Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Grandes avanços no desenvolvimento de metodologias laboratoriais para a investigação de vírus respiratórios tem ocorrido nos últimos anos. No primeiro experimento, mostramos que as técnicas de RT-PCR, "shell vial" e isolamento viral em cultura de células obtiveram limites de detecção de Influenza A e B comparáveis, mas todos os testes rápidos comerciais avaliados tiveram baixo desempenho. Em segundo experimento, foram comparadas diferentes técnicas para a detecção de vírus respiratórios em 412 amostras de lavado nasal coletados de adultos com infecção respiratória aguda (2001-¬2003). As técnicas de RT-PCR e imunofluorescência direta (IFD) foram comparadas com 0 isolamento de Influenza A e B em cultura de células. A concordância geral entre os três ensaios foi de 96 por cento, sendo a sensibilidade obtida para a RT-PCR de 92,3 por cento e a especificidade de 98,5 por cento e para a IFD os valores de 93,6 por cento e 97,2 por cento, respectivamente. Para a detecção de Adenovírus foram comparados os testes de PCR, nested-PCR e IFD, sendo obtida positividade (4,1 por cento) somente na nested-PCR. Amostras negativas nos ensaios anteriores foram submetidas a detecção de Metapneumovirus humano por imunofluorescência indireta (IFI) em comparação com a RT-PCR e demonstrou sensibilidade de 45 por cento. Os ensaios de IFD e RT-PCR demonstraram boa ap1icação na rotina diagnóstica de Influenza, mas os testes rápidos devem ser aplicados com cautela. Para a detecção de Adenovírus e Metapneumovirus humano os ensaios de imunofluorescência obtiveram baixos desempenhos, devendo ser aplicado as metodologias moleculares para esse vírus / Laboratory tests performance for respiratory viruses has shown substantial increase in the past years. A first step experiment for comparison of influenza virus limit of detection resulted in similar values for RT-PCR, shell vial and cell cultures methods, but worse values for all commercial rapid antigen detections kits evaluated with same control strains. In a second step, 412 nasal washes from adults presenting with acute respiratory symptoms (2001-2003) were submitted to comparative studies for respiratory viruses detection. A duplex RT-PCR and direct immunofluorescence (DFA) assays were compared to Influenza A and B virus isolation (reference method) in MDCK cells. The overall concordance between the three assays was 96%. RT-PCR reached 92.3% sensitivity and 98.5% specificity and for DFA the corresponding values were 93.6% and 97.2%, respectively. A PCR, nested-PCR, and DFA assays were evaluated for detection of Adenovirus and positivity (4.1%) were only obtained on Nested-PCR. Selected negative samples were evaluated for human Metapneumovirus by indirect fluorescence assay (IFA) in comparison with RT-PCR and sensitivity was 45%. DFA and RT-PCR could be applied in different routine sets for influenza diagnosis and rapid antigen detection kits may be used with caution. For Adenovirus and Metapneumovirus fluorescence assays detection were disappointed and molecular tests are recommended for these viruses. / FAPESP: 01/125796 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Reproduction de : Thèse d'exercice : Pharmacie : Nantes : 2008. / Bibliogr.

Th. 3e cycle--Chim. struct.--Pau, 1977. N°: 64.

Made available in DSpace on 2014-05-29T12:22:16Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 69454.pdf: 3220079 bytes, checksum: ad1e72dadcd293d4a32a15873a7c32bc (MD5) 69454.pdf.txt: 173452 bytes, checksum: 865484e8785a1ef6e4df76199b7a28d1 (MD5) 69454.pdf.jpg: 1493 bytes, checksum: f82ee0049dd9c66b2a3810a63085821e (MD5) Previous issue date: 2014-05-07 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os vírus influenza são a causa mais frequente de doença respiratória aguda com necessidade de intervenção médica afetando indivíduos de todas as faixas etárias. O subtipo A(H3N2) tem sido dominante em epidemias sazonais de influenza desde 1968. Estudos anteriores sugerem que a dinâmica evolutiva do influenza A(H3N2) é modelada pela interação complexa entre elevadas taxas de mutação viral, os rearranjos gênicos, a seleção exercida pelo sistema imune, e o fluxo de migração populacional dentro e entre distintas regiões do mundo. No Brasil, o conhecimento da epidemiologia e evolução dos vírus influenza ainda é incipiente. Nosso objetivo, portanto, foi estudar a evolução do vírus influenza A(H3N2) no Brasil a fim de verificar o papel do País no cenário global de dispersão do vírus, reconstruir o perfil de migração viral nas diferentes regiões e verificar a compatibilidade da vacina com as cepas virais circulantes no período compreendido neste estudo. Para isso, fizemos análises de distâncias genéticas assim como análises evolutivas e filogeográficas da porção HA1 do gene hemaglutinina (HA) de amostras de influenza A(H3N2) coletadas nas regiões Sudeste, Sul e Nordeste do Brasil entre 1999-2012, comparando-as com sequências de cepas vacinais e de sequências de outras regiões geográficas representativas de cada continente, para o mesmo período Observamos que a composição da vacina não foi a mais adequada para sete dos 14 anos avaliados e que poucas mutações em resíduos de aminoácidos localizados nos sítios antigênicos da HA podem dar origem a novas cepas antigenicamente distintas num relativo curto período de tempo. A taxa média de evolução da porção HA1 do gene HA influenza A(H3N2) foi estimada em 5,1x10-3 subst./sítio/ano. As análises filogenéticas e filogeográficas das sequências de influenza A(H3N2) indicaram uma forte estrutura temporal e uma menor, porém significativa, estrutura geográfica. Verificamos que o Brasil desempenha um papel marginal na emergência e disseminação de novas variantes no nível global. As principais fontes de disseminação do vírus influenza A(H3N2) para o Brasil são outros países das Américas sendo que a principal porta de entrada no País é a região Sudeste. Dentro do Brasil, o maior fluxo parece acontecer entre as regiões Sudeste e Sul, e em menor escala, entre as Regiões Sul e Nordeste / The influenza virus is the most frequent cause of acute respiratory illness requiring medical intervention, affecting individuals from all age groups. The viral subtype A(H3N2) has been dominant in most seasonal influenza epidemics since 1968. Previous research suggests that the evolutionary dynamics of influenza A(H3N2) is characterised by a complex interaction between the high viral mutation rate, gene rearrangements, selection exerted by the immune system and the migration flow of populations within and between different regions of the world. In Brazil, knowledge of influenza virus epidemiology and evolution is still incipient. Thus, our objective was to investigate the evolution of influenza A(H3N2) in Brazil in order to verify the role of the country in the global spread of the virus, to reconstruct the profile of viral migration in different regions of Brazil and check the compatibility between the vaccine and the virus strains circulating in the country during the period of this study. Sequences of the HA1 portion of the hemagglutinin (HA) gene from strains collected in the Northeast, Southeast and South of Brazil between 1999 to 2012, were compared with sequences of vaccine strains and sequences from other geographical regions and subjected to genetic distance, evolutionary and phylogeographic analyses. Our analysis showed that the vaccine composition was not the most suitable for seven of the 14 years evaluated and that a few mutations in amino acid residues located in the antigenic sites of HA are able to give rise to new variants in a relatively short period of time. The evolution rate of the HA1 portion of the HA gene of influenza A(H3N2) was estimated at 5.1 x10-3 subst./site/year. The phylogenetic and phylogeographic analysis of influenza A(H3N2) showed a strong temporal structure and a minor, however significant geographical structure. The reconstruction of the worldwide dissemination dynamic of influenza A(H3N2) allows us to verify that Brazil has a marginal role in the emergence and dissemination of new viral variants at a global scale. Brazil was tightly connected to other American countries and the major entrance of influenza A(H3N2) in Brazil seems to be by the Southeast region. Within Brazil, the major flux of transmission appears to be from the Southeast to the South and to a less extent from the South to the Northeast.

La fusion membranaire est une étape essentielle du cycle infectieux du virus Influenza dont la compréhension est actuellement incomplète. La fusion nécessite la protéine de surface virale hémagglutinine et, en particulier, ses vingt acides aminés N-terminaux formant le peptide de fusion. Ce peptide a été démontré capable d’initier la fusion membranaire même lorsque séparé du reste de la protéine, mais le mécanisme moléculaire par lequel il y parvient reste méconnu. Afin de mieux comprendre ce mécanisme, nous avons effectué des simulations de dynamique moléculaire du peptide de fusion, du mutant fusogène F9A et du mutant non fusogène W14A, dans des membranes modèles. Dans un premier temps, nous avons étudié la structure et la dynamique du peptide de fusion. Le peptide de fusion a adopté des conformations en hélice-a complète et en coude, et s’est positionné à l’interface membranaire presque parallèlement à la surface de la membrane. Les peptides mutants ont en plus adopté une structure en épingle. La dynamique des peptides a donc été associée à celle d’un V flexible, changeant de conformation par des mouvements de charnière. Dans un second temps, les perturbations membranaires induites par les peptides ont été étudiées par simulations. Ces perturbations incluent la protrusion des chaînes lipidiques et l’intrusion des têtes polaires. Ces deux perturbations ont été causées par des ponts hydrogène entre les phosphates lipidiques et les amides N-terminales des peptides s’insérant sous la surface de la membrane. La quantité d’intrusion des têtes polaires induite par les mutants en simulation était corrélée à leur activité fusogène expérimentale et à la profondeur d’insertion de leur extrémité N-terminale. Suivant ces résultats, nous proposons que l’intrusion des têtes polaires complémente la protrusion des chaînes lipidiques lors de la fusion membranaire en réduisant les forces répulsives entre les têtes polaires des membranes juxtaposées. Ce mécanisme modèle de fusion membranaire pourra avoir un impact sur les futures recherches d’antiviraux contre Influenza. / Membrane fusion is an essential step of the Influenza virus infectious cycle whose understanding remains incomplete. Fusion requires surface viral protein hemagglutinin and, in particular, its twenty N-terminal amino acids composing the fusion peptide. This peptide was shown to initiate fusion even when isolated from the rest of the protein, but the molecular mechanism by which it achieves membrane fusion is still misunderstood. To better understand this mechanism, we performed molecular dynamics simulations of the fusion peptide, fusogenic F9A mutant and nonfusogenic W14A mutant, in model membranes. First, we studied the structure and dynamics of the fusion peptide. The fusion peptide adopted straight a-helical and kinked conformations, and inserted at the membrane interface with an almost parallel orientation with the membrane surface. Mutant peptides additionaly adopted a hairpin structure. The dynamics of the peptides was hence compared to that of a flexible V, switching conformation by hinge movements. In a second step, fusion peptide-induced membrane perturbations were studied from simulations. Those perturbations include lipid tail protrusion and polar head intrusion. The two perturbations were caused by hydrogen bonding between lipid phosphates and membrane inserted peptide N-terminal amides. The amount of polar head intrusion induced by the mutant peptides in simulations was correlated to their experimental fusogenic activity and the insertion depth of their N-termini. Following those results, we propose that polar head intrusion would complement lipid tail protrusion during membrane fusion by reducing the repulsive forces between juxtaposed membranes polar heads. This model of membrane fusion mechanism may have an impact on future Influenza antiviral research.

Les infections à virus influenza demeurent un problème de santé majeur dans le monde entier. Une nouvelle classe d'agent anti-influenza servant au traitement et à la prévention a été développée, soit les inhibiteurs de neuraminidase. L'objectif premier de ce projet de maîtrise était de générer différents variants du virus influenza A/WSN/33 (HlNl) résistants au peramivir et au zanamivir. En second lieu, nous avons étudié l'effet de certaines mutations du gène NA, en utilisant des protéines NA recombinantes, quant à leur degré de susceptibilité face à différents inhibiteurs de neuraminidase. La virulence d'un virus A/WSN/33 généré par génétique inverse contenant les mutations H274Y et N294S dans le gène NA, a été étudiée dans un modèle murin Balb/c. Nous avons également caractérisé des virus A/H3N2 isolés d'un enfant immunosupprimé traité avec trois antiviraux (oseltamivir, amantadine et zanamivir). / Influenza infections remain a major health problem Worldwide. For the treatment and prevention of influenza infections, a new class of anti-influenza agents, the neuraminidase inhibitors (NAIs), has been developed. The objectives of this master project were firstly the in vitro generation of peramivir and zanamivir-resistant variants. Secondly, we have studied the effect of selected NA mutations on the susceptibility profiles to different NAIs using recombinant NA proteins. We have also investigated the virulence of reverse genetics-rescued A/WSN/33 viruses harboring H274Y and N294S NA mutations in a Balb/c model. Finally, we studied influenza A/H3N2 viruses isolated from an immunocompromised child who was treated with three antivirals (oseltamivir, amantadine and zanamivir).

Les virus influenza de type A sont des pathogènes respiratoires causant des épidémies saisonnières et des pandémies de manière plus occasionnelles. Au cours d’une saison, 10 à 20 % de la population mondiale est touchée, ce qui constitue un problème majeur de santé publique. Les virus de sous-type A/H3N2 sont associés à une plus forte morbidité et mortalité que les virus de sous-type A/H1N1. La vaccination reste le moyen le plus efficace de contrôler les infections, cependant l’efficacité de ces vaccins est de courte durée et compromise en cas de non-appariemment entre les souches circulantes et vaccinales. La première partie de cette thèse a été consacrée à l’optimisation des vaccins inactivés A/H3N2 en testant de nouveaux adjuvants et de nouvelles voies d’administration chez la souris et le furet. Nous avons démontré que l’adjuvant AS25 semble prometteur pour le développement de vaccins plus efficaces. La seconde partie de cette thèse a été consacrée à suivre l’évolution moléculaire et antigénique des souches A/H3N2 circulantes au Québec entre 2009 et 2011. Notre conclusion est qu’il n’y a pas que le nombre de mutations dans la HA qui est important, en ce sens que la nature et la localisation de ces dernières jouent un rôle clé lors d’une dérive antigénique. Après avoir suivi les souches A/H3N2 sous pression immunitaire, nous avons suivi dans la troisième partie de cette thèse une souche A/H3N2 sous pression d’un nouvel antiviral; le laninamivir. Les antiviraux sont la première ligne de défense en cas de pandémie ou lors d’une épidémie lorsqu’il y a un mésappariemment entre les souches circulante et vaccinale. Notre conclusion est que la réplication de notre mutant est conservé in vitro mais non in vivo. Les différentes expériences effectuées au cours de cette thèse ont permis de suivre l’évolution des souches A/H3N2 et de mettre en œuvre de nouveaux moyens de prévention et de traitement. / Influenza are respiratory pathogens responsible for seasonal epidemics and more occasionnally pandemics. During a season, 10 to 20 % of the global population is infected, which is a major public health problem. A/H3N2 viruses are associated with greater morbidity and mortality than A/H1N1 viruses. Vaccination remains the most effective way to control infections; however the effectiveness of these vaccines is short-lived and compromised in the event of a mismatch between circulating and vaccine strains. The first part of this thesis was devoted to the optimization of inactivated A/H3N2 vaccines by testing new adjuvants and routes of administration in mice and ferrets. It was shown that the adjuvant AS25 looks promising for the development of more effective vaccines. The second part of this thesis was devoted to the characterization of the molecular and antigenic evolution of A/H3N2 strains circulating in Quebec between 2009 and 2011. Our conclusion is that not only the number of mutations in the HA gene is important, but the nature and location of such mutations also play a key role in the antigenic drift. After characterizing the A/H3N2 strains under immune selection, we followed, in the third part of this thesis, an A/H3N2 strain under pressure with a new antiviral, laninamivir. Antivirals are the first line of defense in a pandemic or during an outbreak when there is a mismatch between circulating and vaccine strains. Our conclusion is that the viral fitness of our mutant strain is conserved in vitro but not in vivo. The different experiments done in this thesis have permitted to characterize the evolution of A/H3N2 strains and new ways of preventing or treating such infections.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / Les virus de l'influenza infectent de 5 à 10 % des adultes et 20 à 30 % des enfants chaque année, causant des centaines de milliers de décès. Le traitement antiviral basé sur les inhibiteurs de la neuraminidase ou de la polymérase virale joue un rôle important dans la prise en charge des infections grippales sévères. Cependant, l'émergence de la résistance à ces médicaments et le développement d'une réponse inflammatoire incontrôlée constituent présentement des limites majeures dans le traitement et le contrôle de la grippe grave. Les solutions proposées à ce problème consistent à utiliser : un antiviral pour lequel un virus spécifique est sensible, des combinaisons d'antiviraux possédant différents mécanismes d'actions et des combinaisons entre un antiviral et un médicament anti-inflammatoire. Puisque l'utilisation des traitements actuels ne semble pas être généralement optimale pour soigner les patients atteints d'une infection grippale sévère, d'autres voies doivent être explorées. Les immunomodulateurs sont de plus en plus envisagés pour ce genre de situation parce qu'ils modifient la réponse immunitaire de l'organisme sans majorer le risque infectieux. Les protectines PD1 et PDX, qui font partie d'une famille de médiateurs lipidiques pro-résolvants, ont déjà démontré une activité antivirale ainsi que des propriétés anti-inflammatoires dans divers contextes cliniques. Ici, une série d'analogues de PDX ont été synthétisé dans le but d'isoler un isomère ayant les activités recherchées et compatibles avec les antiviraux utilisés. Dans ce mémoire, nous caractérisons l'effet d'un analogue de PDX (AN-137B) qui s'est démarqué par son activité antivirale contre le virus de l'influenza A. Ce stéréoisomère a démontré de la synergie lorsque combiné avec l'oseltamivir et un effet additif en combinaison avec le baloxavir en plus d'une activité anti-inflammatoire intéressante. / Influenza viruses infect 5 to 10% of adults and 20 to 30% of children each year, causing hundreds of thousands of deaths worldwide. Antiviral therapy based on neuraminidase or viral polymerase inhibitors plays an important role in the management of severe influenza infections. However, the emergence of resistance to these drugs and the development of an uncontrolled inflammatory response currently constitute major limitations in the treatment and control of severe influenza. Current approaches for this problem consist of treatment with another antiviral to which a specific virus is susceptible, combinations of antivirals with different mechanisms of action and combinations of an antiviral with an anti-inflammatory drug. Since the use of current treatments does not seem to be generally convincing for treating patients with severe influenza virus infection, other avenues must be explored. Immunomodulators are increasingly being considered for this type of therapy because they modify the body's immune response without increasing the risk of infection. The protectins PD1 and PDX, part of a family of pro-resolving mediators, have previously demonstrated antiviral activity as well as anti-inflammatory properties in various clinical settings. Here, a series of PDX analogs was synthesized with the aim of isolating an isomer with the desired increased activities and compatible with the existing antivirals. In this dissertation, we characterize the effect of a compound that stood out for its antiviral activity against the influenza A virus. This stereoisomer of PDX demonstrated synergy when combined with oseltamivir and addition in combination with baloxavir in addition to interesting anti-inflammatory activity.

Les virus influenza sont des pathogènes respiratoires responsables d’épidémies saisonnières touchant 10 à 20% de la population mondiale chaque année, constituant donc un problème majeur de santé publique. La vaccination annuelle réduit l’impact des épidémies grippales; cependant, un mésappariement entre les souches vaccinales et circulantes peut parfois survenir et résulter en un échec de protection de la population. Dans ces cas, il est important d’avoir un traitement adéquat afin de traiter l’infection virale. Les inhibiteurs de la neuraminidase (INAs) constituent la principale classe d’antiviraux recommandée pour la prévention et le traitement des infections grippales. Les INAs lient de façon compétitive le site actif de la neuraminidase (NA), ce qui bloque la libération des virions des cellules hôtes inhibant de la sorte la dissémination du virus dans le tractus respiratoire. L’émergence sporadique de virus résistants à l’oseltamivir et/ou au zanamivir avec de faibles taux de transmission a été identifiée lors de traitements des souches saisonnières de l’influenza. Le développement de nouveaux antiviraux devient donc un sujet important d’investigation. Le peramivir, un nouvel INA disponible depuis peu en Amérique du Nord, exerce une activité sur des virus influenza A et B et son efficacité contre des mutants résistants à l’oseltamivir ou au zanamivir n’a pas encore été complètement caractérisée. À cause des différences dans la liaison des INAs avec l’enzyme cible, la nature des mutations de résistance peut varier d’un INA à l’autre bien que certaines mutations pourraient engendrer une résistance croisée à plusieurs INAs. Nous avons démontré que le peramivir s’avère très actif contre les différents sous-types de grippe saisonnière, quoique certains variants aient présentés des phénotypes de multi-résistance à l’oseltamivir, au zanamivir ainsi qu’au peramivir. À cet égard, un nouveau mécanisme de résistance d’un variant menant à la résistance croisée aux INAs a été décrit (I427T/Q313R) dans le cadre de ce mémoire et a permis de comprendre comment des substitutions retrouvées hors du site actif de la NA peuvent affecter la capacité de réplication du virus et sa résistance aux antiviraux. / Influenza viruses are respiratory pathogens responsible for seasonal epidemics affecting 10 to 20% of the world's population every year, thus constituting a major public health impact. Annual vaccination reduces the impact of influenza epidemics; however, a mismatch between the vaccine strain and the circulating strain can sometimes occur and result in an unsuccessful attempt in protecting the population. In such cases, it is important to have adequate treatment to treat influenza infections. Neuraminidase inhibitors (NAIs) are the primary class of antiviral agents recommended for the prevention and treatment of influenza infections. NAIs competitively bind the neuraminidase (NA) active site, blocking the release of virions from host cells and thereby inhibiting the spread of the virus into the respiratory tract. The sporadic emergence of oseltamivir- and/or zanamivir-resistant viruses with low transmission rates was identified in seasonal influenza strains. The development of new antivirals thus became an important subject of investigation. Peramivir, a new NAI recently available in North America, exerts its activity against influenza A and B viruses, but its effectiveness against mutations conferring resistance to oseltamivir or zanamivir has not yet been fully characterized. Due to differences in the binding of NAIs to the target enzyme, the nature of the resistance mutations may vary from one NAI to another, although some mutations could induce global NAI cross-resistance. We have demonstrated that peramivir is highly active against the different seasonal influenza subtypes, although some variants have shown multi-resistance phenotypes to oseltamivir, zanamivir as well as peramivir. In this regard, a new resistance mechanism by which a NA variant leads to NAI cross-resistance (I427T/Q313R) has been described in this thesis and has helped to understand how substitutions found outside the NA active site can affect the replication kinetics of the virus and its resistance to antivirals.

Dans ce mémoire, les capacités réplicatives de virus saisonniers de sous-types N H1N1 et A/H3N2 résistants à l'oseltamivir ont été étudiées au moyen d'expériences in vitro simples et de modélisation mathématique. Pour la souche A/Brisbane/ 59/2007 (H1N1) nous avons démontré que la mutation H274Y de la neuraminidase (NA), responsable de la majorité des cas de résistance à l'oseltamivir, cause une augmentation de la latence d'environ 7 h comparé à seulement 1 à 3 h pour le virus sauvage. Cette latence augmentée est compensée par une infectivité augmentée d'environ 12 fois par rapport au virus sauvage. Ces résultats, obtenus à l'aide d'un modèle mathématique, fournissent une explication sur la dissémination de la mutation H274Y dans les souches saisonnières de virus A/ H1N1 depuis 2007-2008. Nous avons aussi étudié les capacités réplicatives in vitro pour des souches A/California/7/2004 (H3N2) résistantes à l'oseltamivir isolées d'un patient immunosupprimé. La perte de capacité réplicative causée par le simple mutant E119V est partiellement compensée chez le double mutant E119V-I222V La croissance du double mutant E119V-I222V en milieu liquide est similaire à celle du virus sauvage alors que le simple mutant accuse un retard de croissance d'environ 12 h. Les tailles des plages de lyses en milieu semi-solide sont systématiquement plus petites pour le simple mutant E119V et plus grosses pour le double mutant E119V-I222V L'effet cytopathique commence entre 24 et 36 h pour le virus sauvage et le double mutant mais seulement à 48 h pour le simple mutant. Finalement, l'activité enzymatique de la NA du double mutant (ratio Vmax : 0,51 par rapport à la souche sauvage) est augmentée de 47% comparé à celle du simple mutant (ratio Vmax : 0,04).