Le nombre de thérapies cellulaires à l'étude va grandissant. Parmi ces thérapies, on retrouve la thérapie cellulaire de la dystrophie musculaire de Duchenne. Cette dernière vise l'amélioration des conditions de vie des enfants atteints par cette maladie génétique rare. En effet, on dénombre 1 garçon sur 3500 touché par cette maladie. Il s'agit d'une maladie génétique irréversible affectant le gène de la dystrophine, qui occasionne une dégradation prématurée des fibres musculaires. Les patients touchés se retrouvent rapidement immobilisés, ce qui amène une mort lente, généralement causée par une insuffisance pulmonaire ou cardiaque, entre l'âge de 20 à 30 ans. Cette thérapie consiste à prélever des cellules du patient qui seront mises en culture, corrigées génétiquement, pour alors être greffées vers les muscles ciblés. Pour contribuer à la sécurité de cette thérapie, un milieu de culture cellulaire non supplémenté par du sérum sanguin (serum-free medium, SFM) a été développé par Victor Parent, étudiant au doctorat sous la supervision d'Alain Garnier. Ce milieu permet de remplacer le milieu conventionnel utilisé pour multiplier ces cellules (serum containing media, SCM) contenant du sérum fœtal bovin (fetal bovine serum, FBS). Le FBS est efficace en culture cellulaire, cependant il augmente les risques de contamination chimique et biologique. Il fait en sorte que la composition du milieu de culture est variable d'un lot à l'autre de FBS, ce qui augmente la variabilité du procédé de croissance cellulaire et son coût dispendieux n'est pas à l'abri des fluctuations du marché. Ces fortes contraintes motivent le développement de milieux définis sans sérum. Le SFM a été développé en testant plus de 6 milieux de base et plus de 60 ingrédients divers. Cependant les cellules cultivées dans ce milieu ne présentent pas la même morphologie que celles cultivées en présence de FBS. Aussi, en fin de culture en SFM, les cellules peuvent présenter un début de différentiation en myotubes. Cette différentiation est non désirable lors de la culture de cellules précurseurs des muscles (myoblastes). De plus, le coût de l'ensemble des ingrédients du SFM représente 1600 $/L, soit 5 fois celui du milieu standard (SCM). Afin de résoudre ces problèmes et réduire le coût de ce milieu, une étude a été lancée pour optimiser le SFM. Pour ce faire, un algorithme d'analyse d'image a été utilisé afin d'évaluer objectivement, simplement et en direct, la morphologie cellulaire. Cette méthode est non destructive et a la capacité d'analyser automatiquement cette morphologie en étant combinée à un microscope automatisé dans un environnement contrôlé. Combiné à l'utilisation de plans statistiques d'expérience, ces moyens permettent d'obtenir les informations nécessaires en utilisant un minimum d'échantillons, d'efforts et de coûts. Afin de répondre aux objectifs de ce projet, quatre groupes de plans d'expérience ont été effectués sur les ingrédients existants du SFM. Les résultats de ces essais ont permis d'exclure quatre des huit ingrédients les plus coûteux du SFM, ce qui représente une diminution totale de son coût de 59%, aboutissant à l'identification d'un milieu optimal (MSFM). De plus, la morphologie et le temps doublement des cellules dans le MSFM est similaire au SCM et ne présente aucune formation de myotubes. Un essai de greffe de cellules cultivées avec ce milieu démontre que la greffe de cellules cultivées dans le MSFM est 20% plus efficace in vivo par rapport aux milieux standards (SFM et SCM). Face à deux compétiteurs de ce milieu, le MSFM se situe parmi les moins chers du marché (2 fois plus élevé que le SCM) et il est 81% plus performant que son plus proche concurrent. En conclusion, cette recherche a permis d'optimiser un milieu de culture cellulaire sans sérum. Cette optimisation rend ce milieu, le MSFM, le plus performant et le moins cher actuellement disponible. Il va donc ainsi pouvoir s'intégrer dans tous travaux de recherche menés sur les myoblastes humains ainsi que lors du développement de thérapies cellulaires de la dystrophie musculaire de Duchenne et finalement de l'application de ces thérapies.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique affectant un garçon sur 3500. Elle entraîne une dégénération progressive et irréversible des muscles. Actuellement, la maladie est incurable et aucune thérapie ne permet de traiter les patients de façon efficace et sécuritaire. La thérapie cellulaire, qui consiste à injecter des cellules musculaires humaines saines, les myoblastes, dans les muscles des personnes atteintes de la DMD, a déjà donné des résultats cliniques prometteurs. Par contre, quelques problèmes entravent le développement de cette thérapie. Entre autre, le milieu de culture utilisé pour l’expansion des myoblastes contient du sérum fœtal bovin (FBS). Le FBS est un produit animal non défini pouvant être contaminé par des bactéries, des virus ou des prions. Les risques possibles pour la santé des patients peuvent entraver l'acceptation de la thérapie. Il est donc préférable de remplacer le FBS par un mélange d'additifs définis, notamment par des cytokines. De plus, les procédés de production actuels sont inadéquats pour répondre à la demande en cellules musculaires. Ce projet vise à élaborer un milieu de culture sans sérum pour la prolifération in vitro des cellules musculaires et à développer un procédé de production à grande échelle de ces cellules. Pour développer un milieu sans sérum, une méthode en boucle a été utilisée. Celle-ci se divise en 3 étapes : a) monter une banque de facteurs potentiels en identifiant les récepteurs cellulaires par RT-PCR et par un criblage de la littérature, b) tester ces facteurs en culture en utilisant, entre autre, une planification statistique des expériences (DOE) permettant de vérifier les effets individuels et synergiques de ces additifs et c) ajouter les additifs générant une réponse bénéfique au milieu de culture. Cette boucle a été itérée jusqu'à ce que le nombre de facteurs testés soit suffisant pour que la réponse cellulaire avec le nouveau milieu soit comparable au milieu avec FBS. Pour atteindre l'objectif de mise à l’échelle, le projet s’est limité à la sélection de microporteurs permettant une adhésion efficace des myoblastes. Suite à l'essai par DOE de 9 milieux de base et de 72 additifs, un milieu sans sérum, le LOBSFM, a été développé. Il s'agit, à notre connaissance, du seul milieu de culture sans sérum existant qui est aussi efficace que le milieu traditionnel pour la prolifération des myoblastes. Un brevet a été déposé pour protéger ce milieu. Il permet la prolifération spécifique des myoblastes (~80% myoblastes dans la culture, vérifié par marquage immunocytochimique) aussi efficacement que le milieu standard contenant 15% de FBS, durant au moins 60 jours de culture. De plus, les myoblastes cultivés dans le LOBSFM conservent leur capacité de fusionner et ainsi former des fibres musculaires. Pour ce qui est du procédé de culture, les microporteurs poreux Cytoline2™ ont permis d'obtenir une concentration cellulaire finale de 1,5E6 cell/mL, comparable à la culture en flacon statique. Les pores protègent les myoblastes contre les contraintes hydrodynamiques et permettent une récupération simple des cellules. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a genetic disease affecting one boy out of 3500. It leads to progressive and irreversible muscle degeneration. Currently, there is no cure for this disease and no therapy allows an efficient and safe treatment. Cell therapy consists in injecting healthy human muscle cells, myoblasts, into the muscles of DMD patients. Promising results have been obtained in clinical trials using this approach. However, some problems need to be overcome. Particularly, the original culture medium used to expand myoblasts contains Foetal Bovine Serum (FBS). FBS is an undefined product derived from animal, which can be contaminated with bacteria, viruses or prions. The possibility of harmful consequences for the patients hampers the acceptability of the therapy, so FBS must be replaced by a mixture of defined factors such as specific recombinant cytokines. Moreover, the production processes are currently inappropriate to meet the demand for muscle cells. Therefore, this project aims to develop a serum-free medium for the in vitro proliferation of muscle cells and a large-scale process for the production of those cells. A multi-step method was used to develop the serum-free medium. It is divided into three main steps: a) to build a panel of potential factors from a screen of the literature followed by the detection of more than 100 receptors and autocrine factors using RT-PCR, b) to test those factors in culture using statistical design of experiment (DOE) allowing to verify individual and synergistic effects and c) to add the factors that generate beneficial response to the culture medium. Those steps are followed until a cellular response comparable to the culture in standard medium is obtained. To achieve the scale-up objective, the project was limited to the selection of microcarriers that allowed the proper adhesion of myoblasts. The potential factors identified in the first stage, together with additional ones taken from the literature, formed a panel of 9 basal culture media and 72 additives that have been tested by means of DOE. At the end of this process, a serum-free medium, LOBSFM, was developed. To our best knowledge, it is the only existing efficient serum-free medium for myoblast proliferation and a patent has been obtained to protect its use. It allows a specific expansion of myoblasts (~80% myoblasts, verified by immunostaining) comparable to a standard medium containing 15% FBS over a 60-day culture period. Moreover, myoblasts kept their ability to form muscle fibers. Porous microcarriers Cytoline2 allowed a final cell concentration of 1.5E6 cells/mL, comparable to cell expansion in static culture plate. The pores protected the cells against mechanical stresses while the cell recovery remained easy.

Le sérum ajouté aux milieux de culture est connu pour être une substance difficile à contrôler en raison de la présence de facteurs variables. Le but de cette étude était de faire varier les conditions de culture en retirant le sérum lors de la montée à l'interface air-liquide et de poursuivre les observations sur la qualité des substituts cutanés sains et psoriasiques produits par la méthode d'auto-assemblage. Les résultats histologique, macroscopique et immunohistochimique des substituts sains cultivés avec ou sans sérum ne montrent aucune différence significative. Les analyses infrarouges effectuées sur ces derniers permettent d'observer que ceux cultivés en absence de sérum possèdent une meilleure organisation lipidique au niveau de la couche cornée. Par contre, l'absorption percutanée démontre des différences au regard des propriétés physico-chimiques des molécules étudiées. De plus, les substituts conçus à partir de cellules psoriasiques affichent des résultats différents lorsque le sérum est retiré. Il semble que l'apport du sérum soit davantage important lors de l'utilisation de cellules pathologiques.

La thérapie cellulaire est une méthode d’avenir innovante, actuellement utilisée dans le traitement de pathologies multiples (auto-immunitaire, cancéreuses, pathologies inflammatoires, allogreffes…) et la régénération des pertes de substance tissulaire. Les cellules souches mésenchymateuses, par la variabilité de leurs origines, présentent des propriétés très intéressantes à la thérapie, notamment un potentiel de différenciation en lignées multiples, et des propriétés d’immunomodulation importantes. Mon projet s’intéresse à l’utilisation de cellules souches orales récemment isolées de la gencive par notre équipe : cellules souches gingivales (GSC), et présentant un avantage fonctionnel par rapport aux sources cellulaires traditionnelles d’origine mésodermique (moelle osseuse) ou orales (pulpe dentaire, follicule dentaire, ligament parodontal, glandes salivaires…). Les défauts osseux des mâchoires, de par leur multitude d’étiologies (traumatismes, dysmorphoses, cancer, ...) et le handicap généré, représentent une cible thérapeutique privilégiée. Les GSCs ont la même origine embryologique neurectodermique que les os maxillaires et par là-même un phénotype proche, exploré dans notre équipe. Cette source gingivale de prélèvement non traumatique est une alternative aux techniques chirurgicales actuelles mutilantes pour le site donneur. Notre objectif est double : Etablir un protocole préclinique de culture des GSC en ostéoblastes, pour être compatibles avec la thérapie humaine afin d’obtenir une régénération osseuse optimale. Les capacités immunomodulatrices des GSCs sont par là-même étudiées dans ces nouvelles conditions, dans le but de maitriser la réaction inflammatoire et préserver la greffe osseuse, grâce à la plateforme exceptionnelle mise à notre disposition par l’établissement français du sang, et une équipe très spécialisée dans l’étude des mécanismes de régulation immunitaires. Nos résultats permettront non seulement une régénération osseuse transposable chez l’homme, mais également d’utiliser ces cellules pour le traitement d’autres pathologies (cancéreuses, auto-immunitaires…) en utilisant leur capacité immunomodulatrice. / Cell therapy is an innovative method of the future, currently used in the treatment of multiple diseases (autoimmune, cancer, inflammatory pathologies, allografts ...) and the regeneration of tissue loss. Mesenchymal stem cells (MSC), regardless their origins, exhibit very interesting properties for therapy, including a potential for multi-line differentiation, and important immunomodulation properties. My project focuses on the use of oral stem cells recently isolated from the gingiva by our team (GSC), and having a functional advantage over traditional mesodermal (bone marrow) cellular sources. The bone defects of the jaws, due to their multitude of etiologies (trauma, dysmorphoses, cancer...) and the generated handicap, represent a preferred therapeutic target. GSCs have the same neurectodermal embryological origin as the maxillary bones and thus a similar phenotype, explored in our team. This gingival source of non-traumatic removal is an alternative to current mutilating surgical techniques for the donor site. Our goal is twofold: To establish a preclinical GSC culture protocol in osteoblasts, to be compatible with human therapy, in order to achieve optimal bone regeneration. The immunomodulatory capacities of the GSCs are themselves studied under these new conditions, with the aim of controlling the inflammatory reaction and preserving the bone graft, thanks to the exceptional platform made available to us by the French blood establishment, and A highly specialized team in the study of immune regulation mechanisms. Our results will not only allow transposable bone regeneration in humans but also use these cells for the treatment of other pathologies (cancerous, autoimmune ...) using their immunomodulatory capacity.

L'essor des thérapies régénératives au cours des 10 dernières années a entraîné un effort de recherche important, mais l'obtention des cellules souches humaines en quantité suffisante reste cependant encore problématique, notamment concernant les cellules souches mésenchymateuses (CSM). Ces travaux ont donc mis en œuvre une approche à la croisée de la biologie et du génie des procédés afin d'identifier les verrous limitant la croissance des CSM. L'étude des méthodes d'intensification de culture a été entreprise grâce à l'utilisation de microporteurs et d'une plateforme de minibioréacteurs de 200~mL. Puis le développement d'un milieu de culture sans sérum a été testé dans le but de maximiser la croissance cellulaire dans des conditions biochimiques contrôlées. Les CSM humaines en tant que modèle type en thérapie cellulaire ont été démontrées comme extrêmement sensibles aux phases de congélation/décongélation, aux variations de température, à un vieillissement prématuré et nécessitant un milieu de culture complexe riche en facteurs de croissance et d'adhérence. Suite à cette étude, plusieurs écueils pourront être évités lors de la montée en échelle d'un procédé de culture de CSM afin d'intégrer leurs paramètres biologiques intrinsèques aux paramètres d'ingénierie des bioréacteurs (transfert de chaleur, contraintes hydrodynamiques, surface d'adhérence) / Progress in regenerative medicines over the past ten years have led to an important research mobilisation, but obtaining a sufficient amount of human stem cells remains nonetheless problematic, especially for mesenchymal stem cells (MSC). Hence, this work developed an approach coupling biology and process engineering to identify barriers limiting MSC growth. The study of scaled-up amplification methods was performed using microcarriers and a 200~mL minibioreactors platform. In order to maximise MSC growth in a biochemically controlled environment, a serum free medium development was tested as well. Human MSC as model cell type for cellular therapies have thus been demonstrated as extremely sensitive to freeze/thaw cycles, temperature variations, subject to premature aging and needing a complex medium enriched in multiple growth and adherence factors. Following this study, several pitfalls might be avoided during MSC process scale-up by integrating the cells biology into the bioreactors' process engineering parameters (heat transfer, hydrodamic stress, adhesion surface)

La thérapie cellulaire régénératrice permet de soigner un organe ou un tissu lésé par la transplantation de cellules saines isolées chez le patient ou un donneur sain. Les cellules transplantées se substitueront aux cellules défaillantes et régénéreront le tissu endommagé.Les cellules stromales mésenchymateuses (MSC) utilisées dans le cadre de la thérapie cellulaire sont amplifiées par culture ex vivo avant leur implantation chez le patient. Cette étape requiert la présence de facteurs de croissance généralement apportés par l’ajout de sérum, souvent d’origine animale (sérum fœtal bovin [FBS]), au milieu de culture. L’origine animale du FBS pose de nombreux problèmes de biosécurité. En effet, le risque de contamination du FBS par des virus et/ou des prions n’est pas négligeable et des anticorps dirigés contre les protéines animales ont été mis en évidence dans le sérum de certains patients transplantés. La mise au point de milieux de culture dépourvus de sérum mais préservant la viabilité et les fonctions des cellules représente dès lors un enjeu important.Au cours de ce travail, nous avons étudié les effets de la privation en sérum sur la viabilité de MSC isolées à partir de moelle osseuse humaine et des cellules SaOS-2, une lignée cellulaire ostéoblastique. Dans ces cellules, la carence en sérum inhibe les voies de signalisation MAPK ERK1/2, p38 MAPK ainsi que la voie de la PKB et favorise l’expression et l’activation des membres pro-apoptotiques de la famille des Bcl-2. In fine, elle conduit à l’activation des caspases-3/7 et à l’apoptose. Les MSC présentent toutefois une certaine tolérance à la privation en sérum.Nous avons ensuite évalué l’action de deux facteurs, le Glucose-dependent Insulinotropic Peptide (GIP) et l’adénosine triphosphate (ATP) sur les effets délétères et la mortalité induits par la carence en sérum. En effet, dans d’autres types cellulaires, le GIP et l’ATP exercent une action anti-apoptotique en réponse à différents stress cellulaires dont la privation en sérum.Après avoir vérifié la présence et la fonctionnalité du récepteur au GIP (GIPR) dans les MSC humaines ainsi que dans les cellules SaOS-2, nous avons montré que le GIP diminue de moitié la mortalité cellulaire et l’activation des caspases-3/7 observées dans les MSC carencées en sérum. L’utilisation de la forskoline et d’un inhibiteur spécifique de l’adénylate cyclase nous a permis de montrer que l’effet protecteur du GIP nécessite l’activation de la voie de l’adénylate cyclase et l’accumulation d’AMPc intracellulaire. Le GIP est cependant sans effet sur les voies de signalisation MAPK ERK1/2, p38 MAPK et PKB.L’expression des différents membres de la famille des récepteurs purinergiques avait déjà été documentée dans les MSC humaines. Nos résultats ont montré que l’ATP protège partiellement les MSC et les cellules SaOS-2 de la mort cellulaire provoquée par la culture en absence de sérum. De manière intéressante, nous avons observé que le nucléotide abolit l’activation des caspases-3/7. La présence d’ATP permet également de restaurer l’activité des MAPK ERK1/2 et p38 MAPK. Le nucléotide ne module pas la voie de signalisation de la PKB. Ensuite, nous avons confirmé l’implication des différentes voies de signalisation MAPK ERK1/2 et p38 MAPK grâce à l’utilisation de PD0325901, un inhibiteur des MEK1/2, et de SB203580, un inhibiteur de l’activité de la p38 MAPK. Ces deux inhibiteurs contrecarrent l’effet protecteur de l’ATP sur la viabilité des MSC. En outre, à l’instar du GIP, l’ATP entraine une augmentation de l’AMPc intracellulaire, probablement via l’activation du récepteur P2Y11. Cette accumulation d’AMPc participe à l’effet protecteur de l’ATP. L’ajout d’ATP dans le milieu de culture sans sérum module également l’expression des membres de la famille des Bcl-2 dont, notamment, mcl-1 qui code pour une protéine anti-apoptotique, et puma et bmf, deux gènes codant pour des protéines pro-apoptotiques. L’ATP inhibe l’activité de la protéine pro-apoptotique Bad en prévenant sa déphosphorylation.Enfin, nous avons montré que les MSC carencées en sérum libèrent de l’ATP dans le milieu extracellulaire à des concentrations 10 fois supérieures à celles mesurées dans des conditions de culture standards (10% FBS). Ceci pourrait représenter un mécanisme intrinsèque de protection contre la mort cellulaire. En conclusion, nous avons montré que le GIP et l’ATP protègent les MSC humaines et les cellules SaOS-2 de la mort cellulaire induite par la privation en sérum. Nous avons déterminé que la voie de l’adénylate cyclase-AMPc est impliquée dans cet effet protecteur. De même, l’ATP préserve l’activité des voies de signalisation MAPK ERK1/2 et p38 MAPK. Le facteur de transcription CREB pourrait être l’élément central de l’action protectrice du GIP et de l’ATP. Enfin, nos résultats suggèrent que, lorsqu’elles sont carencées en sérum, les MSC seraient capables d’activer un processus intrinsèque de survie via la libération de facteurs tels que l’ATP dans le milieu extracellulaire. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le cancer du sein est une maladie complexe et difficile à caractériser. Parmi les différents sous-types moléculaires, les tumeurs du sein Triple-Négatives (TN) sont particulièrement agressives et de mauvais pronostic. Elles sont caractérisées par une absence d’expression des récepteurs aux œstrogènes (ER), à la progestérone (PR), l’absence de surexpression du récepteur Human Epidermal growth factor 2 (HER2) et de fréquentes mutations sur les gènes BRCA1/2 (profil « BRCAness »). En absence de thérapies ciblées efficaces, de nombreux traitements ciblés notamment les inhibiteurs de poly-ADP-ribose polymérases (anti-PARPs) sont actuellement en cours de développement, en recherche préclinique et clinique. Basés sur le principe de létalité synthétique, les anti-PARPs ciblent les propriétés BRCAness des tumeurs TN. Dans ce contexte, ces travaux de recherche ont été orientés sur le développement d’outils diagnostics afin d’optimiser l’efficacité des anti-PARPs sur des tumeurs TN. Pour ce faire, dans un premier temps, des cultures cellulaires en 3D via la technique Liquid Overlay ainsi que des tests de cytotoxicités associés ont été développés, à partir des lignées cellulaires MDA-MB-231 et SUM1315 de phénotype TN. Ces deux modèles de sphéroïdes ont ensuite été optimisés/normalisés dans un milieu de culture synthétique intitulé OPTIPASS (BIOPASS). Dans un deuxième temps, l’efficacité d’un co-traitement combinant l’anti-PARP1 Olaparib à faibles et à fortes doses et la radiothérapie fractionnée (5x2 Gy) a été modélisée sur les deux lignées MDA-MB-231 et SUM1315, en conditions 2D et 3D. Ces expériences ont clairement mis en évidence un effet potentialisateur de l’Olaparib sur la radiothérapie (i) en présence de faibles doses de cet anti-PARP (5 µM ou inférieur) (ii) à long terme et (iii) en présence d’un fractionnement maximum (5x2 Gy). De plus, les lignées tumorales TN étudiées présentaient des différences de sensibilité vis-à-vis du co-traitement. Ainsi, une analyse transcriptomique in silico a mis en évidence des profils très différents de ces lignées hautement métastatiques et très agressives. Notamment, la lignée SUM1315 semblait présenter un engagement neuronal, suggérant son origine métastatique cérébrale. Ces résultats encourageants pourraient ouvrir de nouvelles perspectives pour le traitement des métastases cérébrales de tumeurs mammaires TN, très fréquentes chez ce sous-type. Dans un troisième temps, afin de mieux caractériser le mode d’action de l’Olaparib sur ces modèles de sphéroïdes, un dérivé fluorescent de l’Olaparib, l’Ola-FL, a été synthétisé et caractérisé. L’analyse de la pénétration et de la distribution de l’Ola-FL au sein des sphéroïdes MDA-MB-231 et SUM1315 a mis en évidence une distribution rapide et homogène du composé ainsi que sa persistance après 3h d’incubation, dans toute la profondeur des sphéroïdes et notamment dans les zones hypoxiques centrales. Enfin, l’analyse de la co-expression de deux pompes Multidrug Resistance (MDR) majeures, la MRP7 et la P-gp après le traitement des deux lignées TN avec l’Olaparib, a mis en évidence sur les cultures 2D, une expression de type relai de la MRP7 et la P-gp. Sur les sphéroïdes traités avec une faible dose d’Olaparib à long terme, une expression basale de la MRP7 et une surexpression de la P-gp ont été détectées, au sein des cellules résiduelles périphériques des sphéroïdes. Ces résultats mettent clairement en évidence l’implication des pompes d’efflux dans les mécanismes de résistances à l’Olaparib, dans ces tumeurs agressives. L’ensemble des résultats issus de la modélisation de l’action de l’Olaparib sur des sphéroïdes MDA-MB-231 et SUM1315 laissent supposer sa plus grande efficacité à faible dose et à long-terme, notamment dans les zones hypoxiques des sphéroïdes, probablement aussi à l’origine de son effet potentialisateur avec la radiothérapie. / Breast cancer is a very complex and heterogeneous disease. Among the different molecular subtypes, Triple-Negative (TN) breast cancers are particularly aggressive and of poor prognosis. TN tumours are characterized by a lack of estrogen receptors expression (ER), progesterone receptors expression (PR), the absence of Human Epidermal growth factor receptor 2 overexpression (HER2) of the frequent mutations on BRCA1 / 2 genes ("BRCAness" phenotype). In the absence of effective targeted therapies, many targeted therapies including poly-ADP-ribose polymerase inhibitors (anti-PARPs) are currently under development in preclinical and clinical studies. Based on the synthetic lethality concept, the anti-PARPs specifically target the BRCAness properties of TN tumors. In this context, these works were focused on the development of diagnostic tools for the optimization of TN tumours treatment with anti-PARPs. For this, firstly, 3D cell cultures formed with the Liquid Overlay technique as well as associated cytotoxicity tests were developed, from the TN breast cancer cell lines MDA-MB-231 and SUM1315. These two spheroid models were then optimized and standardized in a synthetic culture medium called OPTIPASS (BIOPASS). Secondly, the efficacy of a co-treatment combining anti-PARP1 Olaparib at low and high doses and fractioned radiotherapy (5x2 Gy) was analyzed on the two cell lines MDA-MB-231 and SUM1315 cultured in 2D and 3D conditions. These experiments clearly demonstrated a potentiating effect of Olaparib on radiotherapy (i) in presence of low doses of this anti-PARP (5 μM or inferior) (ii) at long term and (iii) in presence of the maximum fractionation (5x2 Gy). In addition, these two TN cell lines showed a heterogeneous sensitivity to the co-treatment. Thus, an in silico transcriptomic analysis revealed very different profiles of these highly metastatic and highly aggressive cell lines. Notably, the SUM1315 cell line presented a neuronal commitment, suggesting its cerebral metastatic origin. These promising results could open up new perspectives for the treatment of TN tumours brain metastases, which are very common in this subtype. Thirdly, in order to better characterize the mode of action of Olaparib on these spheroid models, a fluorescent derivative of Olaparib, Ola-FL, was synthesized and characterized. The analysis of Ola-FL penetration and distribution in MDA-MB-231 and SUM1315 spheroids showed a rapid and homogeneous distribution of the compound as well as its persistence after 3h of incubation, in all the depth of the spheroids and especially in the central hypoxic zones. Finally, the analysis of the co-expression of two major Multidrug Resistance (MDR) pumps, MRP7 and P-gp after the treatment of the two TN lines with Olaparib, revealed on 2D cultures, a relay type expression of the MRP7 and the P-gp. On spheroids treated with a low dose of Olaparib art long term (10 days), a basal expression of MRP7 and an overexpression of P-gp were detected in the peripheral residual cells of the spheroids. These results clearly highlighted the involvement of these efflux pumps in Olaparib resistance mechanisms, in these aggressive tumors. All the results resulting from the modeling of the action of Olaparib on MDA-MB-231 and SUM1315 spheroids suggest its greater efficacy at low dose and at long-term, especially in the hypoxic zones of the spheroids. This parameter might be probably at the origin of its potentiating effect with radiotherapy.