Titre de l'écran-titre (visionné le 29 mai 2023) / La mitochondrie est connue comme la centrale électrique des cellules vivantes. Son rôle est indispensable à la vie et son dysfonctionnement peut entraîner de graves maladies. D'après certaines expériences faites avec des sondes fluorescentes qui se répartissent principalement du côté matrice de la membrane mitochondriale interne, il a récemment été suggéré que la mitochondrie fonctionne à des températures beaucoup plus élevées (~ 50°C) que la température physiologique du corps. Cette découverte, si elle est vraie, nécessiterait la réévaluation de l'efficacité et de tous les cycles thermodynamiques basée sur l'équation de Mitchell, centrale à la théorie chimiosmotique. C'est l'un des aspects de la bioénergétique des mitochondries qui est au cœur du présent projet. Au chapitre 2, des doutes et des critiques concernant la suggestion d'une mitochondrie plus chaude sont soulevés et brièvement discutés. Les implications et répercussions possibles d'une telle affirmation sur certains aspects de la biochimie et de la biophysique mitochondriales sont passées en revue. Une mitochondrie plus chaude - comme on le revendique - impliquerait une correction de 3% du terme de gradient chimique. De plus, si cette affirmation était vraie et dans la mesure revendiquée (10°C), cela impliquererait un certain caractère de moteur thermique (de Carnot) pour le fonctionnement thermodynamique mitochondrial bien que cet aspect ne représente que 4% au plus. Une « mitochondrie chaude » appelle un examen plus approfondi du bilan énergétique qui lui confère ces prétendues températures élevées. Dans les chapitres 3 et 4, comme première étape de cet effort, nous présentons une comptabilité semi-quantitative dans laquelle une formule est proposée qui donne le taux de production de chaleur dans une mitochondrie typique ainsi qu'une formule pour estimer le nombre de molécules d'ATP synthase par mitochondrie. Cent trente types de cellules protozoaires hétérotrophes sont considérés dans cette étude. Les cellules étudiées, sélectionnées pour couvrir une large gamme de tailles (volumes) d'env. 25 µm³ à 125 millions de µm³, sont estimées correspondre à une puissance par mitochondrie allant d'env. 2×10⁰ pW à 4×10⁻⁴ pW. Dans ces cellules, le nombre correspondant d'ATP synthases actives par mitochondrie varie de 37,000 à une dizaine environ. Au chapitre 5, l'origine du désaccord entre la mesure expérimentale et les estimations théoriques est abordée. Étant donné que les estimations théoriques à l'état d'équilibre placent la différence de températures entre la mitochondrie et son environnement à un maximum de 10⁻⁵ °C, ce désaccord de 6 ordres de grandeur est appelé le « paradoxe de la mitochondrie chaude. » On suggère que chaque proton transloqué via l'ATP synthase déclenche un pic de différence de température, qui durerait seulement quelques picosecondes, de l'ordre de magnitude mesuré par Chrétien et al. La moyenne temporelle de ces pics de température redonne la valeur théorique. De plus, une superposition temporelle et spatiale de l'intensité de fluorescence d'un très grand nombre de thermomètres moléculaires dans l'échantillon peut donner l'apparence d'un signal stable et continu. La membrane mitochondriale interne semble être flanquée de différences de températures fluctuant dans le temps et le long de la surface de la membrane, avec des points « chauds » et « froids » sous forme de pointes de température ultrabrèves. Au chapitre 6, il est montré que le potentiel électrostatique moléculaire intrinsèque (MESP) de l'ATP synthase s'ajoute de manière constructive au potentiel électrostatique chimiosmotique et donc le renforce. Cette tension due à la structure même de la protéine représente un nouveau terme d'énergie libre qui semble avoir été négligé jusqu'à présent. Ce terme est au moins à peu près égal en ordre de grandeur et opposé en signe à l'énergie nécessaire pour être dissipée comme un démon de Maxwell (principe de Landauer). Le potentiel électrique à travers la membrane mitochondriale interne, dans laquelle le MESP de l'ATP synthase joue un rôle important, doit être maintenu dans certaines limites pour le bon fonctionnement de la cellule. Dans le chapitre 7, un mécanisme qualitatif pour l'homéostasie de ce potentiel de membrane est proposé, par lequel une augmentation du champ électrique ralentirait l'étape limitante de la chaîne de transport d'électrons (ETC). Une augmentation de tension limite ainsi la vitesse de pompage des protons dans l'espace intermembranaire en ralentissant directement l'ETC mais aussi en court-circuitant l'ETC par électroporation de la membrane entraînant une dépolarisation de celle-ci. La thèse se termine par un chapitre sur l'orientation future possible de la recherche et les principales conclusions qui découlent des travaux qui y sont présentés. / The mitochondrion is known as the powerhouse of all living cells. Its role is indispensable to life, and its malfunction can lead to serious diseases. On the basis of experiments with fluorescent probes that distribute primarily in the inner mitochondrial membrane and the matrix-side of the inner membrane, it has recently been suggested that the mitochondrion is likely to be operating at much higher temperatures than physiological temperature of the body (~ 50°C). This discovery, if true, would necessitate the re-evaluation of the thermodynamic efficiency and all of the thermodynamic cycles, based on the Mitchell equation central to chemiosmotic theory. It is this aspect of the bio-energetics of mitochondria that is at the core of the present project. In chapter 2, doubts and criticisms regarding the suggestion of a hotter mitochondrion have been raised and are briefly discussed. The possible implications and repercussion of such a claim - if true - on some aspects of mitochondrial biochemistry and biophysics are reviewed. A hotter mitochondrion - as claimed - would imply a 3% correction in the chemical gradient term. Further, if this claim is true and to the extent claimed (10°C), this may imply some heat-engine character for mitochondrial thermodynamic operation albeit this may only represent 4% at most. A "hot mitochondrion" calls for a closer examination of the energy balance that endows it with these claimed elevated temperatures. In chapters 3 and 4, as a first step in this effort, we present a semi-quantitative bookkeeping whereby, in one stroke, a formula is proposed that yields the rate of heat production in a typical mitochondrion and a formula for estimating the number of "active" ATP synthase molecules per mitochondrion. One-hundred thirty heterotrophic protozoa cell types are considered in this study. The studied cells, selected to cover a wide range of sizes (volumes) from ca. 25 µm³ to 125 million µm³, are estimated to exhibit a power per mitochondrion ranging from ca. 2×10⁰ pW to 4×10⁻⁴ pW. In these cells, the corresponding number of active ATP synthases per mitochondrion ranges from 37,000 to just about ten. In chapter 5, the origin of disagreement between the experimental measurement and the theoretical estimates is investigated. Since the steady-state theoretical estimates place the temperature difference between the mitochondrion and its surrounding at a maximum of 10⁻⁵ °C, this million-fold disagreement is called the "hot mitochondrion paradox". It is suggested that every proton translocated via ATP synthase sparks a picosecond temperature-difference spike of the order of magnitude measured by Chrétien et al. Time-averaging of these spikes recovers the theoretical value. Further, a temporal and spatial superposition of the fluorescence intensity of a very large number of molecular thermometer molecules in the sample can give the appearance of a steady signal. The inner mitochondrial membrane appears to be flanked by temperature differences fluctuating in time and along the membrane's surface, with "hot" and "cold" spots as ultrashort temperature spikes. In chapter 6, it is shown that the ATP synthase's intrinsic molecular electrostatic potential (MESP) adds constructively to, and hence reinforces, the chemiosmotic voltage. This ATP synthase voltage represents a new free energy term that appears to have been overlooked. This term, at least in ATP synthase molecules derived from five different organisms, is roughly equal in order of magnitude and opposite in sign to the energy needed to be dissipated as a Maxwell's demon (Landauer principle). The electransic potential across the inner mitochondrial membrane must be maintained within certain bounds for the proper functioning of the cell. In chapter 7, a qualitative mechanism for the homeostasis of this membrane potential is proposed whereby an increase in the electric field slows-down the rate-limiting steps of the electron transport chain (ETC). An increase in voltage thus limits the rate of pumping of the protons in the inter-membrane gap by slowing the ETC directly but also through short-circuiting the ETC by electroporation of the membrane leading to depolarization of the membrane. The thesis ends with a chapter on the possible future directions of this research and the main conclusions that arise from the work presented therein.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2017-2018 / Les nanomatériaux attirent l’attention dans le domaine biomédical en raison de leurs propriétés liées à leur taille. Les nanoparticules métalliques, plus particulièrement, possèdent un plasmon de surface localisé leur conférant une signature d’extinction de la lumière caractéristique. Bien que l’argent possède de meilleures propriétés plasmoniques, l’or est habituellement préféré pour des applications médicales, puisqu’il est stable en conditions biologiques en plus d’être biocompatible. Ce projet a donc pour objectif d’exploiter les propriétés des nanoparticules d’or dans le cadre de deux applications : le relargage contrôlé de médicaments et la détection d’analytes en milieu cellulaire. Dans un premier temps, des nanobâtonnets d’or possédant une bande plasmonique dans le proche infrarouge sont utilisés afin de développer des nano-véhicules pour le transport actif de médicaments. Ces bâtonnets sont entourés d’une couche de polymère thermosensible permettant l’encapsulation et le transport de biomolécules jusqu’au site biologique d’intérêt. Un laser dans le proche infrarouge est utilisé comme stimulus externe pour déclencher le relargage des molécules bioactives en causant une augmentation locale de température autour des nanobâtonnets. Ces nouveaux modules sont développés en collaboration avec le Dr. Patrick Mathieu à l’Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec pour étudier la décalcification des valves cardiaques. Le second projet vise à développer un outil micrométrique pour la détection d’adénosine 5’-triphosphate dans l’environnement des cellules, et ce, en collaboration avec les groupes des professeurs Jean-François Masson de l’Université de Montréal et Joachim Spatz de l’Université d’Heidelberg en Allemagne. Cet outil consiste en une micropipette de verre recouverte de nanoparticules d’or fonctionnalisée avec un aptamère fluorescent qui possède une grande affinité pour l’ATP. Lorsque l’aptamère se lie à sa cible, il se replie sur lui-même, rapprochant ainsi le fluorophore de la surface plasmonique. En microscopie de fluorescence, il est possible de mesurer l’extinction de fluorescence résultant de ce changement de conformation pour quantifier la concentration d’ATP localement. / Nanomaterials have attracted a great deal of attention in the fields of biology and medicine because of their unique properties arising from their small size. Metallic nanoparticles, more precisely, can interact with light in various ways as a result of their localized surface plasmon. Even though silver is the best plasmonic material, gold is usually preferred for medical applications because it is both more stable in biological conditions and biocompatible. Therefore, the objective of this project is to take advantage of the properties of gold nanoparticles in two distinct applications: controlled drug delivery and detection of biomolecules in cell cultures. First, gold nanorods with a plasmon in the near-infrared region are used to develop new nanocarriers for active drug transport. These nanorods are covered with a thermosensitive polymeric shell allowing the encapsulation of bioactive molecules. A near-infrared laser is used as an external stimulus to trigger the release of the drug ¬once the nanocarriers have reached the desired biological location by locally increasing the temperature of the gold nanorods. These new modules are developed in collaboration with Dr. Patrick Mathieu from the Quebec Heart and Lung Institute of Université Laval in order to study the decalcification of heart valves. The second project aims at developing a micrometric tool for the detection of adenosine 5’-triphosphate in the vicinity of live cells, in collaboration with the groups of Prof. Jean-François Masson of Université de Montréal and Prof. Joachim Spatz of Heidelberg University in Germany. This tool consists of a glass micropipette covered with gold nanoparticles and functionalized with a fluorescent ATP-selective aptamer. Upon binding to its target, the aptamer changes conformation to form a hairpin, which brings the fluorophore closer to the plasmonic surface. Using fluorescence microscopy, it is possible to measure the fluorescence quenching resulting from this change of conformation, and thus to quantify the concentration of ATP locally.

Titre de l'écran-titre (visionné le 7 septembre 2023) / Les cellules épithéliales qui tapissent la lumière de l'épididyme travaillent de manière concertée afin d'établir un microenvironnement propice pour la maturation et le stockage des spermatozoïdes. Nous avons précédemment démontré que l'ATP, qui est sécrétée par les cellules principales de l'épididyme, fait partie d'un réseau de communication extracellulaire qui mène ultimement à la sécrétion de protons par les cellules claires avoisinantes. Le processus d'acidification luminale est nécessaire pour maintenir les spermatozoïdes dans un état de dormance pendant leur transit dans l'épididyme. Nos travaux visent à étudier la régulation autocrine des cellules principales, en identifiant les transporteurs impliqués dans le processus de sécrétion d'ATP ainsi que leur réponse à l'ATP extracellulaire. Nous avons observé une sécrétion d'ATP constitutive par la lignée de cellules principales épididymaires (DC2) qui était inhibée de façon significative par le Probénécide (PBN), un inhibiteur de la pannexine-1 (PANX-1), et par l'antagoniste de P2X7, A438079. Nous avons aussi confirmé que CFTR est un modulateur de la sécrétion d'ATP. De plus, lorsque les inhibiteurs étaient utilisés en combinaison (CFTRᵢₙₕ₁₇₂ + PBN, A438079 + PBN et CFTRᵢₙₕ₁₇₂ + A438079), aucune inhibition additionnelle de la sécrétion basale d'ATP n'a été détectée, ce qui suggère que PANX-1, P2X7 et CFTR moduleraient un mécanisme commun de sécrétion d'ATP par les cellules DC2. Par ailleurs, l'ajout d'ATPɣS (analogue non-hydrolysable de l'ATP) a induit une augmentation significative des niveaux de calcium intracellulaire (Ca²⁺ᵢ), qui était réduite sans être complètement abolie en absence de calcium dans le milieu extracellulaire. Ces résultats suggèrent une régulation autocrine des cellules principales via l'activation de voies dépendantes du Ca²⁺ᵢ qui impliquerait à la fois les récepteurs P2X et P2Y. Nous procédons actuellement à l'identification des sous-types de récepteurs P2 responsables de l'augmentation du Ca²⁺ᵢ induit par l'ATP dans les cellules DC2. / Epithelial cells lining the epididymis work in a concerted manner to establish an optimal luminal environment for the maturation and storage of spermatozoa. We previously showed that ATP, secreted from principal cells (PCs), is part of a complex extracellular communication network that ultimately leads to activation of neighboring clear cells (CCs). In particular, ATP and its hydrolysis product adenosine stimulate proton secretion by CCs via apical accumulation of the proton pump V-ATPase. Luminal acidification maintains sperm in a quiescent state during their transit in the epididymis. Here we explored the autocrine regulation of PCs by dissecting the transporters involved in ATP secretion, as well as their response to extracellular ATP. Constitutive ATP secretion by the epididymal principal cell line (DC2) was observed, which was significantly inhibited by the pannexin-1 (PANX-1) inhibitor, probenecid (PBN), and the P2X7 antagonist A438079. We also confirmed that CFTR is a modulator of ATP secretion by using the CFTRᵢₙₕ₁₇₂. When inhibitors were applied together (CFTRᵢₙₕ₁₇₂ + PBN, A438079 + PBN, and CFTRᵢₙₕ₁₇₂ + A438079), no additional inhibition was detected on basal levels of ATP release. Furthermore, our results showed that addition of ATPɣS (non-hydrolysable form of ATP) significantly increased intracellular calcium (Ca²⁺ᵢ) levels, indicating that PCs are regulated in an autocrine manner through ATP signaling. Our results also indicate the participation of both P2X receptors and P2Y receptors subtypes in this response to luminal ATP. Our study suggests that P2X7, PANX-1 and CFTR modulate a common ATP release mechanism in the epididymis, and that ATP participates in PCs autocrine regulation via activation of Ca²⁺⁻dependent pathways. We are currently examining the participation of P2 receptor subtypes in the ATP-induced Ca²⁺ᵢ increase.

L'ischémie cardiaque est une condition bien connue pour induire un déséquilibre ionique général dont une augmentation de la concentration du calcium intracellulaire, et une déplétion de la concentration d'ATP intracellulaire. Dans ce travail, nous avons donc étudié son effet sur l'ouverture des hémicanaux, structures à l'origine de la formation des jonctions gap, mais dans l'état où ils ne sont pas appariés pour former un canal intercellulaire. Pour ce faire, nous avons transfecté l'ADNc de la Cx43 dans des cellules CHO que nous avons soumises à une simulation d'ischémie et des bloqueurs d'hémicanaux ont été utilisés pour confirmer leur ouverture spécifique. Les résultats ont montré une augmentation de la concentration du calcium intracellulaire non spécifique à la présence d'hémicanaux. Par ailleurs, la conductance membranaire a été significativement augmentée par l'expression d'hémicanaux et réduite suite à l'application d'un inhibiteur. Ces résultats suggèrent l'implication des hémicanaux dans les dommages conséquents à l'ischémie cardiaque.

Le corps carotidien est le principal senseur périphérique de l'oxygène impliqué dans le contrôle de la ventilation en condition de base et en réponse à l'hypoxie. Cette sensibilité se développe avec l'âge postnatal. Une activité inadéquate du corps carotidien en période néonatale peut prédisposer le nouveau-né prématuré à des instabilités respiratoires. La cotransmission par l'acétylcholine (récepteurs nicotiniques) et l'adénosine tri-phosphate (récepteurs purinergiques P2X) joue un rôle prépondérant dans le fonctionnement du corps carotidien chez le mammifère adulte, mais demeure très peu caractérisé chez le sujet en développement. L'objectif général de cet ouvrage est de déterminer, à l'aide de différentes approches méthodologiques, le rôle de l'acétylcholine et de l'adénosine tri-phosphate dans la ventilation, l'activité du corps carotidien et le maintien d'un patron stable de la rythmicité respiratoire chez le rat à différents âges de développement. La première étude de cet ouvrage montre que le blocage des récepteurs nicotiniques atténue la réponse ventilatoire à l'hypoxie de manière âge dépendante à l'intérieur de la gamme d'âges étudiés. Ces changements sont en partie liés à l'activation des récepteurs nicotiniques de type α7 localisés au niveau des corps carotidiens. La deuxième étude révèle que le blocage des récepteurs purinergiques de type P2X réduit l'activité ventilatoire et l'activité des corps carotidiens en condition de base et en réponse à l'hypoxie. Ces effets impliquent en partie les récepteurs exprimant la sous-unité P2X3. Contrairement aux récepteurs nicotiniques, dans la gamme d'âges que nous avons testés, la contribution des récepteurs P2X sur l'activité ventilatoire ainsi que sur l'activité des corps carotidiens demeure stable avec l'âge postnatal. Enfin, l'étude du blocage combiné des récepteurs nicotiniques et P2X chez le rat nouveau-né démontre une importante interaction sur l'homéostasie ventilatoire en condition de base, très prononcée lors des premiers jours de vie. Cette étude montre également une augmentation de la fréquence des apnées et du coefficient de variation de la ventilation minute suite au double blocage des récepteurs nicotiniques et purinergiques P2X. Ces instabilités respiratoires sont très accentuées chez le jeune rat de 4 jours de vie comparé à celui plus mature de 12 jours de vie. L'ensemble des études présentées dans cet ouvrage montre que la transmission cholinergique (nicotinique) et purinergique (adenosine tri-phosphate) joue un rôle déterminant dans la régulation de la respiration et le maintien d'un patron stable de l'activité respiratoire chez le rat en développement.

La thérapie cellulaire régénératrice permet de soigner un organe ou un tissu lésé par la transplantation de cellules saines isolées chez le patient ou un donneur sain. Les cellules transplantées se substitueront aux cellules défaillantes et régénéreront le tissu endommagé.Les cellules stromales mésenchymateuses (MSC) utilisées dans le cadre de la thérapie cellulaire sont amplifiées par culture ex vivo avant leur implantation chez le patient. Cette étape requiert la présence de facteurs de croissance généralement apportés par l’ajout de sérum, souvent d’origine animale (sérum fœtal bovin [FBS]), au milieu de culture. L’origine animale du FBS pose de nombreux problèmes de biosécurité. En effet, le risque de contamination du FBS par des virus et/ou des prions n’est pas négligeable et des anticorps dirigés contre les protéines animales ont été mis en évidence dans le sérum de certains patients transplantés. La mise au point de milieux de culture dépourvus de sérum mais préservant la viabilité et les fonctions des cellules représente dès lors un enjeu important.Au cours de ce travail, nous avons étudié les effets de la privation en sérum sur la viabilité de MSC isolées à partir de moelle osseuse humaine et des cellules SaOS-2, une lignée cellulaire ostéoblastique. Dans ces cellules, la carence en sérum inhibe les voies de signalisation MAPK ERK1/2, p38 MAPK ainsi que la voie de la PKB et favorise l’expression et l’activation des membres pro-apoptotiques de la famille des Bcl-2. In fine, elle conduit à l’activation des caspases-3/7 et à l’apoptose. Les MSC présentent toutefois une certaine tolérance à la privation en sérum.Nous avons ensuite évalué l’action de deux facteurs, le Glucose-dependent Insulinotropic Peptide (GIP) et l’adénosine triphosphate (ATP) sur les effets délétères et la mortalité induits par la carence en sérum. En effet, dans d’autres types cellulaires, le GIP et l’ATP exercent une action anti-apoptotique en réponse à différents stress cellulaires dont la privation en sérum.Après avoir vérifié la présence et la fonctionnalité du récepteur au GIP (GIPR) dans les MSC humaines ainsi que dans les cellules SaOS-2, nous avons montré que le GIP diminue de moitié la mortalité cellulaire et l’activation des caspases-3/7 observées dans les MSC carencées en sérum. L’utilisation de la forskoline et d’un inhibiteur spécifique de l’adénylate cyclase nous a permis de montrer que l’effet protecteur du GIP nécessite l’activation de la voie de l’adénylate cyclase et l’accumulation d’AMPc intracellulaire. Le GIP est cependant sans effet sur les voies de signalisation MAPK ERK1/2, p38 MAPK et PKB.L’expression des différents membres de la famille des récepteurs purinergiques avait déjà été documentée dans les MSC humaines. Nos résultats ont montré que l’ATP protège partiellement les MSC et les cellules SaOS-2 de la mort cellulaire provoquée par la culture en absence de sérum. De manière intéressante, nous avons observé que le nucléotide abolit l’activation des caspases-3/7. La présence d’ATP permet également de restaurer l’activité des MAPK ERK1/2 et p38 MAPK. Le nucléotide ne module pas la voie de signalisation de la PKB. Ensuite, nous avons confirmé l’implication des différentes voies de signalisation MAPK ERK1/2 et p38 MAPK grâce à l’utilisation de PD0325901, un inhibiteur des MEK1/2, et de SB203580, un inhibiteur de l’activité de la p38 MAPK. Ces deux inhibiteurs contrecarrent l’effet protecteur de l’ATP sur la viabilité des MSC. En outre, à l’instar du GIP, l’ATP entraine une augmentation de l’AMPc intracellulaire, probablement via l’activation du récepteur P2Y11. Cette accumulation d’AMPc participe à l’effet protecteur de l’ATP. L’ajout d’ATP dans le milieu de culture sans sérum module également l’expression des membres de la famille des Bcl-2 dont, notamment, mcl-1 qui code pour une protéine anti-apoptotique, et puma et bmf, deux gènes codant pour des protéines pro-apoptotiques. L’ATP inhibe l’activité de la protéine pro-apoptotique Bad en prévenant sa déphosphorylation.Enfin, nous avons montré que les MSC carencées en sérum libèrent de l’ATP dans le milieu extracellulaire à des concentrations 10 fois supérieures à celles mesurées dans des conditions de culture standards (10% FBS). Ceci pourrait représenter un mécanisme intrinsèque de protection contre la mort cellulaire. En conclusion, nous avons montré que le GIP et l’ATP protègent les MSC humaines et les cellules SaOS-2 de la mort cellulaire induite par la privation en sérum. Nous avons déterminé que la voie de l’adénylate cyclase-AMPc est impliquée dans cet effet protecteur. De même, l’ATP préserve l’activité des voies de signalisation MAPK ERK1/2 et p38 MAPK. Le facteur de transcription CREB pourrait être l’élément central de l’action protectrice du GIP et de l’ATP. Enfin, nos résultats suggèrent que, lorsqu’elles sont carencées en sérum, les MSC seraient capables d’activer un processus intrinsèque de survie via la libération de facteurs tels que l’ATP dans le milieu extracellulaire. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

In this work, we were interested in studying the effect of two main metabolic factors, hypoxia and extracellular ATP metabolism, on the effector function of T helper subsets. The major oxygen sensor is HIF-1α which is continuously degraded in the presence of oxygen but is stabilized in hypoxia, leading to transcription of genes involved in cellular adaptation to low oxygen level. Our data show that the proportion of IFN-& / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les nucléotides, et tout particulièrement l’ATP, sont capables de moduler la fonction de l’un des principaux acteurs de la réponse immunitaire à savoir les cellules dendritiques (DC). Les DC expriment à leur surface de nombreux récepteurs P2X et P2Y dont le P2Y11, couplé à la voie de l’AMP cyclique (AMPc) et impliqué dans l’immunomodulation. L’ATP est capable, par son action sur le P2Y11, d’induire une semi-maturation des DC caractérisée entre autre par une diminution de la sécrétion d’IL-12 et une augmentation de la sécrétion d’IL-10. De plus, des données antérieures obtenues au laboratoire montrent que l’ATP confère également des propriétés immunosuppressives aux DC en stimulant l’expression de la thrombospondine-1 (TSP-1) et de l’indoléamine-2,3-dioxygénase (IDO).<p><p>Dans ce contexte, notre projet visait à établir un profil d’expression génique en réponse à l’ATP dans des DC humaines issues de monocytes (MoDC) afin d’avoir une vue globale de l’action de l’ATP sur les DC. Dans un premier temps, nous avons donc réalisé une étude cinétique comparant les profils d’expression génique en réponse à l’ATPγS, un agoniste plus stable que l’ATP, et à la prostaglandine E2 (PGE2), un activateur de l’AMPc induisant une semi-maturation des DC, par la technique de microarray. L’analyse de ces profils a mis en évidence une action précoce et large de l’ATPγS sur les MoDC. Un grand nombre de régulations obtenues ont confirmé les effets déjà connus de l’ATP sur les DC. Par ailleurs, nous avons confirmé par différentes techniques plusieurs nouvelles cibles de l’ATP impliquées dans l’inflammation et la réponse immunitaire (ex. CSF-1, NRP-1, VEGF).<p><p>En analysant plus en détail ces profils, nous avons observés la régulation de plusieurs gènes dont VEGF, AREG, EREG et HB-EGF, intervenant dans les processus d’angiogenèse et de tumorigenèse. Parmi ceux-ci, le gène AREG codant pour l’amphiréguline, un ligand de l’EGF récepteur (EGFR) était le gène le plus régulé dans notre profil microarray. Pour la première fois, nous avons démontré que les DC traitées à l’ATPγS en présence de LPS constituaient une importante source d’amphiréguline capable de stimuler la croissance de cellules musculaires lisses et de cellules tumorales LLC (Lewis Lung Carcinoma) in vitro. <p>Parallèlement, nous avons étudié l’implication des cellules dendritiques traitées à l’ATPγS sur la croissance tumorale in vivo. Pour ce faire, nous avons coinjecté, à des souris C57 black/6, des cellules tumorales LLC avec des surnageants issus de BMDC traitées au LPS ou au LPS+ATPγS. De cette façon, nous avons mis en évidence que des surnageants issus de BMDC traitées au LPS+ATPγS induisaient une augmentation significative de la masse tumorale par rapport aux surnageants issus de BMDC traités au LPS seul. Au moyen d’un anticorps bloquant anti-amphiréguline, nous avons démontré que cette augmentation de la masse tumorale était due à l’importante sécrétion d’amphiréguline par les BMDC traitées au LPS+ATPγS. De plus, nous avons observé une augmentation du nombre de vaisseaux positifs pour l’α-SMA, un des marqueurs des cellules musculaires lisses, dans les tumeurs issues de la coinjection de cellules LLC avec des surnageants de BMDC traitées au LPS+ATPγS. Pour finir, nous avons montré que les DC au sein des tumeurs LLC expriment non seulement le récepteur EGFR mais également l’amphiréguline. Ces différents résultats observés mettent en avant l’importance de l’ATP extracellulaire dans la croissance tumorale par son action sur les DC. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les biocapteurs sont des moyens d’analyse en plein essor à la fois rapides, sélectifs et peu coûteux applicables à des domaines extrêmement variés (environnement, santé, agroalimentaire,…). Dans ce type d’outil, un élément sensible de nature biologique (anticorps, enzyme, microorganisme, ADN…) doté d’un pouvoir de reconnaissance pour un analyte ou un groupe d’analytes est associé à un transducteur pouvant être de type électrochimique, optique ou thermique.Dans ce travail, nous nous sommes intéressés au développement de trois biocapteurs pour la détection de substances biologiquement actives. Le premier permet la détermination simultanée de l’adénosine triphosphate (ATP) et du glucose par ampérométrie, le deuxième celle de la créatine kinase, et le troisième est un biocapteur conductimétique pour la quantification de l’ATP. Dans les deux premiers biocapteurs, deux enzymes (l’hexokinase et la glucose oxydase) sont immobilisées à la surface de microélectrodes constituées d’un disque de platine. Le troisième biocapteur est basé sur l’immobilisation de l’hexokinase sur des microélectrodes interdigitées en or. L’immobilisation est réalisée dans tous les cas par co-réticulation des enzymes en présence d’albumine de sérum bovin à l’aide de glutaraldehyde. Les caractéristiques analytiques des biocapteurs ont été déterminées et différentes procédures ont été développées pour l’analyse d’échantillons réels. Les biocapteurs ont pu être appliqués avec succès à la quantification de l’ATP, du glucose et de la créatine kinase dans des préparations pharmaceutiques et du sérum sanguin / Biosensors are rapid, selective and inexpensive devices that combine a biological recognition element, the so-called bioreceptor (e.g. enzymes, antibodies, DNA or microorganisms) to a physical transducer (e.g. electrochemical, optical, thermal or piezoelectrical). They can be used to detect one specific analyte or one family of analytes for a wide range of applications (e.g. environment, food, health). In this work, the detection of biologically active substances was targeted. A biosensor system for simultaneous determination of adenosine triphosphate (ATP) and glucose, a biosensor for creatine kinase analysis, and a novel conductometric biosensor for ATP determination were developed. In the first two biosensors, two enzymes (hexokinase and glucose oxidase) were immobilized at the surface of platinum disc microelectrodes for amperometric detection. The third biosensor was based on hexokinase immobilized onto gold interdigitated microelectrodes for conductometric detection. In all cases, the enzymes were co-immobilized with bovine serum albumin by cross-linking using glutaraldehyde. Analytical characteristics of the biosensors were determined and different procedures were developed for real samples analysis. The biosensors could be successfully applied to the determination of ATP, glucose, and creatine kinase in pharmaceutical samples and blood serum

L’ATP est l’agoniste naturel du récepteur P2Y11. Ce nucléotide ne peut cependant pas être utilisé comme agent thérapeutique car, in vivo, il s’hydrolyse rapidement en ADP ou en AMP qui ne possèdent qu’une faible activité pour le récepteur. D’où l’intérêt de disposer d’analogues de synthèse moins sensibles à l’hydrolyse et possédant une affinité égale ou supérieure à celle de l’ATP.<p><p>Le premier objectif que nous nous sommes fixés au cours de notre thèse de doctorat fut de mettre au point un schéma de synthèse permettant d’obtenir des analogues de l’adénosine-5’-triphosphate [1] portant un motif thioalkyle ou thioaryle en position 2 de la base ainsi qu’un groupement dichlorométhylène entre les phosphores b et g & / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished