Le cancer du Pancréas est un cancer extrêmement agressif avec un taux de survie à 5 ans ne dépassant pas les 5%. La détection tardive, le manque de biomarqueur et de thérapie efficace en sont les principales causes. Ce cancer est caractérisé par un microenvironnement très dense composé majoritairement de fibroblastes associés au cancer (CAF). Ce stroma est en constante communication avec la tumeur via la production de facteurs de croissance et métabolites, ce qui favorise le développement tumoral. Notre projet consiste à perturber ce dialogue en ciblant par des anticorps monoclonaux, la Neuréguline 1 (NRG1), ligand du récepteur HER3. Sa surexpression a été montrée dans des tumeurs pancréatiques, par les cellules tumorales et par les CAF. Nous avons confirmé l’implication de la NRG1 dans la croissance des tumeurs pancréatiques puis nous avons généré un anticorps monoclonal (7E3) murin spécifique de ce ligand. Cet anticorps a été caractérisé au niveau de sa spécificité, son affinité ainsi que son épitope sur la NRG1. Nous avons ensuite étudié son effet thérapeutique dans différents modèles de cellules pancréatiques seules ou en co-culture avec des fibroblastes activés provenant de tumeurs humaines. Le ciblage de la NRG1 par le 7E3 inhibe la signalisation de HER3 et la croissance cellulaire in vitro en 2D et en 3D. De plus, son efficacité sur le ralentissement de la croissance tumorale a été montrée dans des modèles originaux de greffes orthotopiques de cellules tumorales seules ou mélangées à des CAF chez la souris nude.Dans le but d’étudier plus précisément l’effet de notre anticorps sur le microenvironnement tumoral ainsi que la toxicité de notre stratégie, un second anticorps ciblant la NRG1 murine et humaine a été produit par phage display et est en cours de caractérisation in vitro et in vivo. Des combinaisons du 7E3 avec la chimiothérapie (Gemciatbine ou Folfirinox) ou d’autres thérapies ciblées sont envisagées.Cette thèse propose une nouvelle solution thérapeutique pour les patients atteints de cancer du Pancréas. Nous avons démontré l’importance de perturber le dialogue entre les cellules tumorales et les CAF en validant l’efficacité d’un tel ciblage par des anticorps monoclonaux. / Pancreatic cancer is an extremely aggressive cancer with a 5-year survival rate of no more than 5%. Late detection, lack of biomarker and effective therapy are the main causes. This cancer is characterized by a very dense microenvironment composed of cancer-associated fibroblasts (CAFs). This stroma is in constant communication with the tumor via the production of growth factors and metabolites, which promotes tumor development. Our project consists in disrupting this crosstalk with monoclonal antibodies targeting Neuregulin 1 (NRG1), ligand of the HER3 receptor. Its overexpression has been shown in pancreatic tumor cells and CAFs. We confirmed the involvement of NRG1 in the pancreatic tumors growth and then we generated a monoclonal antibody (7E3 mAb) specific for this ligand. This antibody has been characterized in terms of its specificity, its affinity and its epitope on NRG1. We then studied its therapeutic effect in different models of pancreatic cells alone or in co-culture with CAFs coming from human samples. The anti NRG1 antibody inhibits HER3 signaling as well as cell growth in 2D and 3D culture. In addition, its efficacy on tumor growth was shown in orthoptic xenograft models of tumor cells mixed with CAFs.In order to study more specifically the antibody effect on tumor microenvironment as well as its toxicity, a second mAb targeting murine and human NRG1 was produced by phage display. Its in vitro and in vivo characterization is ongoing. Combinations of 7E3 with chemotherapy (gemciatbine or Folfirinox) or other targeted therapies are being considered.This thesis proposes a new therapeutic solution for patients with pancreatic cancer. We demonstrated the importance of disrupting the crosstalk between tumor cells and CAF by validating the efficacy of targeting NRG1 by monoclonal antibody.

L’hypothèse prédominante de cette thèse est que les traitements utilisés pour le cancer du sein de stade précoce (chimiothérapie avec des anthracyclines et/ou avec l’anticorps monoclonal trastuzumab) peuvent amener à des toxicités cardiaques à long terme, et qu’une évaluation de ce risque cardiaque ainsi qu’un suivi à long terme sont importants. Pour évaluer la toxicité cardiaque secondaire à ces deux agents chez les patientes avec un cancer du sein de stade précoce, nous avons réalisé deux séries d’études cliniques, la première pour évaluer la toxicité cardiaque à long terme induite par les anthracyclines, et la deuxième pour explorer la toxicité cardiaque induite par le trastuzumab. 1) Le premier chapitre de cette thèse explore la toxicité cardiaque à long terme induite par la chimiothérapie administrée aux patientes avec cancer du sein de stade précoce et ganglions positifs. La population de notre étude a été recrutée au sein de la population d’une étude de phase III randomisée menée entre 1988 et 1996 en Belgique et comparant trois schémas de traitement de chimiothérapie adjuvante, soit deux différents protocoles de chimiothérapies à base d’anthracyclines (basse dose ou haute dose d’epirubicine) ainsi qu’un schéma de chimiothérapie sans anthracyclines (CMF classique). Nous avons identifié 82 patientes (30%) traitées avec chimiothérapie adjuvante dans cette étude qui n’avaient pas de signe de récidive en 2010 (survivantes à long terme). Une évaluation cardiaque approfondie de ces patientes a été effectuée, incluant une échographie cardiaque, une résonance magnétique nucléaire, des marqueurs cardiaques sériques (pro-BNP et troponine), ainsi qu’un test de marche de 6 minutes. Cette étude nous a permis de démontrer que la toxicité cardiaque à long terme liée aux anthracyclines reste faible, et que la résonance magnétique est potentiellement plus précise que l’échographie cardiaque pour mesurer la fonction du ventricule gauche. Ceci devra cependant être confirmé dans d’autres études. Au cours de notre démarche, nous avons été confrontés à la difficulté de motiver les patientes plusieurs années après le traitement pour étudier les potentiels effets à long terme de ce dernier. 2) Le deuxième chapitre de cette thèse explore la toxicité cardiaque induite par l’anticorps monoclonal trastuzumab (anti-HER2). En un premier temps, nous avons examiné la toxicité cardiaque immédiate et à long terme au sein de la population de l’étude HERA, un large essai clinique randomisé de phase III du Breast International Group évaluant le bénéfice du trastuzumab en traitement adjuvant du cancer du sein HER2-positif. Après un suivi moyen de 8 ans des 5,102 participantes de l’étude, nous avons pu démontrer que la toxicité cardiaque demeure faible à long terme, avec très peu de nouveaux évènements cardiaques diagnostiqués dans la phase de suivi. Nous avons aussi pu démontrer que la toxicité cardiaque du trastuzumab apparait surtout pendant la phase de traitement, et qu’une fois le trastuzumab arrêté, la majorité des patientes récupèrent de l’épisode de toxicité cardiaque avec normalisation de la fraction d’éjection ventriculaire gauche. En un deuxième temps, en effectuant une analyse combinée de la toxicité cardiaque dans trois essais cliniques randomisés, nous avons démontré que l’usage concomitant du trastuzumab avec une chimiothérapie néo-adjuvante à base d’anthracyclines augmente le risque d’une toxicité cardiaque chez les patientes ayant un cancer du sein de stade précoce. Conséquemment, ces schémas de traitements ne sont pas recommandés de routine.En conclusion, une bonne évaluation cardiologique et oncologique doit avoir lieu avant de démarrer une chimiothérapie à base d’anthracyclines chez les patientes ayant un cancer du sein de stade précoce. Actuellement, la recommandation est d’évaluer les facteurs de risque cardiaque avant le traitement, et de suivre la fraction d’éjection du ventricule gauche avant, pendant et environs 6 mois après la fin du traitement. L’usage de marqueurs cardiaques et/ou de tests d’imagerie modernes pour un diagnostic de toxicité cardiaque tardive reste un domaine d’investigation intéressant. Pour les patientes avec un cancer du sein HER2-positif de stade précoce, le risque de toxicité cardiaque induite par le trastuzumab demeure faible. Cependant, les facteurs de risque doivent être évalués pour chaque patiente avant le traitement. L‘usage concomitant de trastuzumab et anthracyclines n’est pas recommandé vu le risque augmenté de toxicité cardiaque. En cas de facteurs de risque cardiaque, un dialogue étroit entre l’oncologue et le cardiologue est recommandé avant de débuter un traitement adjuvant. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La présence d’une immunité anti-tumorale est maintenant bien établie et ce, y compris dans le cancer du sein pourtant considéré comme peu immunogénique. Cette notion a été récemment renforcée dans différentes études qui ont mis en évidence une corrélation entre la présence d’un infiltrat immun au niveau des cancers du sein primaires et le pronostic des patientes. La réponse immune anti-tumorale n’est cependant pas assez efficace pour contrôler la survenue du cancer. En effet, différents mécanismes sont utilisés par les cellules tumorales pour échapper au système immunitaire comme l’expression de ligands inhibant les cellules immunes ou la production de médiateurs immunosuppresseurs dans le microenvironnement tumoral.Ces mécanismes sont la cible des thérapies immunomodulatrices visant à réactiver la réponse immune anti-tumorale. L’approche utilisant les inhibiteurs de points de contrôle a clairement montré des résultats très encourageants pour le traitement du mélanome et du cancer du poumon. De nombreux traitements immunomodulateurs sont actuellement à l’étude dans le cancer du sein. L’objectif de ce travail de thèse de doctorat est de caractériser la réponse immune dans le cancer du sein en s’intéressant plus particulièrement à l’infiltration lymphocytaire tumorale et à l’expression de marqueurs impliqués dans l’échappement au système immunitaire. La première partie de ce travail étudie différents aspects méthodologiques permettant la quantification histologique des cellules immunes. Il démontre que l’immunohistochimie offre des résultats très reproductibles et permet de distinguer des sous-types de lymphocytes ainsi que leur organisation en structures lymphoïdes tertiaires. Il démontre également que la quantification sur biopsies préthérapeutiques est représentative de la tumeur. Enfin, l’analyse d’images se révèle être un outil utile et fiable pour quantifier l’infiltration lymphocytaire tumorale.Le deuxième volet de cette thèse consiste en une caractérisation détaillée de la densité, de la composition, et de l’organisation de l’infiltrat lymphocytaire tumoral. L’analyse par cytométrie en flux montre que d’une part, les tumeurs sont plus infiltrées en lymphocytes que le tissu mammaire sain et d’autre part, cet infiltrat est composé d’un plus haut taux de lymphocytes T CD4 et B associé à une diminution du taux de CD8. Dans 60% des cas, des structures lymphoïdes tertiaires, composées d’un follicule delymphocytes B et de cellules dendritiques entourés de lymphocytes T, sont observées dans le stroma péri-tumoral. Le niveau d’infiltration lymphocytaire et son organisation en structures lymphoïdes sont positivement corrélées à l’expression de PD-1, un récepteur inhibiteur de l’activation des cellules immunes, et de son ligand PD-L1. La dernière partie de ce travail étudie l’expression de l’enzyme CD73 impliquée dans la production d’adénosine, un puissant médiateur immunosuppresseur dans le microenvironnement tumoral. L’expression de CD73 a été mesurée par immunofluorescence combinée à une analyse d’images dans une série de cancers du sein de type triple négatif. Celle-ci est significativement associée à un plus mauvais pronostic, et est inversement corrélée à l’infiltration immune. En conclusion, les résultats découlant des différents chapitres de cette thèse démontrent qu’une réponse immune est présente dans le cancer du sein et appuie la pertinence de développer des stratégies thérapeutiques pour renforcer la réponse immune anti-tumorale dans le cancer du sein. La combinaison de marqueurs immuns tels que ceux étudiés dans ce travail permettrait de mieux caractériser le type de réponse immune anti-tumorale afin de guider le choix de la thérapie immunomodulatrice et aussi de sélectionner plus adéquatement les patientes susceptibles d’en bénéficier. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Dans le domaine de l’épigénétique, la méthylation de l’ADN et les modifications des histones ont longtemps focalisé l’attention de la recherche biologique et médicale. Toutefois, notre vision de l’épigénétique s’est fortement élargie avec la découverte de « nouvelles » modifications épigénétiques de l’ADN et de l’ARN. Dès lors, au cours de cette thèse, nous avons voulu explorer trois de ces modifications, et leurs enzymes, dans le cadre des cancers du sein.Premièrement, nous avons étudié l’enzyme TET1, responsable de l’hydroxyméthylation de l’ADN (5hmC). Nous avons découvert que le niveau d’expression de TET1 dans les tumeurs mammaires basal-like corrélait avec les changements de 5hmC par rapport au tissu sain. Nous avons aussi établi un lien inédit entre la répression de TET1 et l’infiltration immune dans ces cancers. Nous avons ensuite démontré que cette répression était liée à l’activation canonique de NF-κB, un régulateur majeur de l’immunité et l’inflammation. Enfin, nous avons étendu ce nouveau mode de régulation de TET1 par l’immunité à d’autres types de cancers, y compris le mélanome, le cancer du poumon et le cancer de la thyroïde.Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons effectué la première étude transcriptomique d’une nouvelle modification de l’ARN, l’hydroxyméthylation de l’ARN (5hmrC). Chez la drosophile, nous avons révélé la distribution de cette marque le long du transcriptome, associé une fonction régulatrice de la traduction protéique à la marque et révélé le rôle central de 5hmrC et dTet, l’enzyme responsable de sa formation, dans le développement du système nerveux central. A la suite de cette étude pionnière, nous avons investigué 5hmrC en lignées mammaires et nous avons découvert plus de 700 ARNs différentiellement hydroxyméthylés dans les cellules cancéreuses par rapport aux cellules mammaires normales. Globalement, nos résultats indiquent que 5hmrC constitue un nouveau niveau de dérégulation de la fonction des gènes dans les cancers du sein.Dans la dernière partie, nous avons examiné le rôle de la méthylation de l’ARN (m6A) dans les cancers mammaires. Nous avons cartographié la distribution de m6A en lignées et en tissus humains et identifié près de 2000 ARNs différentiellement méthylés dans les cellules cancéreuses. Ensuite, nous avons découvert qu’une déméthylase de l’ARN, FTO, était sous-exprimée dans les cancers du sein, et nous avons démontré que cette dérégulation s’accompagnait d’une augmentation globale de m6A et d’un mauvais pronostic de survie chez les patients. In vitro, la sous-expression de FTO cause un phénotype plus agressif en termes de migration, invasion et caractère souche des cellules cancéreuses mammaires. Ainsi, nos résultats semblent assigner une fonction suppressive de tumeur à FTO dans la glande mammaire.En conclusion, nos résultats démontrent l’importance biologique des « nouvelles » modifications de l’ADN et l’ARN et de leur dérégulation dans le développement des tumeurs mammaires. Nos données mettent au jour de nouveaux mécanismes par lesquels l’épigénétique contribue au processus de cancérogénèse et indiquent que l’étude de ces modifications pourrait avoir une utilité clinique. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Cette thèse est axée en deux parties :une première partie explorant la dérégulation d’une modification épigénétique localisée sur l’ADN tandis que la seconde porte sur une modification des ARN messagers. Ces deux modifications sont étudiées dans le cadre du cancer du sein. La première partie concernant l’hydroxymethylation de l’ADN décrit l’influence de l’infiltration immune sur l’expression de l’enzyme TET1, responsable de l’ajout de cette modification. En effet, notre étude met en évidence une anti-corrélation entre l’expression de TET1 et l’infiltration immune (via IHC et analyses in silico). De plus, nous démontrons que l’activation de la voie de signalisation NF-B dans le cancer du sein « basal-like » réduit l’expression de TET1. Finalement, nous avons pu mettre en évidence, grâce à plusieurs expériences dont de l’immunoprécipitation que cette régulation se déroulait (au moins en partie) via liaison d’NF-B au promoteur de TET1. Dans le but d’élargir notre model à d’autres cancers, nous avons pu également observer cette anti-corrélation et l’effet de NF-B dans les cancers de la thyroïde, du poumon et de la peau. Avec le développement récent de l’immunothérapie, ce lien entre modification épigénétique et immunité pourrait s’avérer intéressant à exploiter. La seconde partie décrit quant à elle la dérégulation de la modification m6A dans le cancer du sein en général et non plus dans un sous-type particulier. Nous avons non seulement été en mesure de décrire une accumulation de la marque dans les tissus cancéreux mais également de proposer une cause et une conséquence à cette dérégulation. En effet, cette augmentation de la présence d’m6A (observée par spectrométrie de masse) serait causée par la baisse d’expression d’une enzyme responsable de sa suppression (l’enzyme FTO). Cette dérégulation, en agissant directement sur les ARNm de la voie de signalisation WNT comme le montre notre m6A-seq, active d’avantage la voie. Cette suractivation des WNT entraine alors une transition épithélio-mésenchymateuse des cellules, étape importante dans le développement de métastases. Ainsi, les patientes présentant une tumeur à basse expression de FTO pourraient être plus sujettes à des récurrences tumorales. Nous avons également observé cette même régulation dans d’autres cancers comme celui de la prostate, à la fois in vitro, in vivo et in silico. De plus, notre recherche met également en évidence une plus grande sensitivité de ces tumeurs à un inhibiteur des WNT. En effet, nos expériences de xénogreffes soulignent que des tumeurs avec peu de FTO, traitées avec l’inhibiteur des WNT ICRT-3, sont bien moins actives et grandes que les tumeurs contrôle et développent moins de métastases. Mesurer la quantité d’FTO tumorale pourrait donc en théorie permettre une meilleure discrimination des patientes pour de tels traitements. Ces deux projets ont pour but d’améliorer notre compréhension de l’épigénétique dans le cancer du sein et ainsi proposer de potentielles implications thérapeutiques.This thesis is divided in two parts: the first part explores the dysregulation of an epigenetic modification localized on DNA and the second part is centred on a mRNA modification. These two marks are being studied in the context of breast cancer (BC). The first part describes the influence of immune cell infiltration on the expression of the TET1 enzyme, which is responsible for the addition of hydroxymethylation to DNA. Our study indeed first describes an anti-correlation between TET1 expression and immune infiltration (through both IHC and in silico analysis). In addition, we show that NF-B pathway activation in « basal-like » breast cancer cells downregulates TET1 expression. Finally, we highlighted through several experiments including immunoprecipitation, a TET1 promoter binding of NF-B. In an effort to generalize our data to other cancers, we also investigated this anticorrelation and the NF-B regulation in several cancers. Our results indicate that this immune related regulation also occurs in lung, thyroid and skin cancers. With the increasing use of immunotherapy as anti-cancer treatment, this link between an epigenetic modification and immunity might be interesting to explore. The second part focuses on the dysregulation of the m6A modification in breast cancer in general. We describe an accumulation of m6A in cancerous tissues and we further unravel cause and consequence of this dysregulation. Indeed, we show that this increase of m6A observed by mass spectrometry correlates with the downregulation of an enzyme (FTO), which is responsible for the removal of this mark. In addition, we observed with TCGA data that this downregulation occurs in multiple cancers such as prostate or lung cancers. Our results indicate that this dysregulation activates the WNT pathway through interaction with WNT related mRNAs (identified by our m6A-seq). This overactivation (observed with TOP FOP, IHC and western blot assays) promotes epithelialmesenchymal transition (EMT) which is essential in the development of metastasis. Consistent with this, we observed that patients with low FTO expressing breast tumors are more prone to tumor progression and recurrence. Moreover, we were able to generalize our data to other cancers including prostate cancer both through in vitro, in vivo and in silico data. Finally, our research also shows a greater sensitivity of FTO-low tumors to WNT inhibition. Indeed, our mice xenografts experiments showed that FTO-low tumors treated with the WNT inhibitor ICRT-3 are less metabolically active, smaller than controls and develop less metastasis. Measuring the amount of FTO in tumors could therefore allow for the stratification better of breast cancer patients for WNT inhibition therapy. Both projects aim to improve our understanding of the role of epigenetics in breast cancer and thus propose potential therapeutic implications. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le nombre de personnes atteintes d’un cancer ne cesse de croître, alors que le nombre d’infirmières pivots en oncologie (IPO) se stabilise. Devant ce constat, les IPO et leurs gestionnaires sont appelées à revoir, identifier et délimiter leur contribution auprès des personnes atteintes d’un cancer. Le but de cette étude descriptive est de détailler les activités des soins effectuées concrètement par les IPO locales et les IPO suprarégionales. Le cadre de référence mixte composé des grandes fonctions infirmières proposées par Dallaire et al. (2008) et la définition du rôle de l’IPO proposé par Fillion et al. (2012) a servi de guide à cette recherche. À partir de l’échantillon non probabiliste à choix raisonné, composé de cinq participantes, l'étudiante chercheure a utilisé comme méthode de collecte de données, l’observation structurée non participante de la pratique des infirmières et des entrevues individuelles semi-structurées. Les résultats montrent que les IPO font plus d’activités de soins se rapportant à la dimension clinique (55 %) qu’à la dimension organisationnelle (45 %). Les IPO font principalement des activités de la fonction coordonner et soigner. La fonction de coordination est celle qui arrive au premier rang avec 41 % des activités de soins observées alors que les activités de soins se rapportant à la collaboration (4 %) sont peu observées. Toutefois, sans généraliser les résultats, l’ensemble des activités de soins semble être affecté positivement par un bon fonctionnement d’une équipe interdisciplinaire dans laquelle il y a une trajectoire de soins structurée. / Even while the number of cancer patients continues to grow, the number of nurse navigators (NNs) has plateaued. Given this situation, NNs and their managers must review, identify and delimit their contribution to the care of cancer patients. The purpose of this study is to provide a detailed description of the care activities actually performed by local and supra-regional NNs. The present research project has been guided by the mixed framework consisting of the main nursing functions, as set out by Dallaire et al. (2008), and the definition of the NN’s role, as set out by Fillion et al. (2012). Working from a non-probability judgment sample consisting of five participants, the student researcher employed a data collection method based on the structured non-participatory observation of the practice of these nurses coupled with individual semi-structured interviews. The results show that NNs perform more care activities in relation to the clinical dimension (55%) than to the organizational dimension (45%). NNs primarily perform co-ordinating and caring functions. Co-ordinating ranks first, at 41% of the observed care activities, while collaboration-related activities (4%) are seldom observed. That being said, and without generalizing the results, it would appear that all care activities are positively affected by the sound performance of an interdisciplinary team working according to a well-structured care trajectory.

L’objectif général du travail de thèse a donc été d’analyser le rôle respectif du volume tumoral et des paramètres pharmacocinétiques dans la réponse au rituximab en utilisant des moyens d’imagerie adaptés aux modèles murins et à la cancérologie. Dans une première partie nous avons utilisé une lignée lymphomateuse T (El4) syngénique de souris C57Bl6J, transduite par le CD20 humain et transfectée avec le gène de la luciférase. Dans une seconde partie une seule injection de rituximab a été réalisée et la concentration a été évaluée par une méthode ELISA. L’analyse des concentrations au cours du temps nous a permis de montrer une très grande variabilité d’exposition au rituximab semblable à l’observation faite chez l’homme. Nous avons pu modéliser les concentrations de rituximab et la progression des foyers tumoraux par la construction d’un modèle concentration/effet nous permettant de démontrer l’existence d’une relation entre l’efficacité du rituximab et le volume tumoral. Enfin dans un troisième volet nous avons utilisé le modèle cellulaire afin d’évaluer in vitro l’usage de particules d’oxydes de gadolinium ou de bore. / The overall objective of this work of thesis was to analyze the respective role of tumor burden and pharmacokinetic parameters in the response to the rituximab by using systems of imagery adapted to murine models and to cancerology. In a first part of development of the model we used a T lymphoma cell line (El4) syngenic of mouse C57Bl6J, transduted by the human CD20 and transfected with luciferase gene. In a second part, one injection of rituximab was carried out and the circulating concentration was evaluated by an ELISA method. The analysis of the rituximab concentrations in the course of time enabled us to show a very important variability of exposure to the rituximab similar to the observation made for the human. We realized a model of the rituximab concentrations and of the tumors evolution by the construction of a concentration/effect model allowing us to show the existence of a relation between the effectiveness of the rituximab and tumor burden before treatment. Finally in a third part we used the cellular model El4-huCD20-Luc in order to evaluate in vitro the use of gadolinium oxide particles or boron and gadolinium oxide particles.

Dans le cadre du projet MultiFun par lequel cette thèse a été financée, nous avons travaillé en collaboration avec des équipes européennes de synthèse chimique pour proposer des nanoparticules d'oxydes de fer dédiées à la détection et au traitement du cancer par hyperthermie magnétique. Habituellement, l'efficacité des nanoparticules est déterminée par la valeur du SAR (Specific Absoption Rate, en W/g), mesuré par élévation de température. Nous avons développé un banc permettant la mesure de cycles d'hystérésis dans les mêmes gammes d'amplitude et de fréquence de champs magnétiques que celles utilisées habituellement en hyperthermie magnétique. Le cycle d'hystérésis fourni plus d'informations sur l'échantillon et permet par exemple d'évaluer l'importance des interactions inter-particulaires. Le projet MultiFun prévoyait également l'étude du traitement in vivo. Le LPCNO a donc développé un inducteur adapté aux expériences sur le petit animal (souris, rats). Cet électroaimant refroidit à l'air a un entrefer de 3 cm et fonctionne à un champ de 23 mT pour des temps de traitements d'une heure. Nous avons également collaboré avec le Laboratoire de Réceptologie et Ciblage Thérapeutique en Cancérologie pour effectuer des expériences d'hyperthermie magnétique in vitro au moyen de nanoparticules fonctionnalisées puis internalisées de manière spécifique dans les lysosomes. L'application d'un champ magnétique haute fréquence aux cellules contenant ces nanoparticules induit de forts pourcentages de mort cellulaire (principalement par voies apoptotique). Dans ces travaux, les nanoparticules ont de faibles SAR et sont présentes en faibles quantités dans les cellules, ce qui n'engendre pas d'élévations de températures mesurables. L'efficacité du traitement dans ces conditions pose nombre de questions quant aux mécanismes réels entrainant la mort de la cellule. Pour tenter de répondre à ces questions, nous avons conçu un système permettant d'appliquer des champs magnétiques hautes fréquences in vitro sous un microscope confocal à fluorescence couramment utilisé pour suivre des mécanismes intracellulaire à l'aide de fluorochromes. On introduit un électroaimant miniaturisé (largeur d'entrefer ≈ 400 μm) directement dans une boite de culture cellulaire. On génère ainsi un champ d'environ 60 mT à 300 kHz. Cette méthode nous permet d'observer les cellules et leurs organites durant le temps de traitement. Les niveaux de mort cellulaire atteints ici sont équivalents aux expériences précédentes, et valident ainsi l'utilisation de cet inducteur à entrefer réduit. Pour l'heure, nous avons quantifié l'apparition en temps réel des ROS (Reactive Oxygen Species) dans la cellule lors de l'application du champ. Nous avons également mis en lumière la perméabilisation lysosomale, qui peut engendrer la libération d'agents de mort cellulaires. Enfin cet outil permettra de continuer les recherches de mécanismes intracellulaires pour des échantillons soumis à un champ magnétique extérieur. Les nanoparticules soumises à un champ magnétique alternatif peuvent également être utilisées comme catalyseurs de réactions chimiques. Nous avons utilisé les nanoparticules synthétisées au LPCNO comme catalyseurs de la réaction Fischer-Tropsch. Ce procédé permet de produire industriellement des hydrocarbures à partir de monoxyde de carbone et de dihydrogène. Des caractérisations poussées des propriétés structurales, magnétiques, d'échauffement et de catalyse ont été menées sur des nanoparticules possédant un cœur de fer recouvert d'un métal catalytique (ruthénium ou cobalt). La preuve que ces nanoparticules peuvent catalyser la réaction de Fischer-Tropsch lorsqu'elles sont soumises à un champ magnétique haute-fréquence a été établie, et une bonne corrélation entre leur puissance de chauffe et leur activité catalytique a été montrée. / As partners of Multifun by which this thesis was funded, we have worked with European groups of chemists to provide iron oxide nanoparticles dedicated to the detection and treatment of cancer by magnetic hyperthermia. Usually, the nanoparticles efficiency is determined by the SAR value (Specific Absoption Rate, in W / g), measured by a calorimetric method. We have developed a device for measuring hysteresis loops at the same amplitude and frequency range of magnetic fields than those usually used in magnetic hyperthermia. Hysteresis loops provide more information about the samples and allows for example to assess the importance of inter-particle interactions. Multifun project also included the study of in vivo treatments. LPCNO has developed an inductor suitable for experiments on small animals (mice, rats). The electromagnet is air-cooled, displays a gap of 3 cm and operates at a field of 23 mT during one hour. We also worked with the Laboratoire de Réceptologie et Ciblage Thérapeutique en Cancérologie, Toulouse, to perform in vitro magnetic hyperthermia experiments using functionalized nanoparticles specifically internalized into lysosomes. The application of a high frequency magnetic field to the cells containing these nanoparticles induces a significant cell death (mainly apoptotic pathways). In these studies, the nanoparticles have low SAR, and are present in small quantities in the cells. Thus no temperature rise is measured during the experiments. The efficacy of treatment in these conditions poses many questions about the actual mechanisms at the origin of cell death. To try to answer these questions, we have designed a setup permitting to apply high frequency magnetic fields under a confocal fluorescence microscope; the latter is commonly used to monitor intracellular mechanisms with fluorochromes. We introduce a miniaturized solenoid (gap width ≈ 400 µm) directly into a cell culture box. This generates a field of approximately 60 mT at 300 kHz. This method allows us to observe the cells and their organelles during the time of treatment. Infected cell death levels here are equivalent to the previous experiments, which thus validates the use of this reduced gap inductor. For now, we quantified the appearance of ROS (Reactive Oxygen Species) in real time in the cell during the application of the field. We also evidenced the lysosomal permeabilization, which can cause the release of cellular death agents. Finally this tool will serve to continue research on intracellular mechanisms in cells inside an external high-frequency magnetic field. Nanoparticles subjected to an alternating magnetic field can also be used as catalysts of chemical reactions. We used the nanoparticles synthesized LPCNO as catalysts for the Fischer-Tropsch reaction. This process allows the industrial production of hydrocarbons from carbon monoxide and hydrogen gas. Extensive characterizations of structural, magnetic, heating and catalysis properties were carried out on nanoparticles with an iron core coated with a catalytic metal (ruthenium or cobalt). Evidence that these nanoparticles catalyze the Fischer-Tropsch synthesis when subjected to a high-frequency magnetic field has been established, and a good correlation between their heating power and their catalytic activity has been shown.

The central role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in physiological and pathological angiogenesis makes it attractive both as a therapeutic target for anti-angiogenic drugs in cancer treatment and as a pro-angiogenic cytokine to treat ischemic disease. Currently, it is well established that the VEGF but also other growth factors exert their angiogenic effects partly through the activation of endothelial nitric oxide synthase (eNOS). A better understanding of the VEGF/NO signaling pathway could therefore lead to the identification of new therapeutic targets to impact on angiogenesis.This thesis is based on four different articles, the principal findings of which are summarized here below. First, we demonstrated that, chronologically, endothelial cell exposure to VEGF first led to eNOS dissociation from caveolin (a hallmark of the Ca2+/CaM-mediated activation of eNOS), and then to the interaction of eNOS with the heat shock protein hsp90. We also reported that eNOS-bound hsp90 could recruit VEGF-activated (phosphorylated) Akt to the complex, which in turn could phosphorylate eNOS on the serine 1177. Finally, we found that although the VEGF-induced phosphorylation of eNOS led to a sustained production of NO independently of a maintained increase in intracellular [Ca2+], this late stage of eNOS activation was strictly conditional on the initial VEGF-induced Ca2+-dependent stimulation of the enzyme. These data established the critical temporal sequence of events leading to the sustained activation of eNOS by VEGF and suggested new ways of regulating the production of NO in response to this cytokine through the structural protein caveolin and the ubiquitous chaperone protein, hsp90. A second study identified caveolin and Hsp90 as key players in the proangiogenic action of statins and therefore as potential pharmacological targets to modulate NO-dependent angiogenesis. We found that atorvastatin stabilized endothelial tube formation from both outgrowing and isolated macrovascular ECs cultured in Matrigel through a decrease in caveolin abundance and in its inhibitory interaction with eNOS. In a similar angiogenic assay, microvascular endothelial cells appeared also responsive to statins, not through a decrease in the caveolin pool (which is (too) large in these cells) but via the increased recruitment of hsp90 in the eNOS complex and the associated eNOS phosphorylation on the serine 1177. These data provided new mechanistic insights into the NO-mediated effects of statins and underscored the potential of these drugs and other modulators of hsp90 and caveolin abundance to promote neovascularization in disease states associated or not with atherosclerosis. In a third study, we have reported a net decrease in the ability of cultured ECs expressing recombinant caveolin to migrate and to form capillary like networks (e.g. the crucial steps occurring during the angiogenic process) in presence of VEGF. We then exploited the propensity of cationic lipids to target EC lining tumor blood vessels to transfect tumor-bearing mice in vivo. A dramatic tumor growth delay associated to a decrease in tumor microvessel density in the central core of the tumor was observed in mice transfected with caveolin versus sham-transfected animals. Interestingly, we also found that in the early time after lipofection (e.g. when macroscopic effects on tumor growth were not yet detectable), caveolin expression also impaired NO-dependent tumor blood flow. These findings indicated that besides (before) acting as an anti-angiogenic agent, recombinant caveolin can modulate the endothelium phenotype and impact on the tumor blood flow, both effects leading to a decrease in tumor growth. Finally, we showed that the activation of the VEGF/NO signaling pathway led to the down-regulation of adhesion molecules and to the anergy of endothelial cells. We found, indeed, that the adhesion of human CD8+ lymphocytes on microvascular endothelial cells exposed to TNF-a was dramatically reduced in the presence of VEGF. Interestingly, we also documented that the co-administration of the NOS inhibitor L-NAME or the Hsp90 inhibitor geldanamycin could restore this adhesion to the level originally obtained with TNF-a alone. Finally, we confirmed the key role of NO in the VEGF-mediated effects on the CD8+ adhesion by tipping the balance towards more or less angiogenesis through the transfection of caveolin siRNA or caveolin plasmid, respectively. In these experiments, lymphocyte adhesion appeared directly correlated to the extent of caveolin expression, confirming that the so-called anti-angiogenic strategy can directly impact on the phenotype of (tumor) endothelial cells and instead of (before) killing them, be exploited to potentiate cancer immunotherapy. In conclusion, by dissecting the post-translational regulation of eNOS, we have identified major therapeutic targets, namely caveolin and hsp90, that may be exploited either to block or promote angiogenesis. More particulary, cDNA encoding for these proteins or their mutant form, when combined with adequate mode of delivery, appeared to exert profound effects on the vascular compartment of tumors but also of ischemic tissues.

En 2016, environ 53 070 patients ont reçu un diagnostic d'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDA) aux États-Unis et la plupart d'entre eux mourront de leur maladie dans les 5 ans. Le registre belge du cancer rapporte une incidence estimée à 1200 nouveaux cas par an. La survie globale à 5 ans pour toutes stades confondus a marginalement augmenté au cours des 50 dernières années, passant de 2 à 6%, malgré l'imagerie, les soins périopératoires et l'amélioration des techniques chirurgicales.La chirurgie reste la seule chance de guérison, cependant, seulement 10-15% des patients nouvellement diagnostiqués sont jugés éligibles pour une chirurgie. Même s'il existe peu d'autres modalités de traitement efficaces qui puissent considérablement prolonger la survie globale, la plupart des patients finiront par mourir de métastases au foie, au poumon et / ou au péritoine, les sites de propagation les plus courants. Les patients, les cliniciens et les chercheurs restent frustrés par le manqué d’outils thérapeutiques et des nouvelles stratégies sont nécessaires pour comprendre et mieux prendre en charge cette maladie.Le terme «cancer» engendre un sentiment de peur et colère, en particulier quand on est confronté au diagnostic dévastateur de cancer du pancréas. En plus, une réaction commune est de personnifier le cancer comme une entité maléfique qui doit être combattue pour sauver la vie du patient. Les armes pour cette bataille comprennent le scalpel d'un chirurgien, la chimiothérapie, la radiothérapie, les thérapies ciblées, les immunothérapies, les approches holistiques et la foi religieuse. Mais nous avons trop souvent oublié ou sous-estimé la contribution de la recherche translationnelle pour la médecine de précision, pour mieux adapter les thérapies et éviter les toxicités inutiles.Dans un sens biologique, qu'est-ce qu'un cancer du pancréas ou un cancer? Le cancer est une maladie génétique, soumise à un phénomène évolutif avec ses propres règles, contraintes et caractéristiques prévisibles qui mènent finalement à un phénotype unique.La stratégie "one size fits all" dans la PDA a souvent échoué dans les essais de nouveaux médicaments dans une population non sélectionnée.Cette thèse est une contribution modeste et authentique à une approche plus personnalisée du PDA, de l'acquisition tissulaire, à l'analyse de biomarqueurs tissulaires, à une analyse moléculaire plus profonde afin de mieux comprendre cette maladie mortelle et de proposer l'intégration de biomarqueurs dans le developpement d’etudes cliniques guides par les analyses moléculaires. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished