L'acide sialique joue un rôle primordial dans les phénomènes de reconnaissance inter-cellulaires. Au cours de ce travail, les fonctions biologiques des épitopes sialylés régulés au cours du développement, en relation avec la régulation spatiale et temporelle des a2-8 sialyltransferases (ST8sia) au cours de l'embryogenèse du poisson zèbre, ont été étudiées par une combinaison d'analyses chimiques et spectrométriques. Dans un premier temps, les glycolipides, N-glycannes et O-glycannes ont été séquentiellement purifiés d'extraits totaux de poissons zèbres et étudiés par une combinaison de spectrométrie de masse, de digestion enzymatique, de dérivation chimique et de résonance magnétique nucléaire (RMN). Nous avons ainsi mis en évidence l'existence de profils de glycosylation très particuliers dominés par des composés hautement sialylés. Dans un deuxième temps, le suivi de la glycosylation au cours du développement a révélé que la polysialylation des glycoconjugués était différentiellement régulée en fonction de leur nature. Sur ces bases structurales, nous avons suivi l'expression des gènes codant pour les ST8Sias du poisson zèbre par PCR quantitative. Nous émettons l'hypothèse que les glycoprotéines polysialylées observées dans l'embryon sont héritées de la mère, tandis que les glycolipides sialylés sont synthétisés de novo par l'embryon. Enfin, l'observation de la plupart des ST8Sias par hybridation in situ montre qu'elles sont exprimées dans le système nerveux central dés les premiers stades de développement embryonnaire. L'ensemble de nos travaux démontrent l'utilisation du poisson zèbre en tant que modèle animal d'étude cohérent de la glycosylation. / The nine-carbon sugar, sialic acid, plays important roles as the recognition epitopes in cell-cell communications. ln this thesis work, the biological functions of developmentally regulated sialylation were investigated using a combination of chemical and mass spectrometry (MS) analyses. Glycomic survey mapping permitted to identify unusual structures typified by complex sialylation patterns. The analysis of sialyltransferase and sialidase activities along development led to a working model, which proposes that the oligosialic acids from glycoproteins are maternally inherited (synthesized before fertilization) and exocytosis out of the embryo into the perivitelline space where it undergoes catabolism, whereas oligosialic acids on the glycolipids are de novo synthesized by the increasingly expressed ST8sia in the embryos. Furthermore, through whole mount in-situ hybridization, most of the ST8sia were shown to be expressed in the nervous system during early embryogenesis, with different onset and locations. ln summary, the precise MS and MS/MS-based glycomic profiles, together with detailed structural determination, quantitative analysis of the developmentally regulated oligosialylation pattern, and the spatial and temporal expression profiling of ST8sia of zebrafish, collectively provides new sialoglycobiology insights for neuroscientists at the molecular level and highlighted the significance and complicated regulation of oligosialylation in early neuronal development.

La mucoviscidose est la maladie génétique la plus fréquente dans les populations caucasiennes. Elle est causée par des mutations du gène codant pour la protéine CFTR. Elle se caractérise par une inflammation et une infection pulmonaire chronique avec hypersécrétion de mucus. P. aeruginosa y trouve avantage pour coloniser les poumons. Les objectifs de cette thèse ont été de caractériser, dans un modèle porcin, les altérations de la composition biochimique des mucines dès la naissance; d’identifier les mécanismes moléculaires responsables de ces altérations; d’évaluer l’impact sur la colonisation par P. aeruginosa. Nous avons montré que les mucines respiratoires des porcelets CFTR-/- étaient plus sialylées que celles des porcelets CFTR+/+ dès la naissance, avant toute infection ou inflammation. Ces altérations n’étaient pas corrélées à des changements d’expression des mucines, ni à des changements d’expression génique ou protéique des siayltransférases. Nous avons démontré un effet direct de l’activité du canal CFTR sur la sialylation des mucines, pouvant être expliqué par un stress du réticulum endoplasmique. Nous avons également démontré que le transport muco-ciliaire est incapable d’éliminer les bactéries. Cette hypersialylation favorise l’adhésion de P. aeruginosa aux mucines et engendre un environnement favorable à sa croissance. L’infection des porcelets CFTR-/- et CFTR+/+ par P. aeruginosa entraine les mêmes modifications de sialylation. Ce travail de thèse a permis de comprendre comment P. aeruginosa est capable de coloniser les poumons CFTR-/-. Il constitue la base de travaux futurs visant à développer de nouveaux glycomimétiques pour lutter contre ces infections. / Cystic fibrosis is the most common lethal genetic disease in Caucasian populations caused by mutations in the gene coding for the CFTR protein. It is characterized by inflammation, hypersecretion of respiratory mucins and colonization of the lungs by a variety of bacteria such as P. aeruginosa. The objectives of this thesis were to characterize the biochemical alterations of mucins at birth; to identify the molecular mechanisms responsible for these alterations; to evaluate the impact of these alterations on P. aeruginosa lung colonization. We have shown that the respiratory mucins of CFTR-/- piglets were more sialylated before any previous infection or inflammation. These alterations in mucin glycosylation were not correlated with changes in the expression or localization of the secreted mucins, nor with changes in the gene and protein expression of sialyltransferases. We demonstrated a direct effect of the CFTR channel activity on mucin sialylation, which could be explained by endoplasmic reticulum stress. We have shown that mucociliary transport was unable to eliminate bacteria. The changes in mucin sialylation promoted adhesion of P. aeruginosa to the secreted mucins and created a favorable environment for its growth. The same profiles of hypersialylated glycans, as those observed constitutively in CFTR-/- neonates, were detected after infection by P. aeruginosa. Our results prove that sialylation provides a favorable ecological niche for P. aeruginosa. Data gleaned from these study provide new leads for the design of sialylated glycomimetics and the development of therapeutic strategies for treating infections.

La sialylation est l’une des dernières étapes de la biosynthèse des chaînes glycaniques des glycoprotéines et des glycolipides. La sialylation en a2,6 des structures N-acétyllactosaminiques (Galß1-4GlcNAc) est souvent retrouvée en périphérie des glycannes et est impliquée dans de nombreux mécanismes d’adhésion et de reconnaissance cellule / cellule ou hôte / pathogène. Chez l’Homme, deux sialyltransférases synthétisent ce type d’épitope glycanique : hST6Gal I et hST6Gal II. Elles se distinguent par leur spécificité de substrat accepteur et par leur profil d’expression tissulaire. Alors que le gène ST6GAL1 codant hST6Gal I est exprimé dans la plupart des tissus, ST6GAL2 présente une expression tissulaire plus restreinte, se limitant essentiellement au cerveau embryonnaire et adulte. Par ailleurs, hST6Gal II présente des similitudes en termes de spécificité de substrat et d’expression tissulaire avec la sialyltransférase identifiée chez D. melanogaster et semble avoir conservé certaines propriétés ancestrales essentielles pour le développement du tissu nerveux. Plusieurs études ont montré que l’expression des sialyltransférases est contrôlée au niveau transcriptionnel par l’utilisation de promoteurs tissulaires régulant l’expression de manière tissu-spécifique. Si les données concernant ST6GAL2 sont encore limitées, il apparaît cependant que l’expression de ce gène est finement contrôlée par des mécanismes apparemment conservés au cours de l’évolution. Le projet de thèse que nous avons mené a eu pour but d’identifier les régions 5’-non traduites de ST6GAL2 et de caractériser les régions promotrices associées. A partir d’un modèle cellulaire de neuroblastome en culture, nous avons identifié par 5’ RACE trois types de transcrits qui diffèrent par leur premier exon non traduit. Ces exons, appelés EX, EY et EZ, sont situés à plus de 42 kpb du premier exon commun codant et ne sont séparés que de 124 et 87 pb, respectivement. Par Q-PCR en duplex avec le gène normalisateur HPRT, nous avons montré que les transcrits initiés par l’exon EX et EY étaient prépondérants par rapport aux transcrits contenant EZ, à la fois dans plusieurs lignées cellulaires à caractère neuronal et dans des échantillons de tissu cérébral humain. Nous avons également montré que la protéine hST6Gal II est exprimée dans les différents lobes du cortex cérébral, dans le cervelet et dans l’hippocampe. Nous avons isolé différentes régions génomiques situées en amont et à l’intérieur de la région EX/EY/EZ que nous avons sous cloné en amont du gène de la luciférase pour des tests d’activité. Nous avons défini deux régions promotrices, en amont des exons EX et EY. Des expériences de mutagenèse dirigée couplées à des analyses bioinformatiques nous ont révélé que les facteurs de transcription NF-?B et NRSF sont probablement des répresseurs de la transcription, alors que les facteurs Sox5, SP1, Pura et Olf1 agirait comme des éléments activateurs de la transcription de ST6GAL2. Les facteurs NRSF, Sox5, Pura et Olf1 régulent notamment la transcription de gènes impliqués dans le fonctionnement et le développement neuronal, suggérant un rôle de ST6GAL2 dans les fonctions neuronales. Enfin, nous avons mis en évidence une forte augmentation de l’expression ST6GAL2 au cours de la différentiation en neurones des cellules NT2/D1 sous l’action de l’acide rétinoïque, suggérant un rôle potentiel de cette enzyme au cours de la différentiation neuronale. / Sialylation is one of the last step of the biosynthesis of glycan chains carried by glycoproteins and glycolipids. The a2,6-sialylation of N-acetyllactosaminyl (Galß1-4GlcNAc) structures is commonly found at the end of glycan chains and is involved in numerous cell / cell or host / pathogen adhesion and recognition events. In Human, two sialyltransferases synthesise this glycan epitope, namely hST6Gal I and hST6Gal II. They differ from each other in substrate specificity an in tissue-specific pattern of expression. Whereas the gene encoding hST6Gal I, ST6GAL1, is expressed in almost all tissues, ST6GAL2 shows a narrower pattern of tissue expression essentially limited to fetal and adult brain. In addition, hST6Gal II exhibits similarities in terms of substrate specificity and gene expression pattern with the sialyltransferase identified in D. melanogaster and therefore, seems to have conserved ancestral properties required for brain function and growing nervous tissue. Several studies have shown that the expression of sialyltransferases is controlled at the transcriptional level by the use of specific promoters that regulate their expression in a tissue-specific fashion. Data about ST6GAL2 are rather limited; however, it appears the expression of this gene is finely regulated by mechanisms likely conserved through evolution. The aim of this thesis was to identify the 5’ non translated regions of the ST6GAL2 gene and to characterize the associated promoter regions. From a neuroblastoma cultured cell model, we identified by 5’RACE three types of transcripts which are different only in their first non-coding exon. Those exons, named EX, EY and EZ, are located more then 42 kbp upstream of the first common coding exon and are only separated by 124 and 87 bp, respectively. Using Taqman duplex Q-PCR technology we have shown that the transcripts initiated by EX and EY are predominantly expressed compared to EZ both in several cell lines and in human brain tissue samples. We also demonstrated that the hST6Gal II protein is expressed in the different lobes of the human cerebral cortex, the cerebellum and the hippocampus. We isolated different genomic sequences upstream EX and within EX/EY/EZ region and inserted them in a reporter vector for luciferase assays. We could define two promoter sequences upstream EX and ZY. PCR site-directed mutagenesis experiments along with bioinformatics analysis revealed that transcription factors NF-?B and NRSF are likely to act as transcription inhibitors, whereas the Sox5, SP1, Pura and Olf1 factors would be involved in the transcriptional activation of ST6GAL2. The NRSF, Sox5, Pura and Olf1 transcription factors are notably involved in the transcriptional regulation of genes related to neuronal functions and the neuronal development. Eventually, we have shown evidence of a strong increased ST6GAL2 expression during neuronal differentiation of the NT2/D1 cell line under acid retinoic treatment, suggesting of putative role this enzyme in neuronal differentiation.

La sialylation est une modification majeure des glycoprotéines et des glycolipides et est impliquée dans les processus cellulaires et moléculaires. La réaction de sialylation est catalysée par des sialyltransférases, un groupe de glycosyltransférases golgiennes utilisant un donneur de sucre activé sous forme de CMP-acide sialique. Ces enzymes, au nombre de 20 chez l’Homme, présentent des activités enzymatiques redondantes et ont une spécificité très fine vis-à-vis du substrat accepteur. Leur dérégulation conduit à des profils de sialylation altérés dans les situations pathologiques mais peu de choses sont connues quant à leur organisation fonctionnelle dans la cellule. Les techniques d’étude de la réaction de sialylation et des sialoglycoconjugués sont nombreuses mais présentent rarement la possibilité de suivre sélectivement les O- ou les N-glycannes. Dans ce contexte, j’ai produit différentes sialyltransférases recombinantes et solubles et j’ai mis au point de nouvelles stratégies d’étude de ces activités enzymatiques dans des essais in vitro et in cellulo basées sur l’utilisation d’un acide sialique non naturel : le CMP-SiaNAl. Ce dérivé d’acide sialique non naturel porteur d’un groupement N-alcyne sert de rapporteur chimique pour la détection et la visualisation des sialoglycoconjugués. Après avoir montré que ce substrat est utilisé avec la même affinité que le substrat naturel, j’ai développé de nouveaux outils permettant l’étude des sialyltransférases. En outre, j’ai pu apporter des éléments de compréhension quant à l’évolution moléculaire et fonctionnelle de cette ST6GAL1 chez les vertébrés, impliquant une évolution de son activité enzymatique chez les mammifères. / Sialylation is a major modification of glycoproteins and glycolipids and is involved in cellular and molecular processes. The sialylation reaction is catalyzed by sialyltransferases, a group of golgian glycosyltransferases using an activated sugar donor in the form of CMP-sialic acid. These enzymes, 20 in humans, have redundant enzymatic activities and have a very fine specificity towards the accepting substrate. Their deregulation leads to altered sialylation profiles in pathological situations but little is known about their functional organization in the cell. Techniques for studying the sialylation reaction and sialoglycoconjugates are numerous but rarely present the possibility of selectively monitoring O- or N-glycans. In this context, I have produced different recombinant and soluble sialyltransferases and developed new strategies for studying these enzymatic activities in in vitro and in cellulo assays based on the use of a non-natural sialic acid: CMP-SiaNAl. This unnatural sialic acid derivative carrying an N-alkyne group serves as a chemical reporter for the detection and visualization of sialoglycoconjugates. After having shown that this substrate is used with the same affinity as the natural substrate, I developed new tools allowing the study of sialyltransferases. In addition, I was able to provide elements of understanding as to the molecular and functional evolution of this ST6GAL1 in vertebrates, implying an evolution of its enzymatic activity in mammals.

Sialylation is catalyzed by sialyltransferases (STs) that adding sialic acids to the terminal positions of oligosaccharide of glycoproteins and glycolipids. This process is frequently enhanced in cancer and is associated with increased cancer metastasis. Recent studies demonstrated that over-expression of ST3Gal-I promotes mammary tumorigenesis. In our experiments, we also find overexpression of £\-2,3-ST in breast cancer cells. We previously synthesized a lithocholic acid-based ST inhibitor AL10 and demonstrated its anti-metastatic effect in vitro and in vivo. Our results showed that AL10 is an effective sialyltransferase inhibitor and exerts anti-metastatic effect in vivo via suppression of sialylation of beta1 integrin and CXCR4. Breast cancer cells expressing high level of chemokine receptors CXCR4 and CCR7 are prone to exhibit lymphatic metastasis because their cognate ligands CCL19, CCL21 and SDF-1 are continuously expressed by lymphatic endothelial cells. In this study, we demonstrate that AL10 can inhibit invasion, proliferation and induce anoikis of £\-2,3-ST-overexpressing MDA-MB231 human breast cancer cells. Our results indicate that inhibition of CCL19-induced invasion and CCL19-reduced anoikis by AL10 are associated with reduced sialylation of CCR7 and attenuated activation of the downstream signaling mediator ERK and p38. In addition, AL10 can inhibit proliferation by reducing activation of AKT via CCR7 sialylation independent pathway and p-38 via CCR7 sialylation dependent pathway which results in ubiquitin-dependent cyclin D1 degradation. Taken together, we conclude that sialylation of CCR7 is critical for CCL19-stimulated proliferation, invasion and anti-anoikis in breast cancer cells.

Sialyltransferases (STs), which catalyze the sialylation reaction by adding sialic acids to the terminal positions of oligosaccharide of glycoproteins and glycolipids, are over-expressed in cancer cells and associated with cancer metastasis. Until now, ST inhibitors are not applicable for clinical use because of poor cell permeability, although showing potent effect in vitro. In this study, we synthesize a lithocholic acid-based ST inhibitor AL10 and test its anti-metastatic effect. Overexpression of £\-2,3-ST is found in highly metastatic A549 and CL1-5 lung cancer cells. Confocal microscopy demonstrates that AL10 is cell permeable and may attenuate total sialylation on cell surface. AL10 has no cytotoxicity but inhibits adhesion, migration, actin polymerization and invasion of A549 and CL1-5 cells in vitro. Inhibition of adhesion and migration by AL10 is associated with reduced sialylation of beta1 integrin. In addition, activation of the beta1 integrin downstream signaling molecule focal adhesion kinase is also attenuated. More importantly, AL10 suppresses lung metastasis in vivo and this effect may be linked with reduced sialylation of the chemokine receptor CXCR4 which has been found to play a critical role in organ-specific metastasis. Serum biochemical assay indicates that AL10 does not affect liver and kidney functions of experimental animals. Taken together, we conclude that AL10 is an effective sialyltransferase inhibitor and exerts anti-metastatic effect in vivo via suppression of sialylation of beta1 integrin and CXCR4.

Le développement du muscle squelettique est un processus complexe très finement régulé, qui inclus des étapes de prolifération de cellules progénitrices appelées myoblastes et des étapes de différenciation pour former des myotubes multi nucléés. La glycosylation est la principale modification post-traductionnelle des protéines. Son rôle dans divers processus biologiques et pathologiques est largement documenté, mais les mécanismes intimes de son implication lors du processus myogénique restent mal élucidés. Nous avons pris comme modèle cellulaire la lignée myoblastique C2C12 car elle est capable de mimer in vitro les étapes de prolifération et de différenciation de la cellule musculaire. En utilisant différentes lectines, nous montrons un changement de la sialylation périphérique en α2-6 des glycoconjugués de surface de la cellule C2C12 durant la différenciation myoblastique. En complément, nous avons analysé les N-glycannes des glycoprotéines par spectrométrie de masse et mesuré les niveaux d’expression des gènes des α2-6 sialyl-transférases et neuraminidases. Tous les résultats obtenus confirment bien que la différenciation des cellules C2C12 est accompagnée d’une diminution du taux de sialylation des glycoconjugués. Pour mieux comprendre l’implication de la sialylation en α2-6 dans la myogenèse, nous avons réalisé une étude fonctionnelle sur des cellules C2C12 qui sous-expriment St6gal1 du fait de l’introduction d’un shRNA spécifique. Les clones obtenus présentent de plus forts index de fusion et génèrent un plus grand nombre de myotubes qui, de surcroit, sont de grande taille. Ce phénotype est probablement dû à un engagement accru des cellules de réserve en différenciation. En effet, les clones sous-exprimant St6gal1 contiennent une plus petite proportion de cellules Pax7+, c’est-à-dire de cellules de réserve maintenues dans un état de quiescence.Ainsi, nos résultats montrent l’importante implication de la sialylation périphérique en α2-6 au cours de la différenciation myogénique. / Skeletal muscle development is a complex process highly regulated and which includes proliferation then differentiation of progenitor cells or myoblasts into multi-nucleated myotubes. Glycosylation is the main post-translational modification of proteins. Its role in various biological and pathological processes is well documented, but the precise mechanisms of its involvement during myogenesis are still poorly understood.We have used the C2C12 myoblast as a model cell line since it is able to mimic in vitro the steps of muscle cell proliferation and differentiation. Using different lectins we showed a change in the peripheral α2-6 sialylation of the cell surface glycoconjugates, during C2C12 differentiation. Besides, we also analyzed by mass spectrometry the N-glycans carried by glycoproteins and measured the expression levels of α2-6 sialyl-transferases and neuraminidases genes. All the results confirm that C2C12 differentiation is accompanied by a decrease of glycoconjugates sialylation. To highlight the involvement of α2-6 sialylation in myogenesis, we performed a functional study of C2C12 cells knockdown for St6gal1 by a specific shRNA. The generated clones exhibit a higher fusion index and generate more elongated myotubes. This phenotype probably results from an increased commitment of reserve cell in differentiation. Indeed, the clones knockdown for St6gal1 contain a lower proportion of Pax7+ cells, i.e. of reserve cells maintained in a quiescent state. Thus, our results show the significant involvement of the peripheral α2-6 sialylation during myogenic differentiation.

Neuronal, cardiac, and skeletal muscle electrical signaling is achieved through the highly regulated activity of several types of voltage-gated ion channels to produce an action potential (AP). Voltage-gated potassium (Kv) channels are responsible for repolarization of the AP. Kv channels are uniquely and heavily glycosylated proteins. Previous reports indicate glycosylation modulates gating of some Kv channel isoforms; often, terminal sialic acid residues alter Kv channel gating. Here, we questioned whether alterations in glycosylation impact Kv channel gating, thus altering APs and cardiac excitability. ST3Gal-IV, a sialyltransferase expressed at uniform levels throughout the heart, adds sialic acids to N- and O-glycans through alpha 2-3 linkages. Electrocardiograms (ECGs) suggest that cardiac conduction/rhythm are altered in ST3Gal-IV(-/-) animals, which show an increased incidence of arrhythmic beats. AP waveform parameters and two components of IK, the transient outward, Ito, and the slowly inactivating, IK,slow, were compared in neonatal control versus ST3Gal-IV(-/-) and glycosidase treated atrial and ventricular myocytes. Action potential durations (APDs) measured from ST3Gal-IV(-/-) and glycosidase treated atrial myocytes were lengthened significantly (~25-150%) compared to control; however, ventricular APDs were unaffected by changes in glycosylation. Consistently, atrial Ito and IK,slow activation were shifted to more depolarized potentials (by ~9-17 mV) in ST3Gal-IV(-/-) and glycosidase treated myocytes, while ventricular K+ currents were unaltered. Those channels responsible for producing Ito and IK,slow were examined under conditions of full and reduced glycosylation. Sialylation and N-glycosylation uniquely and differently impact gating of two mammalian Shaker family Kv channel isoforms, Kv1.4 and Kv1.5; Kv1.4 gating was unaffected by changes in channel glycosylation, while N-linked sialic acids, acting through electrostatic mechanisms, fully account for glycan effects on Kv1.5 gating. In addition, sialic acids modulate the gating of three Kv channel isoforms that are not N-glycosylated, Kv2.1, Kv4.2, and Kv4.3, through apparent electrostatic mechanisms. Click chemistry was utilized to confirm that these three isoforms are O-glycosylated and sialylated; thus, O-linked sialylation modulates gating of Kv2.1, Kv4.2, and Kv4.3. This study suggests that regulated or aberrant glycosylation alters the gating of channels producing IK in a chamber-specific manner, thus altering the rate of cardiac repolarization and potentially leading to arrhythmias.

The production of recombinant glycoproteins from mammalian cell cultures requires robust processes that can achieve high protein yield while ensuring the efficacy of these proteins as human therapeutics. We describe two approaches currently being developed in our group to genetically engineer cell lines with desirable characteristics for recombinant protein production. To enhance the degree of sialylation in the glycoprotein product, we propose to increase intracellular sialic acid availability by overexpressing the CMP-sialic acid transporters. We are also interested in engineering mammalian cells that can proliferate at reduced cultivation temperatures. Low temperature cultivation of mammalian cells has been shown to enhance glycoprotein production but reduces cell growth. It is hypothesized that a mutant cell line that can proliferate at low temperatures may be coupled with low temperature cultivation to improve recombinant protein production. / Singapore-MIT Alliance (SMA)

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