentes montrent qu'environ 20 à 70 % de la population possèdent des anticorps capables de reconnaitre le polymère. Par un effet neutralisant, ces anticorps anti-PEG pourraient réduire l'efficacité et le temps de circulation de certains médicaments PEGylées. Ces travaux s'intéressent à comprendre les mécanismes derrière la réponse immunitaire anti-PEG des vecteurs pharmaceutiques et plus particulièrement des nanoparticules de polymère composé de PLGA-PEG. Notre hypothèse est que ces nanoparticules de polymère causent la production d'anticorps anti-PEG initier à l'aide de la cascade du complément. Lors de ces travaux, des anticorps anti-PEG étaient mesurés après sept jours, peu importe la voie d'administration des nanoparticules. L'isotype des anticorps dirigés contre le PEG mesuré est majoritairement des IgM. Les anticorps anti-PEG en circulation réduisent le temps de circulation de différentes architectures PEGylées, dont les nanoparticules et les liposomes. La présence des anticorps IgM anti-PEG altère les protéines retrouvées à la surface des nanoparticules. Des souris splénectomisées ont été utilisées dans plusieurs expériences afin d'investiguer le rôle de la rate dans la production des anticorps anti-PEG après l'administration de nanoparticules. Chez les souris qui ne possédaient pas de rate, la production des anticorps anti-PEG était abrogée lorsque les nanoparticules étaient administrées par voie intraveineuse. Par voie d'injection sous-cutanée, une petite quantité d'anticorps anti-PEG était mesurée après sept jours dans le plasma des souris splénectomisées. Ensuite, deux modèles de souris avec une cascade du complément abrogé (CVF) ou absence (C3[exposant -/-]) ont été utilisés pour investiguer le rôle de la cascade du complément sur la production des anticorps anti-PEG. La cascade du complément semble impliquée dans la production des anticorps anti-PEG lorsque les nanoparticules sont administrées par voie intraveineuse. Lors d'une injection sous-cutanée des nanoparticules, la concentration IgM anti-PEG mesurée après 7 jours est similaire entre le groupe témoin et le groupe ne possédant pas de cascade du complément active. Finalement, des études en cytométrie en Flux avec des nanoparticules fluorescente administrée à des souris avec et sans complément nous ont permis d'identifier l'importance des protéines du complément sur l'interaction entre les cellules immunitaires et les nanoparticules. Les protéines du complément à la surface des nanoparticules semblent favoriser leur interaction avec les lymphocytes B splénique. Les protéines du complément ne semblent pas changer l'interaction des nanoparticules avec les cellules B des ganglions lymphatiques après une administration sous-cutanée. Ces résultats suggèrent que le différent mécanisme est impliqué lors de la production des anticorps anti-PEG, selon la route d'administration des nanoparticules. Des études supplémentaires sont requises pour comprendre les effets de ces anticorps anti-PEG en clinique. / Polyethylene glycol (PEG) is a polymer recognized as generally safe (GRAS) and its use is widespread in several fields. This polymer can be conjugated to proteins or pharmaceutical carriers carrying drugs to prolong circulation time in the body. Although PEG has been considered as non-immunogenic, recent studies show that approximately 20-70% of the population have antibodies that can recognize the polymer. Through a neutralizing effect, these anti-PEG antibodies could reduce the effectiveness and circulation time of certain PEGylated drugs. This work focuses on understanding the mechanisms behind the anti-PEG immune response of pharmaceutical vectors and more particularly of polymer nanoparticles composed of PLGA-PEG. Our hypothesis is that these polymer nanoparticles cause the production of anti-PEG antibodies to initiate with the help of the complement cascade. During this work, anti-PEG antibodies were measured after 7 days, regardless of the route of administration of the nanoparticles. The isotype of the antibodies directed against the PEG was IgM. Anti-PEG antibodies in circulation reduce the circulation time of different PEGylated architectures including nanoparticles and liposomes. The presence of anti-PEG IgM antibodies alters the proteins found on the surface of the nanoparticles. In addition, anti-PEG antibodies promote the activation of the complement cascade which helps eliminate subsequent doses of nanoparticles. Splenectomized mice have been used in several experiments to investigate the role of the spleen in the production of anti-PEG antibodies after the administration of nanoparticles. In mice without a spleen, the production of anti-PEG antibodies was abrogated when the nanoparticles were administered intravenously. By subcutaneous injection, a small quantity of anti-PEG antibodies were measured after seven days in the plasma of splenectomized mice. Two mouse models with an abrogated complement cascade (CVF) or absence (C3[superscript -/-]) were used to investigate the role of the complement cascade on the production of anti-PEG antibodies. The complement cascade seems to be involved in the production of anti-PEG antibodies when the nanoparticles are administered intravenously. During a subcutaneous injection of the nanoparticles, the anti-PEG IgM concentration measured after 7 days is similar between the control group and the group without an active complement cascade. Finally, Flow cytometry studies with fluorescent nanoparticles administered to mice with and without complement allowed us to identify the importance of complement proteins on the interaction between immune cells and nanoparticles. Complement proteins on the surface of the nanoparticles appear to promote their interaction with splenic B lymphocytes. The complement deposited on the nanoparticles does not appear to direct their interaction with the B cells of the lymph nodes after subcutaneous administration. These results suggest that different mechanisms are involved in the production of anti-PEG antibodies, depending on the route of administration of the nanoparticles. Further studies are required to understand the effects of these anti-PEG antibodies in the clinic.

Les travaux effectués au cours de ce mémoire ont permis de développer une alternative aux vaccins présentement utilisés contre le virus de l’influenza. Nous avons utilisé la nucléoprotéine (NP) de l’influenza comme base vaccinale puisque cette protéine est conservée chez les souches d’influenza A et qu’elle possède un potentiel de protection croisée. Nous avons montré que la multimérisation de la NP grâce à un gabarit d’ARN permet d’augmenter son immunogenicité. Cette multimérisation en pseudo-nucléoparticule virale (NLP) a augmenté la réponse humorale et cellulaire spécifique à NP et l’ajout d’un adjuvant (PAL) a permis d’amplifier davantage la réponse humorale contre NP. Une dose du vaccin candidat NLP-PAL n’a pas réussi à protéger des souris contre une infection létale avec une souche homotypique d’influenza. Cependant, des résultats avec un régime de deux immunisations montrent des résultats encourageants qui permettent d’espérer une protection envers une infection virale. / The emergence of the highly pathogenic H5N1 avian influenza and the pandemic of 2009 have pushed scientists to find novel vaccinations strategies such as directing the immune response towards the internal proteins of the influenza. In this study, we have used recombinant nucleoprotein (rNP) as a vaccine basis since it is well conserved among the influenza A strains and it can confer cross-protection. To enhance the low immunogenicity of the rNP, we multimerized it using synthetic RNA as a scaffold to form Nucleocapsid-like-particles (NLP). The multimerization increased the cellular and humoral immunogenicity of NP and addition of the PAL adjuvant increased it even further. The NLP-PAL candidate vaccine was not able to fully protect mice from a lethal challenge after one immunization. A prime-boost immunization increased the humoral and cellular response but further experiments are needed to see if the prime-boost strategy can protect against a lethal influenza challenge.

Mitochondria are intracellular organelles in control of numerous biological functions (e.g.,from energy supply to steroidogenesis and programmed cell death by apoptosis). Evolutively, mitochondria are considered as derived from the endosymbiosis between an α-proteobacterium and a primitive eukaryotic cell. Due to its origin, the organelle displays prokaryotic motifs such as a circular double-stranded hypomethylated DNA (i.e., mtDNA) and N-formylated peptides. Intact or damaged mitochondria, as well as mitochondrial components may be extruded in the extracellular space upon cell activation or death. These features, as well as several biomolecules localized within the mitochondrion (e.g.,ATP, cytochrome C) are able to be recognized by the innate immune system as mitochondrial damage-associated molecular patterns, thus eliciting a proinflammatory response. A humoral immune response comprising anti-mitochondrial antibodies (AMA) is also described in various autoimmune conditions, such as AMA-M2 in primary biliary cirrhosis (i.e., PBC). Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease characterized by the alternance of flares and phases of remission, due to the deposition of antibody-antigen scaffolds (i.e., immune complexes) within tissues, leading to various clinical manifestations (e.g., neuropsychiatric, hematological or dermatological disorders). The antiphospholipid syndrome (i.e., APS) is an autoimmune disease, with thromboembolic and/or obstetrical manifestations, that can either be found alone or along with SLE. While the immunogenicity of cardiolipin (i.e., a phospholipid uniquely synthetized by mitochondria In humans) is well described in SLE and APS (i.e., anticardiolipins), mitochondrial proteins targeted by autoantibodies are still poorly known. The present doctoral thesis follows my masters' project during which I developed ELISAs allowing for the detection of AMA targeting intact mitochondria (i.e., AwMA) or mtDNA (i.e., AmtDNA)¹. The present project aims aims to characterize the mitochondrial immunogenicity in SLE and APS. The University of Toronto Lupus Clinic cohort comprise sera from patients with SLE or APS (n=175 and n=12 respectively). AwMA and AmtDNA levels were assessed in these samples, as well as in sera from healthy volunteers (n=43) or patients with PBC (n=12). I observed that all patients had increased AwMA, compared to healthy individuals. AmtDNA were only increased in SLE patients and were associated with increased past reports of lupus nephritis (p=0.01). These results were published in March 2019 in Scientific Reports². During the acquisition of these data, I observed that patients' sera also presented immunoreactivity against mitochondrial RNA (i.e., mtRNA). I thus adapted my assays to detect autoantibodies against mtRNA (i.e., AmtRNA), and assessed their levels in sera from patients includes in the systemic autoimmune rheumatic disease biobank and data repository (i.e., SARD-BDB. Healthy:n=30, SLE:n=87). AmtRNA were significantly elevated in SLE (IgG: p<0.0001, IgM:p=0.0493). Surprisingly, AmtRNA-IgG were associated with decreased reports of past lupus nephritis (p=0.03) and carotid plaque (p=0.04). This study was published in Frontiers in Immunology in May 2019³. As each AMA assessed displayed biostatistical associations with antiphospholipids, I replicated these protocols, using sera from patients with APS, included in the SARD-BDB (n=27). AmtRNA (IgG:p=0.0005, IgM:p=0.01) and AmtDNA-IgM were increased in APS (p=0.009). However, only AmtDNA-IgM were associated with reports of arterial thromboses (p=0.047). This pilot study was published in Lupus in August 2020⁴. In a a recent study, accepted in Arthritis & Rheumatology in January 2022⁵, we identified by mass spectrometry 1345 proteins associated with AwMA, 431 of with were assigned to the mitochondrial proteome. These results allowed to identify two candidates: C1qBP and Mfn-1. IgGs to C1qBP were increased in (p=0.0167) and associated with positivity to the lupus anticoagulant (p=0.049) in SLE. IgGs against Mfn-1 are interesting candidates for the prediction of the disease (p=0.0052) and are associated with positivity to antiphospholipids (p=0.011) and antibodies against double-stranded DNA (p = 0.0005). These results highlight the immunogenicity of the organelle in SLE and APS. Mitochondrial antigens are interesting candidates for the development of novel clinical assays allowing improved prognosis, diagnosis, or disease stratification, ultimately contributing to the improvement of medical care for people with autoimmune conditions. / Les mitochondries sont des organelles intracellulaires considérées comme issues de l'endosymbiose entre une α-protéobactérie et une cellule eucaryote primitive. L'organelle exprime ainsi des motifs moléculaires en lien avec son origine procaryote tels qu'un ADN hypométhylés (i.e., mtDNA) ou des peptides N-formylés. Des mitochondries ou bien des composantes mitochondriales pourront être libérées dans le milieu extracellulaire lors de différents évènements d'activation ou de mort cellulaire. Ces caractéristiques ainsi que certaines biomolécules, spécifiquement localisées dans la mitochondrie (e.g.,ATP, cytochrome C) auront la capacité d'être reconnues comme des motifs de dangers et de stimuler une réponse proinflammatoire de la part des cellules du système immunitaire inné. Une réponse humorale constituée d'anticorps anti-mitochondriaux (AMA) est connue dans différents troubles auto-immuns tels que les AMA-M2 dans la cirrhose biliaire primitive (PBC). Le lupus érythémateux disséminé (SLE) est une maladie auto-immune caractérisée par une succession de phases d'exacerbation et de rémission dues au dépôt d'enchevêtrements d'autoanticorps et de leurs antigènes dans les tissus, aboutissant à une grande variété de manifestations cliniques (e.g.,manifestations neuropsychiatriques, hématologiques, dermatologiques). Le syndrome des antiphospholipides (APS) est une maladie qui peut être distincte ou associée au SLE et présente des manifestations thromboemboliques et/ou obstétriques. Bien que l'immunogénicité de la cardiolipine (i.e., phospholipide uniquement synthétisée dans la mitochondrie chez l'humain) soit connue dans le cadre du SLE et de l'APS (i.e., anticardiolipines), l'antigénicité des protéines mitochondriales reste encore méconnue. Cette thèse de doctorat fait suite à mes travaux de maîtrise au cours desquels, j'ai développé des ELISAs permettant de mesurer des niveaux des IgGs dirigés contre les mitochondries intactes (i.e., AwMA) et le mtDNA (i.e., AmtDNA)¹. Mon projet de thèse vise à caractériser l'immunogénicité mitochondriale dans l'auto-immunité. La cohorte de la University of Toronto Lupus Clinic regroupe des échantillons d'échantillons de séra de patients souffrant de SLE ou d'APS (n=175 et n=12, respectivement). Les AwMA, et AmtDNA ont été mesurés au sein de ces échantillons ainsi que d'échantillons de volontaires sains (n=43) et de donneurs souffrant de PBC (n=12). Les patients souffrant des trois conditions présentaient une augmentation significative des AwMA par rapport aux contrôles sains. Les AmtDNA, uniquement augmentés chez les patients SLE (p=0.0004) ont été associés à des antécédents accrus de néphrite lupique (p=0.01). Ces résultats ont été publiés en mars 2019 dans le journal Scientific Reports² . Durant ces mesures, j'ai observé que les séra de patients présentaient aussi une immunoréactivité dirigée contre l'ARN mitochondrial (mtRNA). J'ai, par la suite, adapté mes tests pour détecter les AMA dirigés contre le mtRNA (i.e., AmtRNA) et les ai mesurés à l'aide de séra inclus dans la cohorte des maladies rhumatismales auto-immunes systémiques (MRAS. Sains:n=30, SLE:n=87). Les d'AmtRNA sont significativement élevés dans le SLE (IgG:p<0.0001 , IgM:p=0.0493). De façon surprenante, les AmtRNA-IgG sont associés avec des historiques réduits de néphrite lupique (p=0.03) et de plaque carotidienne (p=0.04). Ces travaux ont été publiés dans le journal Frontiers in Immunology en mai 2019³. L'ensemble des AMA mesurés présentant des associations biostatistiques avec différents anticorps antiphospholipides. J'ai répliqué mon protocole sur des échantillons de patients souffrant d'APS, inclus dans la cohorte MRAS (n=27). Les AmtRNA (IgG:p=0.0005, IgM:p=0.01) et les AmtDNA-IgM sont augmentés dans l'APS (p=0.009). Seuls les AmtRNA-IgM sont associées avec une diminution des antécédents de thromboses artérielles (p=0.047). Ce projet a fait l'objet d'un article, publié dans Lupus en aout 2020⁴. Dans une autre étude, acceptée dans le journal Arthritis & Rheumatology en janvier 2022⁵, nous avons identifié, par spectrométrie de masse, 1345 protéines associées aux AwMA dont 431 sont associées avec le protéome mitochondrial. Ces résultats m'ont permis d'identifier deux candidats d'intérêts : C1qBP et Mfn-1. Les anti-C1qBP sont significativement augmentés chez les patients lupiques (p=0.0167) et sont associés avec la positivité pour l'anticoagulant lupique (p=0.049). Les anti-Mfn1 constituent de potentiels candidats pour prédire la maladie (p=0.0052). Ils sont, par ailleurs, associés avec la positivité aux antiphospholipides (p=0.011) et aux anti-ADN double brins (p=0.0005). Ces résultats soulignent l'immunogénicité de la mitochondrie dans le SLE et l'APS. Les AMA et leurs cibles constituent de nouvelles avenues d'intérêt dans la mise au point de nouveaux tests cliniques permettant le diagnostic, le pronostic ou la classification de la maladie afin d'améliorer la prise en charge des patients lupiques.

La présente thèse visait à évaluer la relation entre l’insomnie, le fonctionnement immunitaire et l’occurrence d’épisodes infectieux chez des patients atteints de cancer. Dans la première étude, le but consistait à évaluer la relation entre l’insomnie et l’occurrence d’épisodes infectieux chez près de 1000 patients atteints de divers types de cancer ayant participé à une étude épidémiologique plus large réalisée par notre équipe de recherche. Dans cette étude, les patients ont complété des mesures lors de la période péri-opératoire ainsi que 2, 6, 10, 14 et 18 mois plus tard. Les résultats ont indiqué que les patients souffrant d’un syndrome d’insomnie avaient un risque accru de développer un épisode d’infection au temps de mesure subséquent, comparativement aux bons dormeurs. Ce risque était également plus élevé, quoique de moindre importance, chez des patients rapportant des symptômes d’insomnie, comparativement aux bons dormeurs. Une fois l’anxiété et la dépression incluses comme covariables dans le modèle statistique, seule la présence d’un syndrome d’insomnie demeurait significativement associée à l’accroissement du risque infectieux. Quant à la deuxième étude, menée chez des patientes traitées en chimiothérapie pour un cancer du sein ou gynécologique, son but était de documenter l’évolution du sommeil avant, pendant et après des traitements de chimiothérapie, et d’évaluer la relation entre l’insomnie, le fonctionnement immunitaire et l’occurrence d’épisodes infectieux. Pour ce faire, un échantillon de 52 patientes a été recruté. Celles-ci ont complété des mesures avant l’initiation des traitements de chimiothérapie, à 4 moments en cours de traitement (phases d’immunosuppression et de récupération pour les deux premiers cycles de chimiothérapie), après la fin des traitements et lors de deux suivis 3 et 6 mois plus tard. Les résultats ont indiqué que l’ensemble des participantes, sans égard à leur statut d’insomnie au niveau de base, présentaient un accroissement des difficultés de sommeil pendant la chimiothérapie, suivi d’un retour progressif vers la qualité de sommeil initiale suite à la fin des traitements. Concernant la relation entre l’insomnie, le fonctionnement immunitaire et l’occurrence d’infections, il est ressorti que les patientes souffrant d’un syndrome d’insomnie au niveau de base présentaient significativement plus d’altérations immunitaires que les deux autres groupes à différents moments, notamment lors de la période suivant la fin des traitements. Les résultats ont également suggéré que les participantes ayant un syndrome d’insomnie au niveau de base étaient plus à risque de rapporter des symptômes infectieux en cours de chimiothérapie. Les résultats de la présente thèse suggèrent ainsi que le fait de souffrir de difficultés de sommeil, en particulier d’un syndrome d’insomnie, caractérisé par des difficultés plus sévères et plus persistantes, pourrait accroître le risque de vivre des altérations immunitaires et de rapporter des infections pendant la trajectoire de soins oncologiques. Bien que ces résultats nécessitent d’être répliqués, ils témoignent de la nécessité de détecter et traiter les difficultés de sommeil chez les patients atteints de cancer, considérant l’impact éventuel de ces dernières sur leur qualité de vie et leur santé.

La pathogenèse de l’encéphalite herpétique (HSE) n’est pas totalement connue, mais la réplication du virus engendre une encéphalite aiguë nécrosante du lobe temporal/frontal et une inflammation cérébrale menant à l’infiltration des cellules immunitaires périphériques au sein du système nerveux central. Bien que la majorité des dommages cérébraux engendrés seraient causés par la réplication virale, de plus en de plus de données indiquent une composante immunitaire dans la pathogenèse de l’HSE. La réponse immunitaire innée constitue la première ligne de défense limitant la propagation virale. Nous savons que la réponse immunitaire est engendrée à la suite de la reconnaissance du VHS-1, notamment par les « Toll-like receptors » (TLRs). De plus, la synthèse d’interféron (IFN) de type I est primordiale dans la réponse antivirale. En effet, des études montrent qu’une déficience d’un composant impliqué dans les voies de signalisation menant à la production d’IFNs de type I est délétère chez la souris et chez l’humain au cours de l’HSE. Par ailleurs, la migration des cellules immunitaires au sein du SNC prend de plus en plus d’ampleur dans l’étude de la réponse immunitaire contre cette infection. Cependant, bien que différents modèles animaux permettent l’étude de la réponse immunitaire cérébrale, la complexité de cette pathologie, du SNC et de sa réponse inflammatoire en limite encore notre compréhension. L’objectif principal de cette thèse a été de mieux comprendre la composante immunitaire de la pathogenèse de l’HSE, et plus spécifiquement, au niveau du recrutement des cellules immunitaires périphériques dans le SNC, de la participation des voies de signalisation passant par les facteurs de transcription régulateurs des IFNs (IRF) 3 et IRF7 et d’évaluer l’effet d’immunomodulateurs tels que l’artésunate et la rapamycine sur la sensibilité de différentes souches murines au cours de l’encéphalite herpétique expérimentale. Les études menées ont permis de mettre en évidence qu’une réponse immunitaire cérébrale innée efficace participe à la résistance naturelle des souris C57BL/6 en comparaison aux souris BALB/c naturellement sensibles. En effet, la charge virale dans le SNC des souris C57BL/6 infectées par le VHS-1 par voie I.N est plus faible au pic de l’infection (i. e jour 6 post-infection [p. i]) comparativement aux souris BALB/c. Ce contrôle de la charge virale est associé à une infiltration rapide (avec au jour 4 post-infection, infiltration de monocytes inflammatoires, de cellules dendritiques conventionnelles [cDCs], de cellules dendritiques plasmacytoïdes [pDCs], de cellules « natural killers » [NK], de cellules « natural killers T » [NKT]) et coordonnée (suivie d’une infiltration de lymphocyte T au jour 8 p. i). Par ailleurs, les travaux réalisés ont permis de mettre en évidence un rôle clé d’IRF3 et plus particulièrement d’IRF7 dans la réponse interféron de type I. En ce sens, les souris déficientes pour IRF3 ou IRF7 sont plus sensibles à l’infection intranasale par le VHS-1 que les souris C57BL/6 sauvages. Chez les souris déficientes pour IRF7 et dans une moindre mesure pour IRF3, la perte de contrôle de la réplication virale dans le cerveau est associée à un défaut de production d’IFN -b à un temps précoce après l’infection suivi par une surproduction des IFNs de type I. La sensibilité accrue au cours de l’HSE, aussi bien chez les souris BALB/c naturellement sensibles que chez les souris déficientes pour IRF7 ou IRF3, est combinée à une forte production de cytokines pro-inflammatoires et de chimiokines à des temps tardifs postinfection. Nous avons donc évalué l’effet de l’ajout d’immunomodulateurs au traitement antiviral : l’artésunate (ART), agissant sur les voies de signalisation passant par TLR2 et 9 et la rapamycine (RAPA), agissant sur les voies de signalisation passant par TLR3 et 9 et ainsi mis en évidence que l’ajout d’un composé immunomodulateur au traitement antiviral permettait d’améliorer la survie des souris sensibles à l’infection sans action directe sur la charge virale au niveau du cerveau, mais en diminuant significativement les taux de cytokines pro-inflammatoire et de chimiokines dans le SNC. À l’aide de ces différents modèles expérimentaux, j’ai également démontré une surexpression de cytokines pro-inflammatoires (l’IL-1 b, l’IL-6, l’IFN -g) et de chimiokine (CCL2), dont les taux sont diminués par l’ajout d’un traitement immunomodulateur à la thérapie antivirale dans un modèle murin sensible à l’HSE. Ces données apportent donc de nouvelles preuves d’une composante immunitaire dans la pathogenèse de l’encéphalite herpétique, ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. / Pathogenesis of herpes simplex encephalitis is not completely understood, but viral replication results in acute necrotizing encephalitis of the temporal/frontal lobes and cerebral inflammation leading to the infiltration of the peripheral immune cells to the central nervous system (CNS). Although most brain damage is caused by viral replication, a lot of data suggest that the immune response could also contribute to the pathogenesis of HSE. The innate immune response is the first line of host defense that limits viral spread. Numerous studies showed that the immune response is induced by the recognition of HSV-1, in particular by the toll-like receptors (TLRs). Likewise, type I interferon (IFN) is essential to the antiviral response. Indeed, studies showed that impairment of a component involved in signaling pathways inducing the type I IFN synthesis is deleterious in mice and humans during HSE. For several years, a series of studies have suggested that the immune response participated in this CNS pathology resulting in a fatal course and that hyperinflammatory responses initiated by early infiltrating innate cells play a key role in the development of this pathology. In addition, the complexity of the CNS inflammatory response constitutes a challenge for our understanding of the pathogenesis of herpetic encephalitis. The main objective of this thesis was to better understand the immune response as a contributor to the pathogenesis of HSE, and more specifically, the recruitment of peripheral immune cells in the CNS, the involvement of signaling pathway mediated by the interferon regulatory transcription factors (IRF) 3 and IRF7 and the evaluation of the effects of immunomodulators such as artesunate and rapamycin on the susceptibility of different murine strains during experimental HSE An effective innate cerebral immune response contributes to the natural resistance of C57BL/6 mice compared to naturally sensitive BALB/c mice. In fact, the viral load in the CNS of C57BL/6 mice infected with HSV-1 by the I.N. route is lower at the peak of infection (day 6 post-infection (p.i)) compared to BALB/c mice. This control of the viral load is associated with rapid and coordinated infiltration of cells in the CNS (infiltration of inflammatory monocytes, conventional dendritic cells (cDCs), plasmacytoid dendritic cells (pDCs), natural killer cells (NK), natural killer cells T (NKT) on day 4 p.i) followed by T lymphocyte infiltration on day 8 p.i. Moreover, the control of viral replication is orchestrated by the activation of transcription factors IRF3 and particularly IRF7. In this regard, mice deficient for IRF3 or IRF7 are more susceptible to intranasal infection by HSV-1 than wild type C57BL/6 mice. In mice deficient for IRF7 and to a lesser extent for IRF3, the loss of control of viral replication in the brain is associated with a defect in IFN-b production at an early time after infection followed by overproduction of type I IFNs. Increased susceptibility of BALB/c mice, IRF3- or IRF7-deficient mice is associated with higher levels of pro-inflammatory cytokines and chemokines levels in the CNS compared to C57BL/6 mice at later times post-infection. We therefore evaluated the effect of the addition of immunomodulators to antiviral treatment: artesunate (ART), acting on signaling pathways mediated by TLR2 and 9 and rapamycin (RAPA), acting on signaling pathways mediated by TLR3 and 9. We show that the administration of ART or RAPA to the antiviral therapy was beneficial and improve the outcome of HSE in mice, without a direct effect on the viral load. Instead they act by decreasing significantly pro-inflammatory cytokine and chemokine levels in the CNS. Using these different experimental models, we also demonstrated overexpression of pro-inflammatory cytokines (IL-1 b, IL-6, IFN -g) and chemokine (CC2) during experimental HSE. In this regard, adding of immunomodulatory compound to antiviral therapy allowed to decrease levels of these inflammatory proteins. In conclusion, these data provide new evidence for the contribution of the immune response in the pathogenesis of herpetic encephalitis, as well as the development of potential new therapeutic targets.

La malaria, maladie causée par le protozoaire Plasmodium, tue chaque année plus d'un million de personnes. L'émergence de parasites résistants à plusieurs traitements anti-malariques ainsi que l'absence de vaccin efficace rendent la lutte contre le Plasmodium de plus en plus difficile. Afin de pouvoir identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et d'optimiser l'efficacité des vaccins dans les zones endémiques, une meilleure compréhension des interactions hôte/parasite est nécessaire. Lors de la malaria, un état d'immunosuppression systémique est induit par le parasite. Cet état de suppression immunitaire pourrait être à l'origine de la persistance du parasite au sein de l'hôte ainsi que de la difficulté à obtenir une protection efficace contre la réinfection décrite dans les zones endémiques. Mieux comprendre comment le Plasmodium interfère avec la réponse immunitaire permettra de mettre en place des thérapies favorisant la résolution des infections par ce parasite. Dans ce sens, notre étude a pour but d'évaluer l'activation des cellules T régulatrices naturelles (TregN) ainsi que la modulation de la physiologie des macrophages (MP) lors des infections par Plasmodium. Une étude antérieure a suggéré que l'activation des cellules TregN lors des infections par Plasmodium yoelii l7XL (PyL) était impliquée dans le développement de l'immunosuppression et permettait au parasite d'échapper au système immunitaire. En utilisant un modèle alternatif d'infection par Plasmodium, nous avons démontré que l'activation des cellules TregN pouvait aussi représenter un mécanisme protecteur pour l'hôte. Lors des infections par Plasmodium chabaudi adami (Pca) chez les souris BALB/c, l'activation des cellules TregN permet de tempérer la réponse immunitaire afin d'éviter le développement d'une inflammation excessive sans toutefois affecter le contrôle du parasite. Ainsi, il semblerait que le rôle des cellules TregN lors des infections par Plasmodium dépende de l'espèce du parasite considérée. Les infections par Plasmodium sont associées à une diminution de la sécrétion d'interleukine 12 (IL-12) et de la viabilité des MP ayant vraisemblablement des répercussions sur le développement de la pathologie et le contrôle du parasite. Notre étude a démontré que l'hémine (HE), produite suite à l'oxydation de l'hème provenant de l'hémoglobine (Hb), pourrait être impliquée dans ces deux phénomènes. Lors des infections par Plasmodium, les MP entrent en contact avec et internalisent des quantités importantes de ce composé ferrique via la phagocytose de globules rouges (GR) parasités ou abimés ainsi que via l'ingestion d'Hb et/ou d'HE libérées dans le sang suite à la lyse des érythrocytes. In vitro, des doses physiologiques d'HE diminuent de manière significative la quantité d'IL-12 sécrétée par les MP dérivés de la moelle osseuse en réponse à une stimulation avec l'interféron gamma (IFN-y) et le lipopolysaccharide (LPS). L'HE agit principalement sur l'effet synergique de l'IFN-y et ceci d'une manière dépendante de l'interleukine 10 (IL-10), de la MAPK (de l'anglais "mitogen activated protein kinase") p38 et du stress oxydatif. D'autre part, l'utilisation de GR de souris infectées par le Pca ou de GR oxydés, permettant de stimuler une forte érythrophagocytose in vitro, a permis de démontrer que l'internalisation d'un nombre important de GR induisait l'apoptose des MP de la lignée J774A.1. La phagocytose des GR conduit à l'internalisation d'une quantité importante d'HE induisant un stress oxydatif impliqué dans la diminution de la viabilité des MP. Bien que l'activation des cellules TregN et l'inhibition des MP à la suite de l'ingestion d'HE puissent représenter des mécanismes permettant au Plasmodium d'échapper au système immunitaire, ces mécanismes immunosuppresseurs pourraient aussi permettre de limiter l'inflammation et la pathologie favorisant ainsi la survie de l’hôte lors de la malaria. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Plasmodium, immunosuppression, macrophages, interleukine 12, érythrophagocytose.

Ce projet avait pour but la production de protéines recombinantes pour des procédures vaccinales dans un système végétal. Les protéines choisies ont été d'une part, deux protéines virales d'un Arterivirus, le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (PRRSV), les protéines GP5 et M, et d'autre part une protéine du flagelle, la flagelline ou FljB de Salmonella typhimurium. Le PRRSV est responsable de pertes économiques majeures dans l'industrie porcine mondiale et l'efficacité des vaccins actuels contre ce virus est limitée. La protéine M a été choisie pour sa propriété à former un hétérodimère avec la protéine GP5 qui augmente la réponse immunitaire. La glycoprotéine GP5, quant à elle, possède deux épitopes dans sa région N-terminale dont un joue un rôle majeur puisqu' il est capable de stimuler la production d'anticorps neutralisants nécessaires à la clairance du virus. Enfin FljB, qui est une protéine bien conservée chez les bactéries Gram négatives, a été retenue pour ses propriétés adjuvantes intéressantes de par sa capacité à se lier au récepteur 5 de type toll (TLR5) et à induire des réponses immunitaires systémiques et mucosales. Les hypothèses pour cette étude étaient que la production d'une protéine recombinante M::GP5 intégrant trois mutations (M::GP5mut) à des sites stratégiques de celle-ci induirait une meilleure réponse immunitaire que la protéine GP5 sauvage ; que l'administration par voie orale de plante produisant la protéine M::GP5mut induirait une immunité protectrice contre le PRRSV ; que les propriétés adjuvantes de FljB produite chez Nicotiana benthamiana devraient être comparables à celles de FljB recombinante produite chez E. coli. Pour répondre à ces questions, un système transitoire d'expression chez N. benthamiana a été choisi. Il a l'avantage de pouvoir produire des protéines rapidement et à des niveaux élevés. L'immunogénicité de la protéine M::GP5mut, et les propriétés adjuvantes de la flagelline ont été testées dans un système murin. Dans le cas de la flagelline, l'ovalbumine (OVA) a été choisie comme immunogène. Peu de résultats ont été obtenus dans le cadre du projet des protéines du PRRSV du fait de l'absence de production de celles-ci à un niveau détectable bien que la présence des ARNm ait été confirmée. En revanche, pour FljB, il a été montré que l'administration par voie orale de celle-ci induisait une réponse immunitaire contre l'OVA d'une intensité égale à celle produite par l'administration du mélange OVA avec de la FljB recombinante produite par E. coli et supérieure à celle de l'OVA administrée seule. De plus, FljB recombinante produite dans N. benthamiana a permis d'obtenir une réponse plus précoce qu'avec l'utilisation de FljB recombinante produite chez E. coli. En conclusion, il a pu être montré grâce à FljB que le système de production utilisé était efficace et que FljB est un bon adjuvant qui conserve ses propriétés quand elle est produite chez N. benthamiana. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : PRRSV, FljB, expression transitoire, adjuvant, réponse immunitaire, Nicotiana benthamiana

Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La découverte des antigènes tumoraux dans les années 1980s a permis d’envisager l’élaboration de protocoles de vaccination de patients cancéreux. Les résultats obtenus chez les patients traités sont prometteurs mais encore insuffisants et la chimiothérapie reste, à ce jour, régulièrement utilisée dans le traitement de tumeurs.<p>\ / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished