Ce projet avait pour but la production de protéines recombinantes pour des procédures vaccinales dans un système végétal. Les protéines choisies ont été d'une part, deux protéines virales d'un Arterivirus, le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (PRRSV), les protéines GP5 et M, et d'autre part une protéine du flagelle, la flagelline ou FljB de Salmonella typhimurium. Le PRRSV est responsable de pertes économiques majeures dans l'industrie porcine mondiale et l'efficacité des vaccins actuels contre ce virus est limitée. La protéine M a été choisie pour sa propriété à former un hétérodimère avec la protéine GP5 qui augmente la réponse immunitaire. La glycoprotéine GP5, quant à elle, possède deux épitopes dans sa région N-terminale dont un joue un rôle majeur puisqu' il est capable de stimuler la production d'anticorps neutralisants nécessaires à la clairance du virus. Enfin FljB, qui est une protéine bien conservée chez les bactéries Gram négatives, a été retenue pour ses propriétés adjuvantes intéressantes de par sa capacité à se lier au récepteur 5 de type toll (TLR5) et à induire des réponses immunitaires systémiques et mucosales. Les hypothèses pour cette étude étaient que la production d'une protéine recombinante M::GP5 intégrant trois mutations (M::GP5mut) à des sites stratégiques de celle-ci induirait une meilleure réponse immunitaire que la protéine GP5 sauvage ; que l'administration par voie orale de plante produisant la protéine M::GP5mut induirait une immunité protectrice contre le PRRSV ; que les propriétés adjuvantes de FljB produite chez Nicotiana benthamiana devraient être comparables à celles de FljB recombinante produite chez E. coli. Pour répondre à ces questions, un système transitoire d'expression chez N. benthamiana a été choisi. Il a l'avantage de pouvoir produire des protéines rapidement et à des niveaux élevés. L'immunogénicité de la protéine M::GP5mut, et les propriétés adjuvantes de la flagelline ont été testées dans un système murin. Dans le cas de la flagelline, l'ovalbumine (OVA) a été choisie comme immunogène. Peu de résultats ont été obtenus dans le cadre du projet des protéines du PRRSV du fait de l'absence de production de celles-ci à un niveau détectable bien que la présence des ARNm ait été confirmée. En revanche, pour FljB, il a été montré que l'administration par voie orale de celle-ci induisait une réponse immunitaire contre l'OVA d'une intensité égale à celle produite par l'administration du mélange OVA avec de la FljB recombinante produite par E. coli et supérieure à celle de l'OVA administrée seule. De plus, FljB recombinante produite dans N. benthamiana a permis d'obtenir une réponse plus précoce qu'avec l'utilisation de FljB recombinante produite chez E. coli. En conclusion, il a pu être montré grâce à FljB que le système de production utilisé était efficace et que FljB est un bon adjuvant qui conserve ses propriétés quand elle est produite chez N. benthamiana. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : PRRSV, FljB, expression transitoire, adjuvant, réponse immunitaire, Nicotiana benthamiana

La sialylation des N-glycanes du fragment Fc des immunogobulines G (IgG) est une modification peu fréquente des IgG humaines. Pourtant, elle est l’objet de beaucoup d’attention depuis que deux articles fondateurs ont été publiés, qui montrent l’un que la sialylation des IgG diminue leur capacité à déclencher la cytotoxicité cellulaire dépendant de l’anticorps (ADCC), et l’autre que les IgG sialylées en α2,6 seraient la fraction efficace des IgG intraveineuses (IgIV) anti-inflammatoires. Les anticorps monoclonaux thérapeutiques, qui sont le plus souvent des IgG recombinantes produites en culture de cellules de mammifère, connaissent depuis la fin des années 90 un succès et une croissance phénoménaux sur le marché pharmaceutique. La maîtrise de la N-glycosylation du Fc des IgG est une clé de l’efficacité des anticorps monoclonaux. Si les IgG sialylées sont des molécules peu fréquentes in vivo, elles sont très rares en culture cellulaire. Dans cette étude, nous avons développé une méthode de production d’IgG avec une sialylation de type humain en cellules CHO. Nous avons travaillé principalement sur la mise au point d’une stratégie de production d’IgG sialylées par co-expression transitoire d’une IgG1 avec la β1,4-galactosyltransférase I (β4GTI) et la β-galactoside-α2,6-sialyltransférase I (ST6GalI). Nous avons montré que cette méthode permettait d’enrichir l’IgG1 en glycane fucosylé di-galactosylé mono-α2,6-sialylé G2FS(6)1, qui est le glycane sialylé présent sur les IgG humaines. Nous avons ensuite adapté cette méthode à la production d’IgG présentant des profils de glycosylation riches en acides sialiques, riches en galactose terminal, et/ou appauvris en fucosylation. L’analyse des profils de glycosylation obtenus par la co-expression de diverses combinaisons enzymatiques avec l’IgG1 native ou une version mutante de l’IgG1 (F243A), a permis de discuter des influences respectives de la sous-galactosylation des IgG1 en CHO et des contraintes structurales du Fc dans la limitation de la sialylation des IgG en CHO. Nous avons ensuite utilisé les IgG1 produites avec différents profils de glycosylation afin d’évaluer l’impact de la sialylation α2,6 sur l’interaction de l’IgG avec le récepteur FcγRIIIa, principal récepteur impliqué dans la réponse ADCC. Nous avons montré que la sialylation α2,6 augmentait la stabilité du complexe formé par l’IgG avec le FcγRIIIa, mais que ce bénéfice n’était pas directement traduit par une augmentation de l’efficacité ADCC de l’anticorps. Enfin, nous avons débuté le développement d’une plateforme d’expression stable d’IgG sialylées compatible avec une production à l’échelle industrielle. Nous avons obtenu une lignée capable de produire des IgG enrichies en G2FS(6)1 à hauteur de 400 mg/L. Cette étude a contribué à une meilleure compréhension de l’impact de la sialylation sur les fonctions effectrices des IgG, et a permis d’augmenter la maîtrise des techniques de modulation du profil de glycosylation des IgG en culture cellulaire. / Only a fraction of the N-glycans present on the Fc fragment of the human IgGs is sialylated. However, a new interest for sialylation has risen since two major articles were published, one showing that sialylation reduces the capacity of the antibody to trigger antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC), whereas the other showed that the IgGs carrying α2,6-sialic acids on their Fc N-glycans were responsible for the anti-inflammatory activity of intravenous immunoglobulins (IVIGs) injected at high doses. Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are in majority recombinant IgGs produced in mammalian cell culture. Since the end of the nineties, mAbs have become a major class of pharmaceutical products, and their success is still growing. The control of Fc N-glycosylation is a key parameter for the improvement of the therapeutic efficacy of mAbs. Sialylated IgGs are found only as traces in the classic CHO cell culture processes. In this study, we developed a method for the production of IgGs with a human-like sialylation in CHO cells. We focused on a production strategy relying on the transient co-expression of an IgG1 with the β1,4-galactosyltransferase I (β4GTI) and the β-galactoside-α2,6-sialyltransferase I (ST6GalI). We showed that this method allowed the enrichment of the IgG1 glycoprofile in the fucosylated di-galactosylated mono-α2,6-sialylated glycane G2FS(6)1, which is the main sialylated glycan found in human IgGs. We then adapted this method to the production of highly galactosylated or highly sialylated IgGs with and without core-fucosylation. The analysis of the glycosylation profiles obtained using the various enzyme combinations co-expressed with the native IgG1 or the mutant IgG1 F243A allowed us to discuss the influence of the under-galactosylation found in IgGs produced in CHO cells versus the Fc structural constraints on the limitation of IgG sialylation in CHO cells. We used the IgG1 glycovariants produced with our method to assess the impact of Fc α2,6-sialylation on the interaction of the IgG with the receptor FcγRIIIa, which is the main receptor mediating the ADCC response. We showed that the presence of α2,6-sialylation in the Fc increased the stability of the IgG-FcγRIIIa complex. This benefit however did not translate into an improved ADCC capacity. Finally, we initiated the development of a stable expression platform for the production of sialylated IgGs at yields relevant for the industry. We obtained a cell line capable of producing IgGs enriched in G2FS(6)1 at 400 mg/L. This may eventually represent a novel approach to manufacture a recombinant IVIG surrogate. With this work, we contributed to a better understanding of the impact of sialylation on the effector functions of IgGs. We also improved our understanding of the techniques allowing for the modification and control of the glycosylation profile of IgGs in cell culture.

Les furocoumarines sont des métabolites secondaires qui dérivent de la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes. Ces phytoalexines interviennent notamment dans les mécanismes de défense des plantes tels que la résistance aux bioagresseurs. Le déterminisme moléculaire de cette voie de biosynthèse est encore mal connu mais il a néanmoins été démontré depuis les années 1960 que les enzymes catalysant les différentes étapes de la voie la synthèse des furocoumarines appartenaient à différentes familles. Les travaux présentés dans ce document se sont focalisés sur deux familles d'enzymes : les dioxygenases oxoglutarate dépendantes et les cytochromes P450s. La première étape de la voie de biosynthèse des furocoumarines consiste en une ortho-hydroxylation du p-coumarate qui mène à la formation de l'umbelliférone. Basé sur des travaux récents sur Arabidopsis, six gènes codants pour des dioxygénases ont été isolés chez Ruta graveolens, Citrus limetta et Pastinaca sativa. Les protéines correspondantes présentent plus de 58% d'identité avec la Féruloyle 6' Hydroxylase (F6'H) d'A. thaliana. La caractérisation fonctionnelle de ces enzymes a été réalisée dans un système d'expression hétérologue procaryote. Sur les 6 enzymes, trois n'ont pu être exprimée efficacement, et deux présentent une activité F6'H similaire à celle décrite pour A. thaliana. La dernière enzyme dispose de caractéristiques nouvelles non décrites à ce jour. Elle est en mesure de réaliser l'hydroxylation du féruloyle coA et du p-coumaroyle coA. Ces études in vitro ont été complétées par une exploration des fonctions de la protéine dans la plante. Une analyse fine du profil d'expression du gène a permis de mettre en évidence une expression qui est en corrélation avec le niveau de production d'umbelliférone. La fonction de la protéine a également été validée par une analyse des produits formés dans des feuilles de Nicotiana benthamiana transformées transitoirement. Les cytochromes P450 catalysent 60% des réactions de la voie de biosynthèse de furocoumarines. Un travail de criblage fonctionnel de cytochromes P450 identifiés au préalable chez Ammi majus et Thapsia garganica a été entrepris. Les analyses de bio-informatiques et les modifications apportées au niveau du mode opératoire pour l'expression dans la levure ont permis d'émettre des hypothèses concernant le rôle de certains P450 candidats. Ces travaux exploratoires et préliminaires font supposer de nouvelles conjectures relatives à cette voie de biosynthèse / Furanocoumarins are secondary metabolites deriving from the phenylpropanoid biosynthetic pathway. These phytoalexins are especially involved in plant defense mechanisms against insects or phytopatogenous fungi and bacteria. The molecular control of this biosynthetic pathway is still poorly understood even though it has been demonstrated since the 1960s that enzymes catalyzing the different steps are belonging to different enzymatic families. The work presented here is focused on two enzyme families: oxoglutarate dependent dioxygenases and cytochrome P450s. The first step in the furanocoumarins biosynthetic pathway is the ortho-hydroxylation of p-coumarate, which leads to the formation of umbelliferone. Based on a recent work done on Arabidopsis, we isolated six genes encoding dioxygenases from Ruta graveolens, Citrus limetta and Pastinaca sativa. The corresponding proteins share more than 58% identity with the A. thaliana féruloyle 6' Hydroxylase (F6'H). The functional characterization of these enzymes was performed in a prokaryotic heterologous expression system. Of the six enzymes, three could not be functionnaly expressed and two exhibited a similar F6'H activity as described for A. thaliana. The last enzyme has new properties not described to date. It is able to achieve both hydroxylation of féruloyle CoA and p-coumaroyle CoA. These in vitro studies were completed by a functional exploration of the protein in planta. A detailed analysis of the gene expression pattern highlighted a link with the level of umbelliferone synthesis. The function of the protein was also confirmed by an analysis of the products formed in transiently transformed Nicotiana benthamiana leaves. Cytochrome P450s catalyze 60% of the reactions of the furanocoumarin biosynthetic pathway. Therefore, a functional screening of cytochrome P450 previously identified in Ammi majus and Thapsia garganica was undertaken. The bioinformatic analyses and the changes undertaken in the procedure for expression in yeast allowed drawing hypotheses on the function of some of these P450 candidates. These exploratory and preliminary experiments allowed suggesting new hypotheses about the biosynthetic pathway