Par rapport à l’adulte, le nouveau-né présente une susceptibilité accrue aux agents infectieux et au développement d’allergies. Une polarisation de l’immunité acquise vers des réponses de type Th2, productrices d’IL-4, d’IL-5 et d’IL-13, et un défaut de réponses immunes de type Th1, sécrétant de l’IFN-γ, peuvent rendre compte de ce statut immunitaire particulier. De plus, un retard de production et de maturation des anticorps, caractéristiques de l’immunité humorale, s’observe en début de vie. <p>Récemment, de nouveaux lymphocytes T auxiliaires ont été décrits, les lymphocytes Th17, producteurs d’IL-17A, d’IL-17F et d’IL-22, d’une part, et les lymphocytes Tfh, sécrétant de l’IL-21 et exprimant CXCR5, ICOS et PD-1, d’autre part. La différenciation des lymphocytes Th17 dépend de la présence d’IL-6 ou d’IL-21 et de TGF-β, et est inhibée par l’IL-4 ;tandis que les lymphocytes Tfh sont induits en présence d’IL-21, d’IL-6 et du répresseur transcriptionnel Bcl6. Alors que les lymphocytes Th17 sont associés à des réponses inflammatoires par le recrutement de neutrophiles, les lymphocytes Tfh aident les lymphocytes B à produire des anticorps de haute affinité.<p><p>L’objectif principal de notre travail est l’étude du développement potentiel de réponses de type Th17 chez le nouveau-né de souris soumis à une stimulation allogénique et au manque d’IL-4. De plus, l’existence potentielle de lymphocytes Tfh induits chez le nouveau-né immunisé avec un vaccin constitué d’ovalbumine de poulet et d’Alum, sera investiguée.<p><p>Dans notre modèle de tolérance néonatale, l’immunisation de nouveau-nés BALB/c à l’aide de cellules spléniques semi-allogéniques F1 (AJAX x BALB/c) induit une polarisation de type Th2, associée à l’établissement d’un chimérisme lymphoïde et à l’acceptation d’une greffe de peau présentant les alloantigènes rencontrés à la naissance. Des nouveau-nés soumis à cette immunisation allogénique et à la privation d’IL-4, réalisée par l’utilisation d’anticorps monoclonaux ou de souris IL-4-/-, rejettent de façon aiguë les greffons de peau et présentent une proportion réduite de cellules chimériques. Cette rupture de la tolérance néonatale est associée à l’inhibition de la réponse allospécifique de type Th2 et au développement de lymphocytes Th17 alloréactifs, produisant de l’IL-17A. L’inhibition de la voie Th17 ne conduit toutefois pas à l’acceptation des allogreffes de peau. Par contre, la neutralisation de l’IL-6 ou de l’IL-17A et la réduction du nombre de neutrophiles restaurent la proportion de cellules chimériques présentes dans la rate, démontrant que la réponse de type Th17 allospécifique néonatale contrôle le chimérisme lymphoïde. <p><p>En réponse au vaccin OVA-Alum, les nouveau-nés présentent une proportion accrue de lymphocytes Tfh CXCR5+ PD-1+, bien que cette proportion lymphocytaire soit significativement diminuée par rapport aux adultes. Les lymphocytes Tfh néonataux expriment en outre des taux moindres des ARNm d’IL-21, d’IL-4 et de Bcl6, suggérant que la génération de lymphocytes Tfh est altérée en début de vie. En parallèle, les titres et la maturation des anticorps produits suite à la vaccination sont réduits chez les nouveau-nés, en comparaison avec les adultes. Cependant, qu’ils soient déficients en IL-4 ou non, des lymphocytes T CD4+ néonataux activés in vitro en présence d’IL-6 induisent une production d’anticorps par des lymphocytes B compétents, suggérant qu’il n’y a pas de défaut intrinsèque des lymphocytes T du nouveau-né à développer une capacité d’aide aux lymphocytes B.<p><p>En conclusion, nous avons montré que la polarisation de type Th2 néonatale inhibe la différenciation de lymphocytes Th17 alloréactifs contrôlant le rejet de cellules allogéniques, un mécanisme pouvant intervenir dans la relation immunitaire entre la mère et l’enfant. Nos résultats indiquent également que le nouveau-né est capable de différencier des lymphocytes Tfh, bien que le développement de ces derniers semble réduit. \ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Bien que la plupart des études se focalisent sur les lymphocytes T CD4+ régulateurs, il a été observé que les lymphocytes T CD8+ régulateurs peuvent jouer un rôle important dans l’induction et le maintien de la tolérance immunitaire. Le transfert adoptif chez la souris et l’induction chez l’homme de lymphocytes T CD8+ régulateurs peuvent inhiber le rejet d’allogreffes et le développement de pathologies autoimmunes. Ces observations suggèrent que l’induction de ces populations peut avoir un potentiel thérapeutique. Des études supplémentaires sont encore nécessaires pour définir les conditions optimales de leur induction. <p>Tant les nouveaux nés humains que murins ont une plus forte capacité que l’adulte à développer des lymphocytes T CD4+ régulateurs induits par une reconnaissance antigénique. La période néonatale serait donc particulièrement appropriée à l’induction de circuits régulateurs.<p>Dans le cadre de ce travail, nous avons étudié le rôle des lymphocytes T CD8+, induits à la naissance, dans le contrôle de la réponse des lymphocytes T CD4+ de type Th2.<p>Des souris BALB/c sont immunisées à la naissance à l’aide de cellules spléniques semi-allogéniques hybrides F1 (AJAX x BALB/c). Ces cellules persistent dans l’animal, au sein des organes lymphoïdes et stimulent ainsi de manière chronique les lymphocytes T CD4+ et T CD8+ du receveur et induisent une réponse de type Th2. Suite à l’injection des cellules spléniques semi-allogéniques au nouveau né de souris, nous avons observé l’expansion d’une population de lymphocytes T CD8+CD25+, dont le phénotype se caractérise par l’expression de Foxp3 et la production conjointe d’IFN-&61543; et l’IL-10. Nous avons pu observer que ces cellules sont capables d’inhiber la production de cytokines Th2 produites par les lymphocytes T CD4+ allospécifiques activés. Par contre, ces cellules régulatrices aggravent des réponses Th2 non apparentées. En effet, suite à une sensibilisation à l’ovalbumine, à l’âge adulte, ces souris développent de plus fortes réponses asthmatiques.<p>D’autre part, les nouveaux nés de souris BALB/c ont été immunisés à la naissance à l’aide de cellules dendritiques semi-allogéniques hybrides F1 (AJAX x BALB/c) qui activent de manière aigüe leurs lymphocytes T. Ces souris présentent une forte réponse Th1 et Tc1/Tc2 spécifique de l’alloantigène et sont protégées contre le développement d’un asthme induit. Il a aussi été montré dans ce travail que suite à l’immunisation néonatale à l’aide de cellules dendritiques semi-allogéniques, le nombre de lymphocytes T CD8+CD44high, CD8+CD62Lhigh et CD8+CD25+ producteurs d’IFN-&61543; augmente significativement. L’IFN-& / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le TNF-α est une cytokine pro-inflammatoire du système immunitaire qui, lorsque sa production est déréglée, induit de nombreuses pathologies chez l’homme (cachexie, arthrite rhumatoïde, etc.) Outre une régulation transcriptionnelle de cette cytokine, il existe aussi une régulation post-transcriptionnelle permettant un contrôle affiné de sa production. Le laboratoire de Biologie du Gène étudie cette régulation post-transcriptionnelle faisant intervenir une séquence consensus dans l’ARNm appelée séquence AU-riche (ou ARE pour AU-rich element) et les protéines qui y sont impliquées. Généralement, les ARNm porteurs d’ARE codent pour des protéines dont l’expression est transitoire. Ces gènes requièrent un contrôle très précis de leur expression et c’est pourquoi, en plus d’être soumis à de nombreux contrôles transcriptionnels, la traduction et la stabilité de leurs ARNm sont très finement régulées. La réponse immune innée implique de nombreux ARNm de ce type. Jusqu’à présent, la fonction de la protéine TIAR dans la régulation de l’expression du TNF-α n’a pas été complètement élucidée. Outre le TNF-α, la participation à la réponse immune innée de nombreuses protéines encodées par des ARNm porteurs d’ARE pourrait conférer à la protéine TIAR un rôle de régulateur essentiel dans le contrôle de l’inflammation. Nous avons donc générés plusieurs lignées de macrophages RAW 264.7 surexprimant la protéine TIAR entière ou différents mutants de TIAR afin de déterminer, par une analyse globale par puces à ADN, les ARNm cibles de TIAR au cours de la réponse immune. Cette approche nous a permis de démontrer que la protéine TIAR exerce un contrôle sur le métabolisme de l’ARNm du TNF-α et de MKP-1 (MAP kinase phosphatase 1), une phosphatase majeure dans la voie de signalisation de la MAPK p38. Cette voie de signalisation joue un rôle essentiel dans la stabilisation et la traduction de nombreux ARNm porteurs d’ARE encodant des protéines de la réponse inflammatoire. D’autre part, nous avons voulu étudier in vivo la fonction de la protéine TIAR au cours de la réponse immune. Nous avons, dans ce but, généré des souris transgéniques surexprimant l’isoforme courte de la protéine TIAR. Si nous n’avons pas encore pu mesurer les effets d’une surexpression de TIAR sur la réponse inflammatoire chez ces souris, ces individus transgéniques ont révélé qu’une expression anormale de la protéine TIAR induit une létalité importante au cours du développement embryonnaire. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les cellules dendritiques sont les sentinelles du système immunitaire. Elles sont disséminées dans la plupart des tissus et organes et sont capables de détecter la présence de pathogènes. La perception des signaux de danger se fait notamment grâce à la présence de récepteurs de la famille Toll (TLRs). Deux voies de signalisation, qui reposent sur l'activation des molécules adaptatrices MyD88 ou TRIF, peuvent être induites par l’engagement de ces récepteurs par leur ligand. Ces voies de signalisation mènent à l’activation de différents facteurs de transcription nécessaires à la production de cytokines telles que les membres de la famille de l’interleukine-12 (IL-12).<p>La famille de l’IL-12 comprend quatre cytokines hétérodimériques: l’IL-12 (p35/p40), l’IL-23 (p19/p40), l’IL-27 (p28/EBI3) et l’IL-35 (p35/EBI3). Chacune de ces cytokines possède des fonctions bien définies et parfois complexes qui sont essentielles pour l’établissement des réponses immunes innées et adaptatives mais également pour l'atténuation de ces réponses limitant ainsi les effets délétères causés à l'organisme par des réponses immunes excessives. La régulation transcriptionnelle de ces cytokines est complexe puisque la présence des deux sous-unités est indispensable à leur production par la cellule.<p>Dans le cadre de ce travail, nous avons étudié l'implication de facteurs de transcription de la famille des IRFs dans l’induction des gènes codant pour les sous-unités qui composent les cytokines de la famille de l'IL-12 en réponse à l’engagement des différents TLRs. Le facteur de transcription IRF3 activé en aval de la voie TRIF dépendante joue un rôle crucial dans la production des IFNs de type I et des réponses antivirales. Nos résultats indiquent que ce facteur est également directement impliqué dans l'activation des gènes codant pour les sous-unités p35 et p28. Par contre, ce facteur ne participe pas au contrôle de l'expression de l'IL-12/23p40, l’IL-23p19 et d'EBI3. Nos observations indiquent qu’IRF3 coopère avec d'autres membres de la famille des IRFs. En effet, IRF1 permet l'expression optimale des sous-unités p35 et p28 alors qu'IRF9 joue un rôle essentiel dans le contrôle de l'expression de la p28, deux facteurs activés par la boucle autocrine des IFNs de type I. Nos résultats indiquent donc qu’en réponse aux ligands TLRs, l'expression des différentes sous-unités qui composent les cytokines de la famille de l'IL-12 est régulée de manière différentielle et complexe. Les facteurs de transcription de la famille des IRFs, de par leur implication dans le contrôle de l’expression de certaines de ces sous-unités, participent à la balance entre ces différentes cytokines.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La muqueuse intestinale puis le foie sont en contact récurrent avec la flore microbienne issue du tube digestif. L’activation des récepteurs reconnaissant des motifs moléculaires microbiens (PRR :Pattern Recognition Receptors) constitue l’élément initial de la réponse inflammatoire de l’immunité innée et oriente le type d’activation de l’immunité adaptative. La première étape entraînera l’expression de médiateurs inflammatoire (cytokines (IL-1, IL-6, TNFα), activation de la réponse de phase aiguë) et le recrutement des cellules effectrices de l’immunité innée (neutrophiles, puis monocytes). L’équilibre entre la tolérance microbienne et l’exacerbation inflammatoire afin d’éliminer l’agent microbien et menant à la destruction tissulaire permet d’atteindre la situation d’homéostasie.<p>Si l’inflammation se perpétue, par exemple en cas de défaut de clairance de l’agent microbien ou de trouble de l’intégrité de la barrière muqueuse, l’inflammation peut devenir chronique. L’IL-6 exerce alors un rôle central dans la transition de l’immunité innée à l’immunité adaptative, en modulant différentiellement l’expression de chimiokines et l’apoptose des cellules immunes menant au remplacement de l’infiltrat neutrophilique par un infiltrat lympho-monocytaire. Par ailleurs, ce climat cytokinique particulier est propice au développement de lignées spécifiques de lymphocytes tels que les lymphocytes T CD4+ sécrétant de l’IL-17 (Th17). Ceux-ci, surtout étudiés dans les défenses anti-bactériennes et fungiques, et dans les maladies autoimmunes, ont été incriminés dans les phénomènes de cytotoxicité et de renouvellement inflammatoire par l’induction d’expression de chimiokines.<p><p>Une fois la barrière intestinale franchie, le foie est le premier organe en contact avec la flore microbienne issue de l’intestin. Certains TLRs ont été démontrés impliqués dans la physiopathologie de la stéatohépatite et dans le processus de fibrose. Ce climat constant d’exposition antigénique est associé en cas de maladie chronique du foie à une exacerbation d’expression de médiateurs infammatoires (IL-1, IL-6, TNFα).<p>Nous avons étudié la modulation d’expression des différents TLRs au cours d’un modèle de maladie alcoolique du foie chez la souris. Cette étude démontrait qu’il existait une majoration d’expression des TLR1, 2, 4, 6, 7, 8 et 9 dépendante du stress oxydatif suite à l’exposition chronique du foie à l’alcool ;celle-ci entraînant davantage de lésions hépatiques lors de l’injection des ligands respectifs de ces différents TLRs.<p>Dans ce contexte, nous avons également étudié l’expression des différentes sous-unités du récepteur à l’IL-6 au cours de deux maladies chroniques du foie chez l’homme :les maladies alcooliques du foie et l’hépatite C chronique. Nous avons mis en évidence que les taux plasmatiques d’IL-6 et de la forme soluble de gp130 augmentaient au cours des maladies chroniques du foie, de manière corrélée à la sévérité. Nous avons également démontré l’effet inhibiteur de sgp130 sur la réponse de phase aiguë dépendante du trans-signaling de l’IL-6 in vitro. Ces données suggèrent que sgp130 contribue au déficit de réponse de phase aiguë observé chez les patients atteints de cirrhose. <p><p>Par ailleurs, vu le contexte « cytokinique » chronique des maladies alcooliques du foie (IL-1 et IL-6), nous avons étudié l’activation de la voie de l’interleukine-17 et des Th17 au cours des maladies alcooliques du foie chez l’homme. Nous avons mis en évidence qu’il existait une activation de cellules circulantes sécrétant de l’IL-17 (comprenant des Th17) au cours de la cirrhose alcoolique stable. Par contre, au sein du foie, l’activation de cellules sécrétant de l’IL-17 était davantage augmentée lors de l’hépatite alcoolique. Nous avons également mis en évidence que les cellules stellées (cellules responsables de la fibrose hépatique) stimulées à l’IL-17 recrutaient les neutrophiles suite à l’expression d’IL-8 et de GROα. Cette nouvelle voie inflammatoire démontrée lors d’une maladie du foie chez l’homme met en évidence l’activation de la voie de l’IL-17 au cours des maladies alcooliques du foie et sa contribution potentielle au recrutement hépatique de neutrophiles au cours de l’hépatite alcoolique aiguë. Cette voie sera explorée dans l’avenir en termes de fonctionnalité et de potentielle cible thérapeutique. <p> <p>En conclusion, tout comme le suggère la littérature pour les maladies autoimmunes (maladie de Crohn, arthrite, sclérose en plaque), il semble que les maladies alcooliques du foie partagent avec ces dernières diverses caractéristiques inflammatoires. La flore microbienne intestinale participe à la physiopathologie des lésions hépatiques, de même que l’activation de PRR (TLR). Par ailleurs, un climat inflammatoire chronique (IL-6,…), contre-régulé par certains mécanismes (sgp130), est associé à la présence périphérique et hépatique de lymphocytes Th17. Cette dernière découverte ouvre de nouvelles perspectives dans la compréhension de la physiopathologie des maladies alcooliques du foie, et peut-être de nouvelles cibles thérapeutiques concernant l’hépatite alcoolique aiguë.<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Depuis leur découverte en 1973 par Steinman et Cohn, le rôle des cellules dendritiques dans l’initiation des réponses immunitaires a largement été documenté. En effet, les cellules dendritiques constituent les cellules présentatrices d’antigènes professionnelles capables de détecter des molécules microbiennes et inflammatoires afin d’activer le système immunitaire. Outre leur implication dans l’induction des réponses immunes, de plus en plus d’études suggèrent que les cellules dendritiques interviennent dans le contrôle des réponses immunitaires via la sécrétion de cytokines anti-inflammatoires et/ou l’activation ou l’induction de lymphocytes T régulateurs. Ceux-ci incluent les cellules T régulatrices issues naturellement du thymus et les cellules T régulatrices induites en périphérie. <p><p>Des résultats obtenus au sein de notre laboratoire ont mis en évidence l’importance des cellules T régulatrices dans le contrôle des réponses de type Th1 induites à l’aide de cellules dendritiques matures chargées avec des antigènes étrangers. Nous avons, dès lors, étudié le rôle du récepteur CTLA-4 exprimé constitutivement à la surface des cellules T régulatrices dans le contrôle des réponses immunitaires induites à l’aide de cellules dendritiques matures et dans un modèle d’inflammation intestinale. L’injection d’anticorps anti-CTLA-4 induit in vitro et in vivo une inhibition de la production d’IFNγ et protège les souris de la colite pro-Th1 induite par l’instillation de TNBS. Cette protection corrèle étroitement avec l’induction de lymphocytes T régulateurs exprimant fortement la molécule ICOS et sécrétant de l’interleukine 10. De plus, nos résultats suggèrent que l’interleukine 10 et l’indoléamine 2, 3 dioxygénase seraient impliquées dans la fonction régulatrice des lymphocytes T ICOShigh. <p><p>Nous avons également analysé les mécanismes impliqués dans le contrôle des réponses de type Th1 par les lymphocytes T régulateurs naturels. Nos résultats suggèrent une régulation différente des réponses Th1 en présence et en absence de cette population régulatrice. En effet, les réponses Th1 sont dépendantes de l’interleukine 12 en présence de lymphocytes T régulateurs naturels, alors qu’en leur absence, la molécule CD70 est requise. <p><p>En conclusion, nos résultats suggèrent que les lymphocytes T régulateurs naturels et induits contrôlent les réponses immunes de type Th1. Au cours de ce travail, nous avons mis en évidence des stratégies distinctes par lesquelles ces deux populations régulatrices contrôlent la réponse immune. Ces résultats complètent la compréhension des mécanismes de régulation du système immunitaire et ouvrent de nouvelles perspectives d’approche immunothérapeutique.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Par leur capacité de moduler la réponse immune, les rayons ultraviolets (UV) ont trouvé des applications dans le traitement de diverses maladies immunes. Leurs mécanismes d’action sont encore incomplètement définis. L’un d’entre eux comporte l’induction de cytokines immunosuppressives et antiinflammatoires. Ce processus peut être provoqué par la phagocytose de corps apoptotiques, l’apoptose constituant une des lésions cellulaires élémentaires provoquée par les UV. Le but de notre travail a été de préciser les cytokines impliquées dans la réponse aux UV, de définir certains mécanismes de leur production et de la potentialiser par des agents pharmacologiques.<p>Notre étude a comporté deux parties: (1) l’une in vivo chez des malades souffrant de GVH chronique résistante aux traitements conventionnels et traités par photochémothérapie extracorporelle, procédure dans laquelle les leucocytes du malades, prélevés par leucaphérèse puis traités par un psoralène et par UVA lui sont finalement réinjectés; (2) l’autre in vitro où des PBMC de volontaires sains ont été irradiés avec 10J/m2 de rayons UVC qui ne nécessitent pas de photosensibilisation par psoralène. Deux cytokines, l’IL-10 et l’IL-1Ra ont été évaluées par RT-PCR dans un système de coculture autologue entre PBMC et PBL rendus apoptotiques par irradiation. L’évolution du processus apoptotique déclenché par les UV a été mesurée par cytomètrie de flux. Celui-ci concernait essentiellement les lymphocytes, les monocytes/macrophages révélant une résistance relative à l’apoptose, il était progressif, culminant entre la 24ème et la 48ème heures. Lors des cocultures entre PBMC et PBL irradiés, un accroissement très significatif du nombre de copies d’ARNm, concernant les deux cytokines étudiées, l’IL-10 et l’IL-1Ra était observé. L’induction d’IL-1Ra était dépendante de l’IL-10. Une préactivation par du LPS était nécessaire pour la révélation du phénomène. <p>Ensuite, nous avons évalué l’implication sur la synthèse de cytokines du processus de phagocytose de lymphocytes rendus apoptotiques par irradiation UV et divers moyens pharmacologiques pour la potentialiser. La préincubation du matériel irradié pendant une nuit (16h) à 37° dans le but d’accroître la proportion de cellules en voie d’apoptose avant mise en contact avec les PBMC a permis d’obtenir un accroissement très marqué sans nécessiter de LPS, portant essentiellement sur la production d’IL-1Ra tant sur l’ARNm que la protéine secrétée; l’induction d’IL-10 était cette fois négligeable. L’implication de la phagocytose dans le processus a été démontrée par deux agents bloquants (a) l’anticorps monoclonal anti-CD36 (corécepteur avec l’intégrine &61537;V&61538;3 de la thrombospondine) activant la production d’IL-1Ra et mimant par ce fait le processus phagocytaire et (b) la cytochalasine E la bloquant.<p>Nous avons testé diverses substances pharmacologiques dont l’action activatrice de l’IL-1Ra est connue, en l’occurrence les immunoglobulines G à usage IV (IgIV) et le GM-CSF. L’adjonction d’IgIV (1mg/ml) ou GM-CSF (10 ng/ml) une heure après le début de la coculture exerce sur la sécrétion d’IL-1Ra un effet additif avec les UV. Selon la concentration utilisée, les IgIV peuvent agir par deux mécanismes. Outre l’effet d’activation macrophagique lié au récepteur Fc, nous avons démontré à haute concentration un mécanisme nouveau, du à la présence dans les IgIV d’anticorps naturels antiFas induisant l’apoptose des lymphocytes. Une incubation de 16h des lymphocytes avec 25 mg/ml d’IgIV avant mise en culture provoque outre une apoptose importante une augmentation significative de l’IL-1Ra. Dans ce cas, le processus est indépendant du fragment Fc, la fraction F(ab’)2 gardant la capacité d’induire l’apoptose et de provoquer la production d’IL-1Ra. <p><p>En conclusion, nous avons mis en évidence un mécanisme nouveau d’induction d’IL-1Ra, non décrit auparavant et défini diverses modalités qui pourraient accroître sa production: <p>- L’incubation de 16h du matériel irradié permet d’orienter le système en accroissant la production de l’IL-1Ra sans que la production de l’IL-10 soit modifiée et sans nécessiter de LPS. Nous attribuons cet effet à l’accroissement du processus apoptotique qui en résulte.<p>- Nous avons potentialisé la production d’IL-1Ra par deux agents pharmacologiques, le GM-CSF et les IgIV. Les mécanismes d’action des IgIV dépendent de la concentration utilisée.<p>1. Aux concentrations de l’ordre de 1mg/ml, les IgIV exercent, avec les UV un effet additif sur l’induction d’IL-1Ra par une action dépendant du fragment Fc. <p>2. Aux concentrations élevées de 25mg/ml, un effet apoptotique attribuable à l’action d’anticorps anti-Fas agonistes est observé. Une préincubation de 16h de lymphocytes avec cette concentration d’ IgIV avant mise en culture avec les PBMC autologues provoque outre l’apoptose importante des lymphocytes un accroissement significatif de la production d’IL-1Ra. Le processus est indépendant du fragment Fc, la fraction F(ab’)2 gardant la capacité d’induire l’apoptose et la production d’IL-1Ra. \ / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Currently, in most situations, the autologous immune system is unable to eradicate the residual leukemic burden persisting after chemo-radiotherapy, but a balance can be established between leukemic and immune cells leading to a clinical remission for several months or years. If this balance is broken, a clinical relapse can occur. The high incidence of relapses in human cancers demonstrates the frequent inefficacy of the immune system to control these residual cells. In this context, allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) has been proven to be the most effective way to reinforce the immune reaction against leukemia, graft-versus-leukemia (GVL) effect and, so, achieve a definitive eradication of the residual disease in a significant proportion of patients. Indeed, the whole concept of HSCT evolved from an organ transplant concept (to replace a defective ill organ with a new healthy one) to the concept of creating an extraordinary immunotherapeutic platform in which the donor immune system contributes to the eradication of the residual leukemic cells. Thus, the past and present issues remain those of finding the best immunomodulatory modalities to achieve a full engraftment, a powerful GVL effect and no or moderate graft-versus-host disease (GVHD). Different ways to reach this goal, such as post transplant cytokine modulation, specific or global cellular depletion of the graft and post transplant global or specific donor immune cell add-backs, are still extensively studied. Nevertheless, the persistent high relapse rate (RR) observed in leukemia patients after HSCT remains the most important cause of death before transplant-related toxicities. Moreover, since only about 40 to 70% (depending on the ethnic context) of patients with high-risk hematological malignancies, eligible for allogeneic HSCT, have a fully HLA-matched sibling or matched unrelated donor (MUD), a great deal of effort has been invested to make the use of an alternative haploidentical sibling donor feasible. The advantage of this procedure is the immediate availability of a donor for almost all patients. <p>The aim of the work described in this thesis has been to implement a strategy to transplant a patient using a HLA haploidentical donor. The strategy is to try to improve DFS that could be applied both in the autologous or allogeneic context: first, by using nonspecific immune manipulation post transplant and then, by developing specific strategies directed against leukemia antigens. Particularly in the allogeneic situation, the aim was to increase the GVL effect without inducing or aggravating the deleterious GVHD. The first part of this thesis described our own clinical results, consisting of three consecutive phase I/II studies, in which we tried to determine the feasibility of giving prophylactic donor lymphocyte infusions (DLI) post transplant and the effect of replacing granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), typically used to speed up neutrophil recovery, with granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), which is known for its immunomodulatory properties. The slow immune reconstitution in haploidentical transplant is chiefly responsible for the high incidence of early lethal viral and fungal infections, and most probably for early relapses; therefore, we sought to accelerate and strengthen the post transplant immune reconstitution without increasing the GVHD rate. Thus, we have studied the impact of post transplant growth factor administration and of unselected DLI in haploidentical transplant. We have also implemented, in our center, anti-cytomegalovirus (CMV) specific T cell generation and infusion to improve anti-CMV immune reconstitution. Since then, our results have been pooled in a multi-center analysis performed by the European Bone Marrow Transplantation group (EBMT) allowing us to compare our results with those of the entire group. We have also participated in the design of an ongoing study aimed at selectively depleting the graft from alloreactive T cells, and improving post transplant T cell add-backs. In our attempts to generate and expand ex vivo lymphocytes (directed against pathogens (CMV) and leukemia-associated antigens, Wilms' tumor gene 1 (WT1) and to use them in vivo, we found inconsistent results (in the case of WT1) using classical clinical grade dendritic cells (DC) generated and matured in bags, as was the case for the majority of the teams worldwide. This led us to question the full functionality of these DC and we undertook a thorough comparative analysis of DC generated and differentiated in bags and in plates (typical for most pre-clinical studies). This analysis showed us that one cannot transpose pre-clinical studies (using culture plates) directly to clinical protocols (generally using clinical grade culture bags) and that DC generated in bags are functionally deficient. We learned that, if we want to use a DC vaccine to improve the GVL effect in haploidentical transplant, we will have to be careful about the technique by which they are generated. To improve immunotherapeutic approaches, the understanding of the mechanisms underlying tumor tolerance and how to manipulate them is critical in the development of new effective immunotherapeutic clinical trials. This is why we currently focus on how to obtain effective in vivo anti-leukemia immune reactions using an ex-vivo manipulated product to trigger the immunotherapeutic response. More specifically, we are analyzing the impact of regulatory T cell (Tregs) depletion and function for an adequate anti-leukemic immune response. This pre-clinical work aims at improving the outcome of leukemia patients who have relapsed and been put back into second remission and at decreasing the RR after HSCT, especially in the field of haploidentical transplantation. <p>In conclusion, haploidentical transplantation has become a valuable tool. The results are at least similar to those obtained using MUD when performed in the same group of patients. Specific immunomodulation post transplant can affect events such as GVHD and GVL, but clinically we are still at the level of nonspecific manipulations. It is our hope that ongoing pre-clinical work will enable us to perform specific anti-pathogen and anti-leukemia immune manipulation that will favorably influence the patient outcome.<p>/<p><p>Dans la majorité des situations, le système immunitaire autologue est incapable d’éradiquer les cellules leucémiques résiduelles qui échappent à la radiothérapie et à la chimiothérapie, cependant un équilibre peut s’établir entre les cellules leucémiques et immunitaires aboutissant à une rémission pouvant durer plusieurs mois ou années. Si cet équilibre se rompt, une rechute clinique peut se déclarer. Dans ce contexte, il est prouvé que la greffe allogénique de cellules souches hématopoïétiques est le moyen le plus efficace de renforcer les réactions immunitaires contre la leucémie par la réaction du greffon contre la leucémie et ainsi d’obtenir une éradication définitive de la maladie résiduelle chez un nombre significatif de patients. En effet, le concept global de l’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques a évolué du concept de transplantation d’organe (remplacement d’un organe malade par un nouvel organe sain) vers celui de créer une extraordinaire plateforme d’immunothérapie à travers laquelle le système immunitaire du donneur contribue à l’éradication des cellules leucémiques persistantes. Donc, la problématique reste celle de trouver les meilleures modalités d’immunomodulation pour achever une prise du greffon, un effet anti-leucémique puissant du greffon, et l’absence ou un minimum d’effet du greffon contre l’hôte. Différentes stratégies existent pour atteindre cet objectif, comme l’utilisation de cytokines pour moduler la reconstitution immunitaire, des déplétions cellulaires globales ou spécifiques du greffon et l’infusion de cellules immunes «globales» ou spécifiques du donneur après greffe. Ces stratégies sont encore largement à l’étude. Néanmoins, la persistance d’un taux de rechute élevé observé chez les patients leucémiques, après allogreffe reste la cause principale de décès, avant celle liée à la toxicité de la greffe. De plus, étant donné que seulement environ 40 à 70% (dépendant de l’origine ethnique) des patients avec une hémopathie à haut risque, éligibles pour une greffe allogénique, ont un donneur familial ou non familial complètement HLA compatible, des efforts importants ont été développés pour rendre faisable l’utilisation de donneurs familiaux alternatifs, haploidentiques. L’avantage de cette approche est l’accès immédiat à un donneur pour quasiment tous les patients.<p>Le but du travail décrit dans cette thèse a été l’implémentation d’une stratégie d’allogreffe utilisant un donneur haploidentique. Le travail vise également à développer de façon plus large des stratégies qui peuvent améliorer le taux de survie sans rechute, non seulement dans le contexte des greffes haploidentiques, mais également dans le cadre des greffes allogéniques en général, ainsi que dans les situations autologues :premièrement, par la manipulation immunitaire non spécifique après greffe et ensuite par le développement de stratégies spécifiques dirigées contre des antigènes leucémiques. En particulier dans la situation allogénique, le but a été d’augmenter l’effet du greffon contre la leucémie sans induire ou aggraver l’effet délétère du greffon contre l’hôte. La première partie de la thèse décrit les résultats cliniques de notre propre protocole de greffe haploidentique, qui a consisté en trois études consécutives de phase I/II. Dans ces études, nous avons voulu déterminer la faisabilité de réaliser des infusions prophylactiques de lymphocytes du donneur après transplantation, et l’impact du remplacement du « granulocyte colony-stimulating factor » (G-CSF), largement utilisé pour permettre une récupération en polynucléaires neutrophiles plus rapide, par du « granulocyte-macrophage colony-stimulating factor » (GM-CSF), lequel est connu pour ses propriétés immunomodulatrices différentes. La reconstitution immunitaire très lente après greffe haploidentique est majoritairement responsable de l’incidence élevée de décès par infections virales et fungiques précoces, et très probablement des rechutes précoces. C’est pourquoi nous avons cherché à accélérer et à renforcer la reconstitution immunitaire post-greffe sans augmenter la fréquence de réaction du greffon contre l’hôte. Nous avons donc étudié l’impact de l’administration de facteurs de croissance et l’infusion de lymphocytes non sélectionnés du donneur en post greffe haploidentique. Nous avons également implémenté dans notre centre, la génération et l’infusion de lymphocytes T spécifiques anti-cytomégalovirus (CMV) afin d’améliorer la reconstitution immunitaire anti-CMV. D’autre part, nos résultats ont été regroupés dans une étude multicentrique menée par le groupe européen de transplantation de moelle osseuse (EBMT), ce qui nous a permis de comparer nos résultats avec ceux de l’entièreté du groupe. Nous avons parallèlement participé à la conception d’une étude actuellement en cours ayant pour but d’améliorer la reconstitution immunitaire après greffe par la déplétion sélective du greffon en lymphocytes T alloréactifs et par l’infusion après greffe de lymphocytes T du donneur également sélectivement déplétés en lymphocytes T alloréactifs. Afin d’optimaliser l’effet anti-leucémique du système immunitaire, nous avons débuté un protocole de vaccination par cellules dendritiques (DCs). Ces cellules dendritiques étaient chargées en lysat de blastes leucémiques dans le cas de patients présentant au diagnostic une leucémie aigue surexprimant l’oncogène 1 de la tumeur de Wilms (WT1). Néanmoins dans nos travaux de génération et d’expansion ex-vivo de lymphocytes T spécifiques de l’antigène WT1, utilisant les DCs de grade clinique, générées et maturées en poches, nous avons rencontré des résultats inconsistants, comme c’était le cas dans la majorité des protocoles cliniques internationaux de vaccination. Nous nous sommes alors posé la question de la fonctionnalité globale de ces cellules et nous avons entrepris une analyse comparative poussée des DCs générées et différenciées en poches ou en plaques. Les DCs générées en plaques sont celles utilisées dans la plupart des travaux précliniques. Cette analyse nous a montré que l’on ne pouvait pas directement transposer les résultats précliniques basés sur des DCs générées en plaques dans des protocoles cliniques basés sur des DCs générées en poches, car ces dernières présentent des déficits fonctionnels importants. Nous avons appris que si l’on voulait utiliser un vaccin à base de cellules dendritiques pour améliorer l’effet du greffon contre la leucémie dans les greffes allogéniques, nous devions être très attentifs quant au protocole utilisé pour la génération de ces vaccins cellulaires. Pour améliorer les approches immunothérapeutiques, la connaissance des mécanismes qui établissent la tolérance tumorale et des façons de manipuler ceux-ci, est critique dans le développement de nouveaux protocoles efficaces. C’est pourquoi nous nous concentrons actuellement sur les conditions nécessaires à l’obtention in vivo d’une réaction immune anti-leucémique efficace lors de l’utilisation d’un produit cellulaire manipulé ex vivo. Plus spécifiquement, nous analysons l’impact de la déplétion en lymphocytes T régulateurs (Tregs) sur la réponse anti-leucémique. Ce travail préclinique a pour but d’améliorer le devenir de patients leucémiques qui ont rechutés et ont été mis en seconde rémission, ainsi que de diminuer le taux de rechute après allogreffe, spécifiquement après greffe haploidentique. <p>En conclusion, la transplantation haploidentique est actuellement un outil précieux pour de nombreux patients. Les résultats sont au minimum similaires à ceux qui sont obtenus par les greffes non-familiales HLA identiques lorsqu’elles sont pratiquées dans les mêmes groupes de patients. L’immunomodulation spécifique après greffe peut affecter des événements comme la réaction du greffon contre l’hôte et la réaction du greffon contre la leucémie, mais en pratique clinique nous en sommes encore au niveau de la manipulation aspécifique. Nous espérons que les travaux précliniques actuels vont nous permettre d’appliquer des stratégies spécifiques et d’obtenir une manipulation immune anti-leucémique qui aura une influence favorable significative sur le devenir des patients. / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished