Mass spectrometry (MS) is a power analytical tool which is capable of analyzing biomolecules in great detail, both structurally and quantitatively. With regards to glycans, special considerations regarding sample preparation are necessary in order to achieve reproducible identification and relative quantification of these analytes. A workflow for isolation at the glycopeptide level and subsequent detection at the glycan level with phenylhydrazine, demonstrated that monoclonal antibodies (mAbs) containing a specific amino acid mutation were able to express approximately an additional 50% of the α2,6 disialylated glycan compared to their non-mutant analogues. In a second experiment using mAbs, an azide modified glycan (Ac4ManAz) was introduced both metabolically and enzymatically during mAb production. This glycan is a precursor in the sialic acid pathway and the azide moiety allows for specific chemistry post-production including the potential for highly specific enrichment. The results of this workflow demonstrated that [100 μM] of Ac4ManAz precursor added to the cell media was necessary for metabolic expression. More complex samples however, may contain multiple sites of glycosylation. To conserve the site of attachment, these molecules are often studied at the glycopeptide level, and require enrichment of glycopeptides to improve the lower signal intensity observed in the presence of co-eluting peptides. Carboxymethyl chitosan (CMCH) as well as amine-functionalized magnetic-nanoparticles (MNP) were developed as novel materials for this purpose. CMCH is naturally occurring, and therefore is cost-effective and readily available. In a 12 protein mixture CMCH demonstrated the bulk enrichment of glycopeptides yielding an approximately 20% higher enrichment of sialylated species as compared to a commercially available glycopeptide kit through the use of tandem mass tags for relative quantification. In the same approach, amine functionalized MNP were produced and used to enrich glycopeptides from tryptic digests. This approach was fast (about 10 mins) and quantitatively demonstrated improved retention for sialylated species. Examples of these techniques and their applications are reported in this work. / October 2015

Sialylation is an important carbohydrate modification of glycoconjugates, which introduces sialic acids (SA). The relatively large nine-carbon, negatively charged sugars are typically located at the termini of carbohydrate chains. SA's are often required for functionally important molecular and cellular interactions including virus-host interactions, tumor progression and malignancy, immune system development and function, and nervous system development and function. However, the study of sialylation in vertebrates, including man, encounters serious obstacles associated with the complexity of vertebrates' biology and limitations of available experimental approaches. Drosophila is a useful model system with many advantages including quick generation time, a large number of progeny, simplified glycosylation and neurophysiology, and ease of genetic manipulations. The primary focus of this thesis is on the functions of Drosophila melanogaster CMP sialic acid synthetase (DmCSAS) and sialyltransferase (DSiaT) in the central nervous system (CNS). A combination of genetic, immunostaining, and neurobiology approaches were used to characterize the functions of DmCSAS and DSiaT in Drosophila. This investigation revealed the expression of DmCSAS and suggested that it plays an important role in a specialized and developmentally regulated process in the nervous system of Drosophila. Further experiments examined sub-cellular localization of DmCSAS revealing that this protein has a complex mostly Golgi-associated distribution within the cell in vivo. I discovered a novel link between Drosophila sialylation and circadian rhythm regulation. I also characterized the electrophysiological phenotypes of DmCSAS mutants and compared them to the corresponding defects associated with DSiaT mutations. My experiments also revealed that the relationship between DmCSAS and DSiaT are more complex than originally thought; these genes may have independent functions while also participating in the same pathway. Taken together, these results elucidate the sialylation pathway in Drosophila and shed more light on the role of sialylation in the nervous system. My experiments provide a unique evolutionary perspective on the sialylation pathway in animals and suggest that the neural function of SA in Drosophila can be conserved in vertebrates, including humans.

L'alpha-1 antitrypsine (A1AT) est un inhibiteur de sérine protéase sécrété principalement par le foie et libéré dans la circulation où sa concentration physiologique est de 1,5 à 3,5 g/L. La principale fonction de l'A1AT est d'inhiber l'activité de l'élastase des neutrophiles (NE) afin de maintenir l'équilibre protéase/anti-protéase dans les poumons. Son déficit (A1ATD) touche plus de 3,4 millions d'individus dans le monde chez qui l'élastase des neutrophiles décompose l'élastine, provoquant ainsi une diminution de l'élasticité du poumon ainsi qu'une dégradation de son tissu conjonctif. En conséquence, l'A1ATD entraîne des troubles respiratoires tels que l'emphysème ou la maladie pulmonaire obstructive chronique et ceux qui en sont atteints nécessitent des injections fréquentes d'A1AT purifiée à partir du sang d'un donneur. Cependant, l'A1AT plasmatique est hétérogène dans son état de glycosylation et sa qualité varie d'un lot à l'autre. De plus, il y a un risque, même très faible, de transmission d'agents pathogènes avec l'administration d'A1AT purifiée par plasma. Par conséquent, il existe un besoin pour une version recombinante. La glycoprotéine mature possède trois sites de N-glycosylation comprenant principalement des structures de type complexe bi-antennaires afucosylées et α-2,6-di-sialylées, A2G2S2 (6,6). Bien que la glycosylation ne soit pas essentielle à l'activité inhibitrice de l'A1AT, il a été démontré qu'elle a un impact significatif sur sa demi-vie in vivo. Notamment, l'acide sialique, un monosaccharide terminal chargé négativement présent sur les N-glycanes, aide à prolonger la demi-vie de l'A1AT dans le sérum en empêchant l'interaction entre l'avant-dernier galactose (Gal) du N-glycane et les récepteurs hépatiques des asialoglycoprotéines (ASGPRs), composés de deux sous-unités appelées lectines hépatiques (HL) 1 et 2, qui se lient aux glycoprotéines asialylées contenant un Gal terminal et conduisent à leur dégradation. Par conséquent, il est important de produire A1AT dans un système d'expression qui peut effectuer les modifications post-traductionnelles (PTM) appropriées à des fins thérapeutiques. Jusqu'à présent, la production d'A1AT recombinante (rA1AT) a été tentée dans différents systèmes d'expression cellulaire avec un succès limité. Malgré la disponibilité de diverses lignées cellulaires, les cellules ovariennes de hamster chinois (CHO) ont été largement utilisées pour la production de glycoprotéines thérapeutiques car ces cellules sont compatibles avec des stratégies de glyco-ingénierie pour produire des glycoprotéines recombinantes composées de glycanes de type humain. Cependant, ces cellules synthétisent des N-glycanes de type complexe comprenant de la fucosylation centrale et de l'acide sialique lié en α-2,3. Par conséquent, dans ce projet, l'objectif était de développer une version recombinante d'A1AT avec un profil de glycosylation humaine exprimée en cellules CHO modifiées et qui se prête à des utilisations thérapeutiques. À cette fin, dans notre étude, nous avons d'abord empêché l'α-2,3 sialylation ainsi que la fucosylation centrale en éliminant les gènes responsables via la technologie CRISPR/Cas9, suivie de la surexpression de l'α-2,6‐sialyltransférase humaine à l'aide d'un système d'expression inductible au cumate. Nous avons ensuite montré la supériorité du promoteur inductible CR5 pour l’expression de A1AT par rapport à cinq promoteurs constitutifs forts couramment utilisés dans l'industrie. En utilisant le promoteur CR5, nous avons généré des populations de CHO stables modifiées par glyco-ingénierie produisant plus de 2,1 g/L pour la forme native et 2,8 g/L pour la version mutée d'A1AT avec des N-glycanes analogues au produit clinique dérivé du plasma, la Prolastin-C. L'effet bénéfique de la supplémentation en N‐acétylmannosamine du milieu de culture cellulaire sur la glycosylation de l'A1AT a également été démontré. Enfin, nous avons montré que l'activité anti‐élastase des rA1ATs est comparable à celle de la Prolastin-C, et que la substitution des résidus méthionines critiques par des valines rendait A1AT significativement plus résistante à l'oxydation. Nous avons ensuite étudié l'impact de la glycosylation d'A1AT sur son interaction avec les orthologues d'ASGPR. Pour cela, nous avons initialement utilisé un test d'internalisation cellulaire basé sur la lignée cellulaire hépatique humaine HepG2 connue pour exprimer les ASGPRs à sa surface et avons examiné leur interaction avec les rA1ATs possédant divers profils de glycosylation. Comme le test d'internalisation basé sur les cellules HepG2 a démontré un faible rapport signal sur bruit (SNR) ainsi qu'un niveau élevé de signal de fond d'internalisation, nous avons cherché à développer un nouveau test basé sur des cellules CHO surexprimant des orthologues ASGPR recombinants. Alors que la sous-unité HL-1 humaine seule était suffisante pour lier et internaliser l'A1AT asialylée, les sous-unités HL-1 et HL-2 étaient nécessaires pour former des récepteurs fonctionnels et ayant une forte affinité pour les ASGPR de rat et de souris. Afin d'améliorer le SNR de notre test cellulaire d'internalisation, le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été utilisé pour enrichir les populations de cellules CHO pour celles exprimant des niveaux élevés d'orthologues ASGPR. Enfin, en utilisant des structures de glycanes remodelés par voie enzymatique de Prolastin-C, nous n'avons observé aucune internalisation lorsque les glycanes sont terminés avec α-2,6-Neu5Ac ni α-2,8-Neu5Ac-α-2,6-Neu5Ac par l’ASGPR de l'humain, du rat et de la souris. D'autre part, l'absorption de Prolastin-C portant des glycanes bi-antennaires avec une branche terminée par de l'acide sialique α-2,3 et l'autre par du galactose terminal, par l'ASGPR de souris a été statistiquement plus élevée que celle de l'humain et du rat. En somme, l'A1AT recombinante résistante à l'oxydation décrite dans ce projet pourrait représenter un meilleur médicament biothérapeutique tout en offrant une alternative sûre et plus stable pour la thérapie d'augmentation. Nous avons également contribué à une meilleure compréhension de l'impact de la sialylation de l'A1AT sur son internalisation cellulaire par les orthologues ASGPR. / Alpha-1 antitrypsin (A1AT) is a serine protease inhibitor secreted primarily by the liver, and released in the circulation where its physiological concentration is 1.5-3.5 g/L. The main physiological function of A1AT is to inhibit the activity of neutrophil elastase (NE) to maintain the protease/anti-protease balance in the lung. The A1AT deficiency (A1ATD) is affecting more than 3.4 million individuals worldwide where neutrophil elastase breaks down elastin, thereby causing a decrease in the elasticity of the lung as well as a degradation of its connective tissue. As a result, A1ATD leads to respiratory disorders such as emphysema or chronic obstructive pulmonary disease. Treatment of this health condition requires frequent injections of A1AT purified from donor blood. However, plasma A1AT is heterogeneous in its glycosylation state and its quality varies from batch to batch. Moreover, there is a risk, however very low, of pathogen transmittance with plasma-purified A1AT administration. Therefore, there is a need for recombinant version. The mature glycoprotein has three N-glycosylation sites possessing mostly afucosylated, α-2,6-di-sialylated bi-antennary complex-type structures, A2G2S2 (6,6). Though glycosylation is not essential for A1AT's inhibitory activity, it has been shown to have a significant impact on its in vivo half-life. Notably, sialic acid, a terminal negatively charged monosaccharide present on N-glycans, helps to prolong the half-life of A1AT in serum by preventing the interaction between the penultimate galactose (Gal) of the N-glycan and the hepatic asialoglycoprotein receptors (ASGPRs), composed of two subunits termed hepatic lectin (HL) 1 and 2, which bind to asialylated glycoproteins containing terminal Gal and lead to their degradation. To this extend, it is important to produce A1AT in an expression system that can carry out the appropriate post-translational modifications (PTMs) for therapeutic purposes. Thus far, the production of recombinant A1AT (rA1AT) has been attempted in different cell expression systems with limited success. Despite the availability of various cell lines, Chinese hamster ovary (CHO) cells have been widely used to produce therapeutic glycoproteins as these cells can tolerate glycoengineering strategies to produce recombinant glycoproteins with human-like glycans. However, these cells synthesize complex-type N-glycans with core-fucosylation along with α-2,3-linked sialic acid. Therefore, in this research project, the aim was to develop a recombinant version of A1AT with human glycosylation pattern expressed in genetically engineered CHO cells that would be amenable to therapeutic uses. To this end, in our study, we first prevented α-2,3 sialylation as well as core-fucosylation by eliminating the corresponding genes via CRISPR/Cas9 technology, followed by overexpressed human α-2,6‐sialyltransferase using a cumate‐inducible CHO expression system. We then showed superiority of the CR5 inducible promoter compared to five strong constitutive promoters commonly used in the industry. Using the CR5 promoter, we generated glycoengineered stable CHO pools producing over 2.1 g/L of the wild-type and 2.8 g/L of the mutein forms of A1AT, with N‐glycans analogous to the plasma‐derived clinical product, Prolastin-C. The effect of N‐acetylmannosamine supplementation to the cell culture media on the A1AT glycosylation was also demonstrated. Finally, we showed that the anti‐elastase activity of rA1ATs is comparable to that of Prolastin-C, and that substitution of critical methionine residues with valines rendered A1AT significantly more resistant to oxidation. We then studied the impact of A1AT glycosylation on its interaction with ASGPR orthologs. For this, we initially used a cell-based internalization assay based on the human HepG2 hepatic cell line known to express ASGPRs at its surface and examined their interaction with rA1ATs possessing various glycosylation profiles. As HepG2 cell-based internalization assay demonstrated poor signal-to-noise ratio (SNR) as well as high level of background internalization signal, we then aimed at developing a new assay based on CHO cells overexpressing recombinant ASGPRs orthologs. While human HL-1 subunit alone was sufficient to bind and internalize asialylated A1AT, both HL-1 and HL-2 subunits were required to form functional and high affinity receptors for the rat and mouse ASGPRs. To enhance SNR of our cell-based uptake assay, fluorescence-activated cell sorting (FACS) was used to enrich the CHO pools for cells expressing high levels of ASGPR orthologs. Finally, using enzymatically remodelled glycan structures of Prolastin-C, we observed no uptake when glycans are terminated with α-2,6-Neu5Ac nor α-2,8-Neu5Ac-α-2,6-Neu5Ac by human, rat, and mouse ASGPR orthologs. On the other hand, the uptake of Prolastin-C bearing bi-antennary glycans with one branch terminated with α-2,3 sialic acid and the other with terminal galactose, by mouse ASGPR was observed to be statistically higher than that by human and rat ASGPR orthologs. Collectively, the oxidation-resistant recombinant A1AT described in this project could represent a viable biobetter drug while offering a safe and more stable alternative for augmentation therapy. We also contributed a better understanding of the impact of A1AT sialylation on its cellular uptake by ASGPR orthologs.

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