La maladie de Chagas, due au protozoaire Trypanosoma cruzi, est un important problème de santé publique en Amérique latine. Le parasite peut se transmettre à l’homme via un vecteur de la famille des triatomes, par transfusion sanguine ou transplantation d’organe et congénitalement de la mère à son fœtus. Le Laboratoire de Parasitologie s’est particulièrement intéressé à la maladie de Chagas congénitale. Dans le cadre de cette thématique, le Laboratoire a montré que les nouveau-nés congénitalement infectés par T. cruzi développent une forte réponse lymphocytaire T CD8+ spécifique semblable à celle des adultes, accompagnée d’une production d’interféron-gamma (IFN-g), et ce en dépit de l’immaturité bien connue du système immun néonatal. En effet, le système immun néonatal est naturellement orienté vers le développement de réponses immunes Th2 tandis que la réponse Th1 est inhibée. De multiples mécanismes sont à l’origine de cette déviation en début de vie. Certaines déficiences au niveau des cellules du système immun inné y contribuent, dont la difficulté des cellules dendritiques (DCs) à produire de l’IL-12, cytokine clé dans l’induction d’une réponse Th1. Les multiples déficiences du système immun en début de vie rendent les nouveau-nés et jeunes enfants particulièrement sensibles aux pathogènes et limitent l’efficacité des vaccins administrés en début de vie. <p>Afin de mieux connaître les mécanismes par lesquels T. cruzi induit cette forte réponse immune de type 1 chez les nouveau-nés, nous nous sommes intéressés à l’activation de la réponse immune innée par le parasite. De nombreuses cellules peuvent être impliquées dans la mise en place d’une réponse de type 1, dont les cellules dendritiques (DCs), les monocytes et les cellules NK. Le Laboratoire de Parasitologie a montré que T. cruzi activait in vitro les DCs néonatales, les rendant capables d’induire une réponse lymphocytaire T plus orientée vers la production d’IFN-g. D’autres données obtenues chez les nouveau-nés congénitalement infectés par T. cruzi suggèrent que les cellules NK ont été activées in utero quand le parasite a été transmis par la mère infectée. Nous nous sommes ici intéressés à la capacité des cellules NK néonatales à produire rapidement de l’IFN-g en réponse à T. cruzi. Une telle production précoce est en effet un élément contribuant à orienter une réponse immune de type 1.<p>Nous avons effectué des co-cultures de cellules mononucléaires de sang de cordon de nouveau-nés sains (CBMC) ou de sang périphérique adulte (PBMC) avec des trypomastigotes vivants de T. cruzi. Nos résultats montrent qu’en présence d’IL-15, T. cruzi induit une forte production d’IFN-g par les CBMC. Cette réponse est précoce et est accompagnée d’une production de TNF-a mais pas d’IL-10. Les cellules NK CD56brightCD16-/low et CD56dimCD16- sont les meilleures productrices d’IFN-g dans les deux groupes d’âges. La réponse des cellules NK néonatales est substantielle mais reste légèrement inférieure à celle des cellules adultes. Nous avons par ailleurs observé un déficit de production précoce d’IFN-g par les cellules T CD3+CD56+ (NK-like) et CD3+CD56- (« classiques ») néonatales par rapport aux cellules adultes. <p>La réponse IFN-g par les cellules NK est proportionnelle aux concentrations de parasites et d’IL-15 et accompagnée d’une activation phénotypique des cellules NK. Il est bien connu que des cellules accessoires telles que les cellules dendritiques et les monocytes contribuent généralement à activer indirectement les cellules NK. Des expériences de déplétion cellulaire indiquent que la production d’IFN-g par les cellules NK néonatales sensibilisées par l’IL-15 fait intervenir les monocytes mais pas les DCs myéloïdes, et qu’un contact avec les monocytes est nécessaire. De plus, elle requiert un contact du parasite vivant avec les CBMC et implique l’engagement des TLR2 et TLR4, ainsi qu’une production endogène d’IL-12. <p>Enfin, nous avons observé que les monocytes, et non les DCs myéloïdes, sont la source précoce de l’IL-12p70. Les parasites sont capables d’induire la synthèse de cette cytokine importante pour l’initiation d’une réponse de type 1 en l’absence de cytokines additionnelles, aussi bien dans les monocytes néonataux qu’adultes. La synthèse d’IL-12 par les monocytes s’accompagne d’une augmentation de l’expression de molécules co-activatrices CD40, CD80 et CD83 à leur surface. Ces dernières pourraient dès lors jouer un rôle supplémentaire dans l’activation indirecte des cellules NK néonatales par le parasite.<p>Cet ensemble de résultats montre que T. cruzi active les cellules néonatales du système immunitaire et plus particulièrement la production d’IL-12 par les monocytes et d’IFN-g par les cellules NK. Cette voie d’activation monocytes – IL-12 – cellules NK – IFN-g pourrait contribuer à la levée de l’immaturité du système immun des nouveau-nés congénitalement infectés décrite plus haut. Ces observations ont d’importantes implications pour la compréhension des mécanismes de protection en début de vie et pourraient aboutir à la mise au point d’un nouvel adjuvant vaccinal permettant de réduire la polarisation Th2 physiologique des nouveau-nés. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le virus de la rage est un pathogène neurotrope qui, actuellement, fait toujours plus de 55000 morts par an et dont la pathogenèse présente toujours de nombreuses zones d’ombre. Le mécanisme par lequel le virus échappe au système immunitaire de même que l’implication d’autres types cellulaires, particulièrement au niveau de la phase de latence, n’est pas encore connu. Il en est de même pour le mécanisme par lequel le virus induit un dysfonctionnement neuronal. Dans le cadre de ce projet de thèse, nous avons donc décidé d’étudier l’implication du macrophage et des caspases dans l’infection induite par le virus rabique. <p>Nos résultats ont permis de démontrer que, malgré la faiblesse de la production virale in vitro, les macrophages infectés par une souche virulente de virus rabique étaient capables de transmettre l’infection et d’induire une encéphalite mortelle chez la souris. Ces résultats suggèrent que les macrophages sont susceptibles d’être des hôtes potentiels du virus.<p>Dans un deuxième temps, nous avons également mis en évidence des différences de caractéristiques d’infection entre les souches virulentes et atténuées du virus rabique. Nous avons en effet démontré qu’en comparaison avec la souche vaccinale ERA, l’infection par la souche virulente CVS-11 était moins productive dans les cellules d’origine périphérique, tels que les cellules musculaires ou les macrophages. En revanche, la souche virulente se réplique mieux dans le cerveau et dans les cellules d’origine neuronale. Chez le macrophage, nous avons pu observer que l’infection par la souche atténuée ERA induisait une plus forte mortalité que celle générée par la souche CVS-11. Nos analyses ont mis en évidence que cette mortalité était de type apoptotique et qu’elle impliquait l’activation des caspases-1, -3, -7, -8, -9, du facteur Bid et de l’IL-1β. Des analyses réalisées sur des macrophages knock-out pour les caspase-1, -3 et -7 ont démontré d’une part l’importance de la caspase-3 dans la mortalité cellulaire et d’autre part qu’une déficience en caspase-7 pouvait être associée à une charge virale plus élevée, particulièrement en cas d’infection avec la souche virulente. In vivo, nous avons observé que l’inoculation de la souche CVS-11 chez des souris déficientes en caspase-3 retardait l’apparition des symptômes et de la mortalité sans pour autant modifier l’issue inéluctable de la maladie. Chez les souris caspase-1 knock-out, l’inoculation d’une souche atténuée entrainait une morbidité plus élevée que celle observée chez les souris WT.<p>Ce travail de thèse nous a donc permis d’améliorer notre compréhension des mécanismes impliqués dans la pathogénèse du virus rabique et dans la réponse de l’hôte à l’infection et a souligné le rôle potentiel du macrophage comme vecteur de dissémination virale/<p><p>Rabies virus is a neurotropic pathogen which currently causes more than 55000 deaths a year and our knowledge on its pathogenesis still contains many gaps. The mechanism by which the virus escapes the immune system as well as the involvement of different cell types, particularly in the asymptomatic phase, is still unknown. The situation is similar for the mechanism by which the virus induces neuronal dysfunction. In this work, we decided to study the involvement of caspases and the macrophage in infection induced by rabies virus.<p>Our results demonstrated that, despite a weak virus production in vitro, macrophages infected with a virulent strain of rabies virus were able to transmit infection and induce fatal encephalitis in mice. These results suggest that macrophages may be potential cellular hosts of rabies virus.<p>In a second step, we demonstrated differences in infection characteristics between virulent and attenuated rabies virus strains. Indeed, we showed that, in comparison with the ERA vaccine strain, infection with the virulent strain CVS-11 strain was less productive in cells of peripheral origin, such as muscle cells or macrophages. In contrast, the virulent strain replicated best in the brain and in neuronal cells. In the macrophage, we observed that infection with the attenuated strain ERA strain induced a higher mortality than that induced by the CVS-11 strain. Our analyzes showed that mortality was apoptotic and involved the activation of caspases-1, -3, -7, -8, -9, IL-1β and cleavage of Bid. Analyzes performed on macrophages deficient for caspase-1, -3 or -7 indicated the importance of caspase-3 in cell death and demonstrated that a deficiency in caspase- 7 could be associated with a higher viral loadd, particularly in case of infection with the virulent strain. In vivo, we observed that the inoculation of the CVS-11 strain in mice deficient in caspase-3 delayed the onset of symptoms and mortality without changing the fatal outcome of the disease. Inoculation of caspase-1 knockout mice with the attenuated strain resulted in a higher morbidity than that observed in wild type mice.<p>This work allowed us to improve our understanding of the mechanisms involved in the pathogenesis of rabies virus and in the host response and highlighted a potential role for the macrophage as a vector of virus dissemination.<p><p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Poly(ADP-ribose) polymerases belong to a family of proteins with 17 members in human beings. PARP1, the founding member of the family is a protein that synthesizes linear or branched polymers of ADP-ribose on itself or on target proteins. Different members of this family, that do not all possess ADP-ribosyl polymerase activity, are involved in the regulation of various cellular mechanisms. Some members of the family are particularly involved in the positive or negative control of the immune response. PARP1 is a key player in the regulation of inflammation, through its positive control of cell death and of proinflammatory cytokine production. On the other hand, the tankyrases (PARP5a and PARP5b) and PARP14 seem to regulate inflammatory responses in a negative fashion. PARP12 is a poorly characterized member of the family, whose expression is greatly increase following stimulation with type-I interferons, cytokines mainly involved in antiviral defences.<p>PARP12 is a protein that possesses three main domains: A putative RNA binding N-terminal domain composed of tandem CCCH zinc-fingers, a central WWE domain and a C-terminal PARP catalytic domain. In this work, we have shown that the expression of PARP12 is strictly-dependent on type-I interferons, that it possesses ADP-ribosyl transferase activity and that in can regulate the translation of messenger RNA into proteins. PARP12 can be found in stress granules, sites of storage of untranslated mRNAs, and is capable of directly inhibiting the translation of a reporter mRNA when tethered to it, in a manner dependent on its catalytic activity. Furthermore overexpression of wild-type PARP12, in contrast to overexpression of a mutant with no detectable catalytic activity (PARP12-G575W), leads to a general arrest of most cellular translation.<p>On the other hand, we have shown that PARP12 can activate the transcription of genes under the control of an NFκB-dependent promoter, especially when its zinc-fingers are deleted or mutated (PARP12ΔZnF). PARP12ΔZnF is located in structures that can enclose TRIF, RIP1, NEMO, p62/SQSTM1 and ubiquitin. These proteins have all possess an important role in the activation of NFκB signalling cascades. Moreover, we have shown that endogenous PARP12 is situated in ALIS (Aggresome-Like Induced Structures) in LPS-stimulated macrophages. These structures have a possible role in the presentation of antigens on class I major histocompatibility complexes, implying that PARP12 may be involved in the regulation of antigen presentation. <p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Malgré l’existence de différents vaccins protecteurs à l’égard des infections par B. pertussis, la coqueluche reste une maladie infectieuse fréquente et est encore actuellement responsable de 300.000 décès par an dans le monde. Une meilleure compréhension des réponses immunitaires induites par les principaux facteurs de virulence de B. pertussis est donc importante afin d’optimaliser la vaccination. Alors que le rôle des anticorps dans la protection contre la coqueluche est reconnu depuis de nombreuses années, celui des réponses d’immunité cellulaire a été identifié mais est moins bien caractérisé. <p>Dans ce travail, nous avons analysé différents aspects des réponses d’immunité cellulaire induites par deux antigènes majeurs de B. pertussis, l’hémagglutinine filamenteuse (FHA) et la toxine pertussique (PT) chez des nourrissons. Nous avons étudié la persistance des réponses spécifiques des antigènes de B. pertussis après la primo vaccination des nourrissons et caractérisé différents facteurs qui modulent ces réponses, nous permettant ainsi de comprendre l’hétérogénéité des réponses d’immunité cellulaire observées tant qualitativement que quantitativement. <p>Nous avons montré que les réponses immunitaires spécifiques de la FHA et de la PT pouvaient persister jusqu’à neuf mois après la dernière administration du vaccin contre la coqueluche. Ces réponses immunitaires sont caractérisées par une production d’interféron-gamma (IFN-&61543;) par les cellules sanguines circulantes (PBMC), par une prolifération lymphocytaire ainsi que par une production d’anticorps. Bien que les lymphocytes T CD8+ participent à la sécrétion spécifique d’IFN-&61543; leur participation semble quantitativement moins importante que celle des lymphocytes T CD4+ et dépendante de ces derniers. Cependant, les PBMC de certains enfants vaccinés ne produisent pas ou peu d’IFN-&61472;&61543; après stimulation in vitro par les antigènes de B. pertussis. Cette inhibition, voire absence, de réponse immunitaire de type Th1 spécifique est associée à une sécrétion constitutive d’IL-10 par les monocytes ou à la présence de lymphocytes T CD8+. Enfin, étant donné que la FHA est inductrice d’IL-10 dans un modèle in vitro murin, nous avons analysé son effet sur la production in vitro de cette cytokine par les cellules dendritiques humaines (DCs). Nous avons montré que la FHA induit bien une production d’IL-10 par les DCs mais également les productions d’IL-12p70, d’IL-6 et d’IL-23, cytokines impliquées dans la différenciation des lymphocytes T naïfs en lymphocytes T effecteurs Th1 ou Th17. Parallèlement, nous avons testé une forme tronquée de FHA, la FHA 44 qui est également protectrice dans un modèle murin d’infection par B. pertussis. Nous avons montré que cette FHA tronquée n’induit pas de production d’IL-10 tout en induisant une production d’IL-12p70 et d’IL-23 par les DCs. La forme moléculaire de FHA présente dans les vaccins joue donc un rôle déterminant sur le type de réponses immunitaires induites et le remplacement de la FHA native dans les vaccins acellulaires par la FHA 44 devrait potentiellement permettre une meilleure réponse IFN-& / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Rasa3 est un membre de la famille GAP1 des GTPase activating proteins. Cette protéine stimule la fonction GTPase intrinsèque des petites protéines G telles que Ras et Rap. Rasa3 présente une haute affinité pour l’Ins(1,3,4,5)P4 et le PtdIns(4,5)P2, et est principalement exprimée dans les cellules du système hématopoïétique chez la souris.<p>Dans le but d’étudier chez la souris le rôle physiologique de Rasa3 dans les cellules hématopoïétiques, nous avons d’une part généré et analysé des souris transgéniques surexprimant une forme normale (TgN) ou mutée et catalytiquement inactive (TgM) de la protéine Rasa3 dans les lymphocytes B et/ou T. D’autre part, nous avons reçu des souris Rasa3+/- exprimant une protéine Rasa3 tronquée et catalytiquement inactive. Comme les souris Rasa3-/- meurent pendant la gestation, des transferts de cellules hématopoïétiques souches de foie fœtal d’embryons Rasa3-/- ont été réalisés dans des souris SCID. Les souris SCID après reconstitution développent le système hématopoïétique des souris Rasa3-/-.<p>Nous avons découvert que l’expression de Rasa3 est régulé au niveau de l’ARNm et de la protéique après activation des lymphocytes B par la voie du récepteur aux antigènes (BCR).<p>L’analyse des souris Rasa3 TgN a permis de mettre en évidence une diminution de la survie des lymphocytes B in vitro et une diminution de la réponse immune à un antigène T-indépendant (TI) in vivo. Les souris TgM présentent un phénotype inverse aux souris TgN.<p>Six à 8 semaines après reconstitution, les souris SCID Rasa3-/- présentent un phénotype opposé à celui des souris TgN :leurs lymphocytes B ont une meilleure survie in vitro et une meilleure réponse immune à un antigène TI in vivo. On observe également chez ces souris SCID Rasa3-/- une augmentation du nombre de lymphocytes B dans certaines sous-populations spléniques.<p>L’observation prolongée des souris SCID Rasa3-/- a mis en évidence une diminution de leur survie. A l’autopsie, 90% d’entre elles développent une splénomégalie reflétant une hématopoïèse extra-médullaire. Soixante pourcents d’entre-elles présentent de l’ostéosclérose dans de la cavité médullaire du fémur, associée à une augmentation du pourcentage de mégacaryocytes. D’un point de vue sanguin, les souris SCID Rasa3-/- développent une thrombocytopénie sévère. Des hémorragies et une anémie régénérative ont également été observées. Les causes exactes de la thrombocytopénie doivent encore être investiguées dans le cadre de ce travail.<p>Enfin, environ 15 % des souris SCID Rasa3-/- ont montré une infiltration massive de la rate et de la moelle osseuse par des cellules progénitrices CD117+, suggérant qu’une fraction d’entre-elles développent une leucémie myéloïde aigue.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont des cellules dotées de nombreuses propriétés dont les plus importantes sont leur rôle de soutien de l’hématopoïèse, leur potentiel de différenciation multilignée et leurs pouvoirs immunomodulateurs. Grâce à ces propriétés et à leur facilité d’obtention et d’amplification ex vivo, les CSM sont des candidats prometteurs pour diverses applications thérapeutiques. Au cours de ce travail, nous avons caractérisé ces pouvoirs immunomodulateurs et étudié les mécanismes sous-jacents.<p><p>Nous avons dans un premier temps, évalué la capacité des CSM de la MO à moduler la prolifération des lymphocytes T purifiés à partir de sang périphérique (SP) ou de sang de cordon ombilical (SCO). Quel que soit le stimulus utilisé pour les activer, les lymphocytes T du SP ou du SCO sont modulés par les CSM d’une manière dose dépendante. Le profil d’inhibition des lymphocytes T du SP ou du SCO par les CSM est différent et vraisemblablement lié à leur composition cellulaire (rapport T naïfs vs mémoires).<p><p>Dans le but de comprendre les mécanismes impliqués dans l’immunomodulation et l’influence de l’environnement sur les CSM, nous nous sommes intéressés à l’expression des molécules d’adhésion et de la galectine 1 ainsi qu’à leurs rôles dans l’immunomodulation. Lors des co-cultures avec les lymphocytes T, il y a augmentation de l’expression du CD54, du CD58 et de la sécrétion de la galectine 1 alors qu’en présence d’un environnement inflammatoire ou infectieux, celles-ci sont différemment modulées. Nous avons ensuite pu démontrer que l’inhibition de la réponse lymphocytaire par les CSM impliquait notamment la galectine 1 comme facteur immunorégulateur.<p><p>Le troisième volet de cette thèse, s’est intéressé à l’étude et à la comparaison du pouvoir immunomodulateur des CSM issues du tissu adipeux et la gelée de Wharton, considérés comme des sources potentiellement alternatives à la MO. L’immunomodulation exercée sur les réponses immunes est indépendante de l’origine des CSM. Les CSM du tissu adipeux et de la gelée de Wharton inhibent l’activation des lymphocytes mise en évidence par l’expression du CD38. La réponse allogénique ou mitogénique des lymphocytes est réduite en présence de CSM et les sous populations (CD4+ et CD8+) sont affectées de la même manière par ces effets suppresseurs. Ces effets sont dépendants des concentrations en CSM et sont vraisemblablement liés à l’expression de la PGE2 et du LIF. Durant les co-cultures, les Tregs sont expansés et cela indépendamment des concentrations en CSM. <p><p>En résumé, nous avons caractérisé le pouvoir immunomodulateur des CSM issues de trois sources différentes à savoir la moelle osseuse, la gelée de Wharton et le tissu adipeux. Comme le mettent en évidence nos observations, ce pouvoir est clairement dépendant de la concentration en CSM utilisée et est fortement sensible à l’environnement auquel les CSM sont exposées. Sur le plan mécanistique, nous avons démontré la participation de la galectine 1, de la PGE2 et du LIF aux fonctions immunosuppressives des CSM. Nous rapportons également la capacité des CSM à promouvoir l’expansion des Tregs aussi bien au sein d’une population lymphocytaire que fraîchement purifiés. Nos travaux soulignent l’importance et l’avantage de l’utilisation des CSM issues de ces nouvelles sources dans le cadre des thérapies immunes.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Early innate response of intestinal epithelial cells is the first line defense against enteric pathogens. Toxoplasma gondii infections acquired naturally via the peroral route, encounter intestinal epithelial cells early post-infection. Although the population structure of T. gondii is known to be highly clonal, clinical strains of T. gondii have been classified into three genotypes based on their virulence. In this study we investigated whether human intestinal epithelial cell immune response to T. gondii is virulence dependent. We demonstrated distinct virulence of the three T. gondii genotype strains evaluated in human intestinal epithelial cells by their capacity to replicate and induce host cell cytotoxicity. The early host innate mechanisms such as activation of signaling pathways and induction of innate effectors were likewise differentially elicited by the three T. gondii strains. Low levels of TLR dependent NF-kB activation and a failure to rapidly up-regulate innate cytokine and chemokine genes was observed after virulent Type I strain infection. In contrast, early innate response to the less virulent Type II strain was rapid, efficient and led to high levels of IL-8 and IL-6 secretion, whereas response to Type III parasites was intermediate. Early expression of b-defensin 2 gene was suppressed specifically by virulent Type I strain and its activation prior to infection in intestinal epithelial cells led to decreased parasite viability. These findings provide evidence for T. gondii strain virulence dependent down-modulation of early human intestinal epithelial cell innate responses and highlight the importance of these cells in host defense against this infection. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Regulatory T cells (Tregs) are a subpopulation of T cells with immuno-suppressive properties. Tregs play a key role in immune response regulation and tolerance to antigens, thereby preventing autoimmunity, and may be partly responsible for the lack of an appropriate immune response against tumor cells. However, a human microRNA (miR) Treg signature has not been described yet. We investigated human natural Tregs and identified a signature composed of five microRNAs (-21, -31, -125a, -181c and -374). Among those, two were considerably under-expressed (miR-31 and miR-125a). We identified a functional target sequence for miR-31 in the 3’ untranslated region (3’ UTR) of FOXP3 mRNA. Using lentiviral transduction of fresh cord blood T cells, we demonstrated that miR-31 and miR-21 had opposite effects on FOXP3 expression. We showed that miR-31 negatively regulates FOXP3 expression by binding directly to its potential target site in the 3’ UTR of FOXP3 mRNA. We next demonstrated that miR-21 acted as a positive, though indirect, regulator of FOXP3 expression.<p>Recent reports have shown that histone deacetylase inhibitors increased FOXP3 expression in T cells. We therefore decided to investigate in non-Treg CD4-positive cells, the mechanisms by which an aspecific opening of the chromatin could lead to an increased FOXP3 expression. We focused on the binding of potentially activating transcription factors to the promoter region of FOXP3 and on modifications in the five miRs constituting the Treg signature. Valproate treatment induced binding of Ets-1 and Ets-2 transcription factors to the FOXP3 promoter and acted positively on its expression, by increasing the acetylation of histone H4 lysines. Valproate treatment also induced the acquisition of the miRs of Treg signature. To elucidate whether the changes in the miRs expression could be due to the increased FOXP3<p>expression, we transduced these non-Tregs with a FOXP3 lentiviral expression vector, and found no changes in miRs expression. Therefore, the modification in their miR expression profile is not due to an increased expression of FOXP3 but directly results from histone deacetylase inhibition. Rather, the increased FOXP3 expression results from the additive effects of Ets factors binding and the change in the expression level of miR-21 and miR-31. These data, by allowing a better understanding of the molecular phenomena underlying the number and function of Tregs, could open the door to novel therapeutic approaches in cancer immunotherapy and treatment of autoimmune disorders. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les nucléotides, et tout particulièrement l’ATP, sont capables de moduler la fonction de l’un des principaux acteurs de la réponse immunitaire à savoir les cellules dendritiques (DC). Les DC expriment à leur surface de nombreux récepteurs P2X et P2Y dont le P2Y11, couplé à la voie de l’AMP cyclique (AMPc) et impliqué dans l’immunomodulation. L’ATP est capable, par son action sur le P2Y11, d’induire une semi-maturation des DC caractérisée entre autre par une diminution de la sécrétion d’IL-12 et une augmentation de la sécrétion d’IL-10. De plus, des données antérieures obtenues au laboratoire montrent que l’ATP confère également des propriétés immunosuppressives aux DC en stimulant l’expression de la thrombospondine-1 (TSP-1) et de l’indoléamine-2,3-dioxygénase (IDO).<p><p>Dans ce contexte, notre projet visait à établir un profil d’expression génique en réponse à l’ATP dans des DC humaines issues de monocytes (MoDC) afin d’avoir une vue globale de l’action de l’ATP sur les DC. Dans un premier temps, nous avons donc réalisé une étude cinétique comparant les profils d’expression génique en réponse à l’ATPγS, un agoniste plus stable que l’ATP, et à la prostaglandine E2 (PGE2), un activateur de l’AMPc induisant une semi-maturation des DC, par la technique de microarray. L’analyse de ces profils a mis en évidence une action précoce et large de l’ATPγS sur les MoDC. Un grand nombre de régulations obtenues ont confirmé les effets déjà connus de l’ATP sur les DC. Par ailleurs, nous avons confirmé par différentes techniques plusieurs nouvelles cibles de l’ATP impliquées dans l’inflammation et la réponse immunitaire (ex. CSF-1, NRP-1, VEGF).<p><p>En analysant plus en détail ces profils, nous avons observés la régulation de plusieurs gènes dont VEGF, AREG, EREG et HB-EGF, intervenant dans les processus d’angiogenèse et de tumorigenèse. Parmi ceux-ci, le gène AREG codant pour l’amphiréguline, un ligand de l’EGF récepteur (EGFR) était le gène le plus régulé dans notre profil microarray. Pour la première fois, nous avons démontré que les DC traitées à l’ATPγS en présence de LPS constituaient une importante source d’amphiréguline capable de stimuler la croissance de cellules musculaires lisses et de cellules tumorales LLC (Lewis Lung Carcinoma) in vitro. <p>Parallèlement, nous avons étudié l’implication des cellules dendritiques traitées à l’ATPγS sur la croissance tumorale in vivo. Pour ce faire, nous avons coinjecté, à des souris C57 black/6, des cellules tumorales LLC avec des surnageants issus de BMDC traitées au LPS ou au LPS+ATPγS. De cette façon, nous avons mis en évidence que des surnageants issus de BMDC traitées au LPS+ATPγS induisaient une augmentation significative de la masse tumorale par rapport aux surnageants issus de BMDC traités au LPS seul. Au moyen d’un anticorps bloquant anti-amphiréguline, nous avons démontré que cette augmentation de la masse tumorale était due à l’importante sécrétion d’amphiréguline par les BMDC traitées au LPS+ATPγS. De plus, nous avons observé une augmentation du nombre de vaisseaux positifs pour l’α-SMA, un des marqueurs des cellules musculaires lisses, dans les tumeurs issues de la coinjection de cellules LLC avec des surnageants de BMDC traitées au LPS+ATPγS. Pour finir, nous avons montré que les DC au sein des tumeurs LLC expriment non seulement le récepteur EGFR mais également l’amphiréguline. Ces différents résultats observés mettent en avant l’importance de l’ATP extracellulaire dans la croissance tumorale par son action sur les DC. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Notre travail a permis tout d’abord d’investiguer les effets des nucléotides extracellulaires sur les cellules<p>dendritiques (DCs) qui sont des cellules présentatrices d’antigènes capables d’initier et de réguler la<p>réponse immunitaire. Afin d’avoir une vue globale de l’action des nucléotides extracellulaires sur les DCs,<p>un profil d’expression génique de l’ATPgS – dérivé stable de l’ATP - a été réalisé par microarray dans les<p>cellules dendritiques dérivées de monocytes (MoDCs).<p>Notre groupe a préalablement montré que malgré que l’ATP est considéré comme un signal de danger, il<p>confère des propriétés immunosuppressives aux DCs (Marteau et al, 2005). Nous nous sommes focalisés<p>sur des régulations géniques pouvant être mises en relation avec un action anti-inflammatoire de l’ATP.<p>Nous avons ainsi démontré que l’ATP était capable d’inhiber la sécrétion des chimiokines MCP-1 et MIP-<p>1a initiée par l’action du LPS, ce qui a pour conséquence de diminuer la capacité des DCs à recruter des<p>monocytes ou d’autres DCs. Ce travail a fait l’objet d’une publication en tant que premier auteur<p>(Horckmans et al, 2005).<p>Un grand nombre d’autres gènes régulés liés à la réponse immune et à l’inflammation a été identifiée<p>dans le profil microarray de l’ATPgS. Nous avions notamment pu identifier une augmentation de la<p>sécrétion de VEGF-A en réponse à l’ATP, amplifiée en présence de LPS. Cette régulation est extrêmement<p>intéressante au vu de l’action immunosuppressive du VEGF sur les DCs. Par ailleurs, cette régulation<p>pourrait constituer un lien entre les DCs et l’angiogénese. Ce travail a fait l’objet d’une publication en tant<p>que premier co-auteur dans la revue Journal of Immunology (Bles et al, 2007).<p>En conclusion, nos données nous ont ainsi permis de montrer que les nucléotides adényliques peuvent<p>avoir par leur action sur les cellules dendritiques une action anti-inflammatoire voire pro-angiogénique,<p>en inhibant le recrutement leucocytaire et une action immunosuppressive en stimulant la sécrétion de<p>VEGF.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished