Le système immunitaire néonatal est caractérisé par une susceptibilité accrue aux infections par des pathogènes intracellulaires et des réponses vaccinales altérées. Ces caractéristiques soulignent la capacité limitée du nouveau-né à développer des réponses immunes à médiation cellulaire.<p>Les LTγδ représentent le prototype des lymphocytes T non-conventionnels :ils sont capables de réagir très rapidement après activation et sont caractérisés par une activité qui n’est pas restreinte aux molécules du CMH. Les LTγδ qui expriment le TCR Vγ9Vδ2 constituent la population majoritaire (60-90%) de LTγδ dans le sang périphérique humain adulte. Ces cellules reconnaissent spécifiquement les phosphoantigènes, des molécules non-peptidiques de faible poids moléculaire tel que l’HMB-PP. Cet activateur naturel est un intermédiaire de la voie non-mévalonate de biosynthèse des isoprénoïdes, essentielle à de nombreux agents pathogènes. Ces cellules sont également capables de réagir aux aminobisphosphonates, drogues couramment utilisées en thérapie du cancer. Le zolédronate (Zometa) est le plus puissant des aminobisphosphonates. Grâce à leur capacité à sécréter rapidement des cytokines comme l’IFN-γ et le TNF-α ainsi qu’à leur puissante activité cytotoxique, les LT Vγ9Vδ2 jouent un rôle important dans le contrôle des infections et des cancers.<p><p>Au contraire des LTγδ de l’adulte, la fonction des LTγδ du nouveau-né est peu connue. Cependant, des évidences suggèrent que ces lymphocytes pourraient jouer un rôle particulièrement important en début de vie. Dans ce contexte, nous avons caractérisé en détail la réponse des LTγδ du sang de cordon ombilical humain après stimulation avec l’HMB-PP et le zolédronate. Contrairement à l’HMB-PP, le zolédronate induit la prolifération et la production d’IFN-γ par les LT Vγ9 du nouveau-né. L’IL-23 étant une cytokine produite de façon optimale par les DCs en début de vie, nous avons choisi d’étudier son influence sur le profil d’activation de ces cellules. L’ajout d’IL-23 au zolédronate augmente l’expression d’IFN-γ et génère une population distincte de LT Vγ9 négatifs pour l’IFN-γ et produisant de l’IL-17. De plus, l’IL-23 favorise la synthèse de plusieurs médiateurs cytotoxiques (perforine, granzymes A et B, granulysine) induits par le zolédronate. Alors que l’effet co-stimulateur de l’IL-23 sur la production d’IFN-γ et de molécules cytotoxiques est également observé au sein des LT Vγ9 de l’adulte, l’induction d’une sous-population IL-17+ IFN-γ- est unique aux LT Vγ9 du nouveau-né.<p>Afin de mieux définir les conditions requises pour induire la polarisation des LT Vγ9 du nouveau-né en cellules productrices d’IL-17, nous avons évalué l’effet de diverses cytokines ainsi que celui de dérivés microbiens sur l’activation de ces cellules au zolédronate. Le zolédronate en présence d’IL-1β ou de LPS génère une population distincte de LT Vγ9 IL-17+ IFN-γ-. De plus, l’ajout d’IL-1β au zolédronate n’augmente pas le pourcentage de LT Vγ9 producteurs d’IFN-γ. Nous avons ensuite comparé le phénotype des LT Vγ9 IL-17+ à celui des LT Vγ9 IFN-γ+. Nos résultats indiquent qu’une fraction des LT Vγ9 sécrétant l’IL-17 exprime sélectivement CCR6 contrairement aux LT Vγ9 producteurs d’IFN-γ.<p><p>En conclusion, ce travail a permis de révéler la capacité des LT Vγ9 du nouveau-né humain à se différencier en cellules productrices d’IFN-γ, d’IL-17 et de molécules cytotoxiques. Ces cellules pourraient donc constituer une première ligne de défense capable d’orchestrer une réponse immune efficace à l’encontre de dérivés microbiens ou de signaux endogènes de danger. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Par rapport à l’adulte, le nouveau-né présente une susceptibilité accrue aux agents infectieux et au développement d’allergies. Une polarisation de l’immunité acquise vers des réponses de type Th2, productrices d’IL-4, d’IL-5 et d’IL-13, et un défaut de réponses immunes de type Th1, sécrétant de l’IFN-γ, peuvent rendre compte de ce statut immunitaire particulier. De plus, un retard de production et de maturation des anticorps, caractéristiques de l’immunité humorale, s’observe en début de vie. <p>Récemment, de nouveaux lymphocytes T auxiliaires ont été décrits, les lymphocytes Th17, producteurs d’IL-17A, d’IL-17F et d’IL-22, d’une part, et les lymphocytes Tfh, sécrétant de l’IL-21 et exprimant CXCR5, ICOS et PD-1, d’autre part. La différenciation des lymphocytes Th17 dépend de la présence d’IL-6 ou d’IL-21 et de TGF-β, et est inhibée par l’IL-4 ;tandis que les lymphocytes Tfh sont induits en présence d’IL-21, d’IL-6 et du répresseur transcriptionnel Bcl6. Alors que les lymphocytes Th17 sont associés à des réponses inflammatoires par le recrutement de neutrophiles, les lymphocytes Tfh aident les lymphocytes B à produire des anticorps de haute affinité.<p><p>L’objectif principal de notre travail est l’étude du développement potentiel de réponses de type Th17 chez le nouveau-né de souris soumis à une stimulation allogénique et au manque d’IL-4. De plus, l’existence potentielle de lymphocytes Tfh induits chez le nouveau-né immunisé avec un vaccin constitué d’ovalbumine de poulet et d’Alum, sera investiguée.<p><p>Dans notre modèle de tolérance néonatale, l’immunisation de nouveau-nés BALB/c à l’aide de cellules spléniques semi-allogéniques F1 (AJAX x BALB/c) induit une polarisation de type Th2, associée à l’établissement d’un chimérisme lymphoïde et à l’acceptation d’une greffe de peau présentant les alloantigènes rencontrés à la naissance. Des nouveau-nés soumis à cette immunisation allogénique et à la privation d’IL-4, réalisée par l’utilisation d’anticorps monoclonaux ou de souris IL-4-/-, rejettent de façon aiguë les greffons de peau et présentent une proportion réduite de cellules chimériques. Cette rupture de la tolérance néonatale est associée à l’inhibition de la réponse allospécifique de type Th2 et au développement de lymphocytes Th17 alloréactifs, produisant de l’IL-17A. L’inhibition de la voie Th17 ne conduit toutefois pas à l’acceptation des allogreffes de peau. Par contre, la neutralisation de l’IL-6 ou de l’IL-17A et la réduction du nombre de neutrophiles restaurent la proportion de cellules chimériques présentes dans la rate, démontrant que la réponse de type Th17 allospécifique néonatale contrôle le chimérisme lymphoïde. <p><p>En réponse au vaccin OVA-Alum, les nouveau-nés présentent une proportion accrue de lymphocytes Tfh CXCR5+ PD-1+, bien que cette proportion lymphocytaire soit significativement diminuée par rapport aux adultes. Les lymphocytes Tfh néonataux expriment en outre des taux moindres des ARNm d’IL-21, d’IL-4 et de Bcl6, suggérant que la génération de lymphocytes Tfh est altérée en début de vie. En parallèle, les titres et la maturation des anticorps produits suite à la vaccination sont réduits chez les nouveau-nés, en comparaison avec les adultes. Cependant, qu’ils soient déficients en IL-4 ou non, des lymphocytes T CD4+ néonataux activés in vitro en présence d’IL-6 induisent une production d’anticorps par des lymphocytes B compétents, suggérant qu’il n’y a pas de défaut intrinsèque des lymphocytes T du nouveau-né à développer une capacité d’aide aux lymphocytes B.<p><p>En conclusion, nous avons montré que la polarisation de type Th2 néonatale inhibe la différenciation de lymphocytes Th17 alloréactifs contrôlant le rejet de cellules allogéniques, un mécanisme pouvant intervenir dans la relation immunitaire entre la mère et l’enfant. Nos résultats indiquent également que le nouveau-né est capable de différencier des lymphocytes Tfh, bien que le développement de ces derniers semble réduit. \ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Bien que la plupart des études se focalisent sur les lymphocytes T CD4+ régulateurs, il a été observé que les lymphocytes T CD8+ régulateurs peuvent jouer un rôle important dans l’induction et le maintien de la tolérance immunitaire. Le transfert adoptif chez la souris et l’induction chez l’homme de lymphocytes T CD8+ régulateurs peuvent inhiber le rejet d’allogreffes et le développement de pathologies autoimmunes. Ces observations suggèrent que l’induction de ces populations peut avoir un potentiel thérapeutique. Des études supplémentaires sont encore nécessaires pour définir les conditions optimales de leur induction. <p>Tant les nouveaux nés humains que murins ont une plus forte capacité que l’adulte à développer des lymphocytes T CD4+ régulateurs induits par une reconnaissance antigénique. La période néonatale serait donc particulièrement appropriée à l’induction de circuits régulateurs.<p>Dans le cadre de ce travail, nous avons étudié le rôle des lymphocytes T CD8+, induits à la naissance, dans le contrôle de la réponse des lymphocytes T CD4+ de type Th2.<p>Des souris BALB/c sont immunisées à la naissance à l’aide de cellules spléniques semi-allogéniques hybrides F1 (AJAX x BALB/c). Ces cellules persistent dans l’animal, au sein des organes lymphoïdes et stimulent ainsi de manière chronique les lymphocytes T CD4+ et T CD8+ du receveur et induisent une réponse de type Th2. Suite à l’injection des cellules spléniques semi-allogéniques au nouveau né de souris, nous avons observé l’expansion d’une population de lymphocytes T CD8+CD25+, dont le phénotype se caractérise par l’expression de Foxp3 et la production conjointe d’IFN-&61543; et l’IL-10. Nous avons pu observer que ces cellules sont capables d’inhiber la production de cytokines Th2 produites par les lymphocytes T CD4+ allospécifiques activés. Par contre, ces cellules régulatrices aggravent des réponses Th2 non apparentées. En effet, suite à une sensibilisation à l’ovalbumine, à l’âge adulte, ces souris développent de plus fortes réponses asthmatiques.<p>D’autre part, les nouveaux nés de souris BALB/c ont été immunisés à la naissance à l’aide de cellules dendritiques semi-allogéniques hybrides F1 (AJAX x BALB/c) qui activent de manière aigüe leurs lymphocytes T. Ces souris présentent une forte réponse Th1 et Tc1/Tc2 spécifique de l’alloantigène et sont protégées contre le développement d’un asthme induit. Il a aussi été montré dans ce travail que suite à l’immunisation néonatale à l’aide de cellules dendritiques semi-allogéniques, le nombre de lymphocytes T CD8+CD44high, CD8+CD62Lhigh et CD8+CD25+ producteurs d’IFN-&61543; augmente significativement. L’IFN-& / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La toxine de pertussis (PTX) est une A-B protéine considérée comme l’un des principaux facteurs de virulence de Bordetella pertussis, l’agent bactérien responsable de la coqueluche. Aujourd’hui, cette maladie représente encore un réel danger pour les nouveaux-nés et les<p>nourrissons non ou partiellement immunisés. Actuellement, la coqueluche provoque encore la<p>mort d’environ 350.000 individus par an. La toxicité de la PTX est liée à l’activité<p>enzymatique de sa sous-unité A capable d’inhiber les voies de signalisation associées aux<p>protéines Gi. La partie B, quant à elle, permet l’entrée de cette sous-unité A dans le<p>cytoplasme des cellules cibles en se liant spécifiquement à son ou ses récepteurs<p>membranaires toujours inconnus de nos jours.<p><p>Des études réalisées chez la souris et chez l’homme ont montré que les vaccins anticoquelucheux combinés à différents antigènes vaccinaux étaient capables de moduler<p>leurs réponses humorales spécifiques. Par ailleurs, la PTX est couramment qualifiée d’agent<p>immunostimulant. En effet, des modèles murins de vaccination permirent d’identifier des<p>propriétés adjuvantes de la PTX coadministrée avec des antigènes non relevants.<p><p>Le travail développé dans ce manuscrit étudie les effets de la PTX sur 2 types cellulaires<p>primordiaux sollicités lors d’une vaccination :la cellule dendritique (DC) et le lymphocyte T<p>CD4+ naïf.<p><p>Les DC sont les seules cellules présentatrices d’antigènes aptes à initier une réponse immune<p>primaire. Dans un premier temps, nous avons montré que la PTX était capable d’activer des<p>DC générées in vitro à partir de monocytes. En effet, elles acquièrent un phénotype mature<p>caractérisé par une augmentation de l’expression membranaire des molécules costimulatrices<p>et du CMH de classe II, démontrant un effet direct et spécifique de la PTX sur les DC<p>myéloïdes. Parallèlement, ces DC produisent du TNF-a, de l’IL-12p40 et de l’IL-12p70 et<p>activent NF-kappaB, un facteur de transcription essentiel au processus de maturation. Nous<p>avons obtenu des résultats similaires avec une toxine génétiquement modifiée qui est<p>enzymatiquement inactive. A partir de sang total incubé avec la PTX, nous avons par ailleurs<p>observé que les DC circulantes du nouveau-né étaient déficientes dans leur maturation et leur<p>sécrétion d’IL-12p70 comparées aux DC de l’adulte.<p><p>D’autre part, il a été décrit précédemment que la PTX exerçait des effets mitogènes sur les<p>lymphocytes T humains et murins. Cependant, le rôle qu’elle joue sur la population des<p>lymphocytes T CD4 naïfs reste peu connu. A l’issue de notre second travail, nous pouvons<p>dès lors affirmer que la PTX est également capable d’activer des lymphocytes T<p>CD4+CD45RA+ naïfs isolés à partir des cellules mononuclées du sang périphérique, et ce<p>indépendamment de son activité enzymatique. En effet, ces lymphocytes T CD4+ naïfs stimulés par la PTX prolifèrent, synthétisent des quantités non négligeables d'ARN messagers<p>codant pour l’IL-2 et le TNF-a, augmentent l’expression membranaire des molécules CD40L,<p>CD69 et CD25 et expriment la protéine Foxp3. Cette activation s’accompagne de la translocation nucléaire de NF-kappaB et NFAT. Parallèlement à l’adulte, la PTX active les lymphocytes T CD4 néonataux. Néanmoins, ceux-ci prolifèrent moins bien et expriment plus faiblement le CD40L à leur surface.<p><p>Enfin, la PTX induit la sécrétion de taux importants d’IFN-g par des T CD4+CD45RA+ naïfs<p>adultes mis en présence de DC autologues.<p><p>Nous terminerons en proposant l’hypothèse suivante :La PTX pourrait exercer ses propriétés<p>adjuvantes par l’intermédiaire de différents mécanismes comprenant notamment la maturation<p>des DC d’origine myéloïde et l’activation des lymphocytes T CD4+CD45RA+ naïfs. Ces 2 populations cellulaires sont en effet les principaux protagonistes impliqués dans la réponse<p>immune primaire. / Doctorat en sciences pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’activation des lymphocytes T nécessite un double signal. Le premier est antigénique et permet la reconnaissance d’un peptide spécifique présenté à la surface de cellules présentatrices d’antigène (APC). Le second signal est co-stimulateur et implique l’interaction avec des molécules activatrices exprimées par les APC et la présence de cytokines proinflammatoires. Les cellules dendritiques (DC) sont les uniques APC capables de délivrer ce double signal et d'activer les lymphocytes T naïfs, initiant ainsi les réponses immunes primaires. L’immaturité du système immunitaire du nouveau-né est responsable d’une plus grande susceptibilité aux maladies infectieuses ainsi qu’une faible réponse vaccinale. Des déficiences tant au niveau de l’immunité innée que de l’immunité acquise participe à une faible défense face aux agressions. A la naissance, les DC expriment des niveaux faibles de molécules co stimulatrices et présentent un défaut majeur de synthèse d'IL 12, cytokine cruciale pour l’établissement de réponses de type Th1. Le but de ce travail est d’évaluer la capacité des DC du nouveau-né humain à activer les lymphocytes T CD8+.<p>Dans une première approche, nous avons utilisé un modèle unique d’induction de réponse primaire in vitro qui permet d'étudier l'activation de lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène Melan-A, une protéine du soi exprimée par les mélanocytes. Ces lymphocytes existent à des fréquences particulièrement élevées chez les individus sains HLA-A2 et présentent les caractéristiques de lymphocytes T naïfs. Dans ce modèle, nous avons d’abord analysé les capacités immunostimulatrices de différentes populations de DC différenciées in vitro. Nous avons observé que les DC différenciées par la culture de monocytes purifiés en présence d'IL-3 et d’IFN-beta sont capables d’initier une réponse fonctionnelle des lymphocytes T CD8+, analogue à celle induite par les DC différenciées en présence de GM-CSF et d’IL-4. Ce même modèle nous a permis de démontrer que, en dépit de leur défaut de production d’IL 12, les DC du nouveau-né sont capables d'induire efficacement une réponse lymphocytaire T CD8+ cytotoxique.<p><p>Afin dévaluer la relevance in vivo de nos observations, nous avons étudié le phénotype et la fonction des DC circulantes chez des nouveau-nés infectés par le cytomégalovirus (CMV). L’infection par le CMV au cours de la vie fœtale représente une situation clinique où le nouveau-né développe une réponse mature et fonctionnelle des lymphocytes T CD8+, alors que celle des lymphocytes T CD4+ est déficiente. Ces expériences ont montré que le phénotype, la fonction et la réponse à différents stimuli des APC présentes en périphérie ne sont pas affectés par l’infection congénitale par le CMV. Ces résultats suggèrent que l’observation des DC circulantes des nouveau-nés infectés par le CMV ne permet pas d’analyser l’influence du virus sur la fonction des DC néonatales. Dans ce but, nous avons reproduit un modèle d’infection in vitro de DC par une souche primaire du CMV. L’utilisation de micropuces à ADN nous a permis de comparer l’expression de gènes différentiellement induits par l’infection des DC d’adultes et de nouveau-nés. Nous avons ainsi révélé une proportion importante de gènes différentiellement induits, parmi lesquels celui de l’IFN-beta. Nous avons confirmé ce défaut au niveau protéique et mis en évidence une production d’IL 12 déficiente en réponse à l’infection par CMV.<p>L’ensemble de nos résultats indique que malgré leur immaturité, les DC du nouveau-né sont capables, dans certaines circonstances, d’induire une réponse lymphocytaire T CD8+ cytotoxique. Cependant, le défaut de production de certaines cytokines co-stimulatrices pourrait être impliqué dans la faible réponse des lymphocytes T CD4+ à l’infection par CMV. Ces observations ont d’importantes implications pour la compréhension de l’induction de réponses cytotoxiques au cours d’infections virales et pour l’élaboration de stratégies vaccinales en début de vie.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished