Les cellules souches embryonnaires humaines (hESC) représentent un nouvel outilbiologique au potentiel prometteur pour l’amélioration de la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de maladies monogéniques. Cette application est dans un premier temps devenue possible grâce à l’utilisation de lignées de cellules souches embryonnaires humaines porteuses de mutation causale de pathologie, obtenues au cours d’un diagnostique pré-implantatoire. Mon travail de thèse s’est inscrit dans la validation de ce nouveau concept en utilisant des lignées de cellules souches embryonnaires humaines porteuses de la mutation causale de la Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1). Ces cellules, ainsi que leurs progenies neurales et mésenchymateuses représentent un modèle pertinent pour l’étude des conséquences physiopathologiques de la mutation DM1 dans la mesure où elles reproduisent certaines caractéristiques moléculaires connues de la pathologie. Mon projet a eu pour objectif de caractériser d’un point de vue moléculaire et physiopathologique deux nouvelles altérations géniques identifiées par transcriptome différentiel entre les cellules contrôles et DM1. Ainsi, ce travail nous a permis d’identifier un nouveau marqueur, le facteur de transcription ZNF37A, dont l’expression est diminuée en association avec la mutation DM1 et qui serait impliqué dans les défauts myogéniques caractérisant cette pathologie. Parallèlement nous avons identifié un nouveau défaut d’épissage alternatif d’un gène impliqué dans la guidance axonale, l’EphA5 qui pourrait être impliqué dans les défauts cognitifs des patients DM1. / Abstract not available

La fusion membranaire est une étape essentielle du cycle infectieux du virus Influenza dont la compréhension est actuellement incomplète. La fusion nécessite la protéine de surface virale hémagglutinine et, en particulier, ses vingt acides aminés N-terminaux formant le peptide de fusion. Ce peptide a été démontré capable d’initier la fusion membranaire même lorsque séparé du reste de la protéine, mais le mécanisme moléculaire par lequel il y parvient reste méconnu. Afin de mieux comprendre ce mécanisme, nous avons effectué des simulations de dynamique moléculaire du peptide de fusion, du mutant fusogène F9A et du mutant non fusogène W14A, dans des membranes modèles. Dans un premier temps, nous avons étudié la structure et la dynamique du peptide de fusion. Le peptide de fusion a adopté des conformations en hélice-a complète et en coude, et s’est positionné à l’interface membranaire presque parallèlement à la surface de la membrane. Les peptides mutants ont en plus adopté une structure en épingle. La dynamique des peptides a donc été associée à celle d’un V flexible, changeant de conformation par des mouvements de charnière. Dans un second temps, les perturbations membranaires induites par les peptides ont été étudiées par simulations. Ces perturbations incluent la protrusion des chaînes lipidiques et l’intrusion des têtes polaires. Ces deux perturbations ont été causées par des ponts hydrogène entre les phosphates lipidiques et les amides N-terminales des peptides s’insérant sous la surface de la membrane. La quantité d’intrusion des têtes polaires induite par les mutants en simulation était corrélée à leur activité fusogène expérimentale et à la profondeur d’insertion de leur extrémité N-terminale. Suivant ces résultats, nous proposons que l’intrusion des têtes polaires complémente la protrusion des chaînes lipidiques lors de la fusion membranaire en réduisant les forces répulsives entre les têtes polaires des membranes juxtaposées. Ce mécanisme modèle de fusion membranaire pourra avoir un impact sur les futures recherches d’antiviraux contre Influenza. / Membrane fusion is an essential step of the Influenza virus infectious cycle whose understanding remains incomplete. Fusion requires surface viral protein hemagglutinin and, in particular, its twenty N-terminal amino acids composing the fusion peptide. This peptide was shown to initiate fusion even when isolated from the rest of the protein, but the molecular mechanism by which it achieves membrane fusion is still misunderstood. To better understand this mechanism, we performed molecular dynamics simulations of the fusion peptide, fusogenic F9A mutant and nonfusogenic W14A mutant, in model membranes. First, we studied the structure and dynamics of the fusion peptide. The fusion peptide adopted straight a-helical and kinked conformations, and inserted at the membrane interface with an almost parallel orientation with the membrane surface. Mutant peptides additionaly adopted a hairpin structure. The dynamics of the peptides was hence compared to that of a flexible V, switching conformation by hinge movements. In a second step, fusion peptide-induced membrane perturbations were studied from simulations. Those perturbations include lipid tail protrusion and polar head intrusion. The two perturbations were caused by hydrogen bonding between lipid phosphates and membrane inserted peptide N-terminal amides. The amount of polar head intrusion induced by the mutant peptides in simulations was correlated to their experimental fusogenic activity and the insertion depth of their N-termini. Following those results, we propose that polar head intrusion would complement lipid tail protrusion during membrane fusion by reducing the repulsive forces between juxtaposed membranes polar heads. This model of membrane fusion mechanism may have an impact on future Influenza antiviral research.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Sciences animales : Toulouse, INPT : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 295 réf.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les cellules des muscles striés squelettiques sont constituées d'éléments contractiles enveloppés par un réseau membranaire. La formation et l'entretien du muscle strié squelettique impliquent la migration des précurseurs myogéniques, la fusion des myoblastes en myotubes et la mise en place des triades. Ces évènements reposent sur le remodelage des membranes et du cytosquelette d'actine des cellules musculaires. Au cours de ma thèse, j'ai étudié le rôle de la protéine adaptatrice CKIP-1 (casein kinase 2 interacting protein-1) dans certaines étapes du développement du muscle strié squelettique. Après avoir identifié le complexe de nucléation de l'actine Arp (actin-related protein) 2/3 comme un nouvel interacteur de CKIP-1, nous avons montré que l'inhibition de l'expression de ckip-1 chez l'embryon de poisson zèbre altère la morphologie des myoblastes et empêche leur fusion du fait d'une désorganisation du cytosquelette d'actine. J'ai également montré que CKIP-1 n'est présente qu'au cours des étapes précoces de la myogenèse in vitro et in vivo chez la souris, puis elle est progressivement clivée. En outre, la modulation de l'expression de CKIP-1 provoque des défauts membranaires aussi bien in vitro qu'in vivo dans le muscle adulte de souris, suggérant que CKIP-1 est impliquée dans le remodelage des membranes. CKIP-1, par ses capacités à remodeler le cytosquelette d'actine et les membranes, pourrait intervenir dans plusieurs étapes de la vie du muscle : la migration, la fusion des myoblastes et la mise en place ou le maintien du réseau membranaire interne des cellules du muscle strié squelettique.

Les glycoprotéines virales sont impliquées dans les deux principales étapes d’entrée des virus enveloppés dans leurs cellules hôtes : l’attachement des virus aux récepteurs cellulaires et la fusion des membranes virale et cellulaire. Je me suis d’abord attachée à l’étude structurale de la principale glycoprotéine, E2, de deux hépacivirus : la forme B du virus GB (GBV-B) et le virus de l’hépatite C (HCV). Mes tentatives de cristallisation de l’ectodomaine de la protéine E2 du GBV-B sont restées vaines, mais l’analyse des propriétés de ses fragments a suggéré un rôle de son extrémité C-terminale dans la liaison à son récepteur. En parallèle, j’ai co-cristallisé un peptide synthétique correspondant à la principale boucle de liaison de E2 à son récepteur, avec un fragment d’anticorps dirigé contre cette boucle. Etonnament, le peptide forme une hélice , en nette contradiction avec la conformation étendue adoptée dans un fragment du cœur de E2. Associé à des données biochimiques, cela suggère une flexibilité inattendue de cette région de l’ectodomaine d’E2. Dans un second temps, je me suis intéressée à la glycoprotéine F des baculovirus. J’ai résolu la structure du trimère d’un fragment tryptique de F dans sa conformation post-fusion. Cette structure a validé une prédiction selon laquelle la protéine F était une protéine de fusion de classe I homologue à celle des paramyxovirus. La protéine F des baculovirus est ainsi le premier exemple d’une protéine de fusion de classe I encodée par un virus à ADN. Mes résultats confortent donc l’hypothèse que toutes les protéines F ont un ancêtre commun et suggèrent un lien évolutif intéressant entre les virus à ADN, à ARN et leurs hôtes. / Viral glycoproteins are responsible for the two major steps in entry into host cells by enveloped viruses: 1) attachment to cellular receptor/s and 2) fusion of the viral and cellular membranes. My thesis concentrated first on the structural analysis of the major envelope glycoprotein E2 of two hepaciviruses: GB virus B (GBV-B) and hepatitis C virus (HCV). Crystallization of the GBV-B E2 ectodomain remained unsuccessful, but the characterization of truncated versions of E2 suggested an important role of its C-terminal moiety in receptor binding. In parallel, I co-crystallized a synthetic peptide mimicking HCV E2 with an antibody fragment directed against the major receptor-binding loop of E2 that is targeted by broadly neutralizing antibodies. The structure unexpectedly revealed an α-helical peptide conformation, which is in stark contrast to the extended conformation of this region observed in the structure of an E2 core fragment. Together with further biochemical evidence this suggests an unanticipated structural flexibility within this region in the context of the soluble E2 ectodomain. Secondly, I focused on the structural analysis of the baculovirus glycoprotein F. I determined the crystal structure of the post-fusion trimer of a trypsin-truncated F fragment. This structure confirmed previous predictions that baculovirus F protein adopts a class I fusion protein fold and is homologous to the paramyxovirus F protein. Baculovirus F is therefore the first class I fusion protein encoded by a DNA virus. My results support the hypothesis that F proteins may have a common ancestor and imply interesting evolutionary links between DNA and RNA viruses and their hosts.

Les mécanismes moléculaires impliqués dans la fusion membranaire ont été amplement étudiés au cours des trente dernières années. Notre compréhension actuelle de ce phénomène est principalement basée sur des résultats obtenus par (1) le développement de modèles physiques décrivant la fusion des membranes biologiques, (2) l’étude mécanistique et structurale des protéines de fusion membranaire des virus à enveloppe et (3) l’étude des évènements de fusion intracellulaire médiés par les protéines SNARES dans les cellules eucaryotes. La découverte du complexe SNARE fut l’aboutissement de travaux interdisciplinaires qui ont exigés un large éventail de techniques tel que la génétique de la levure, l’électrophysiologie, la biologie moléculaire, la biochimie cellulaire, la biophysique expérimentale et l’imagerie. Tirant parti des paradigmes et techniques biophysiques qui ont émergés de ces études, nous avons examiné les fonctions et mécanismes de régulation des domaines « coiled-coil » dans les processus de fusion intracellulaire impliquant des protéines de la famille des Longin-SNAREs ou des Mitofusines, deux machineries protéiques de fusion dont le mode d’action exact reste encore peu clair. La conception exacte des mécanismes moléculaires de la fusion membranaire requiert la reconstitution in vitro des protéines de fusion dans un large spectre d’environnement membranaire avec des propriétés biophysiques définies et facilement modulables. Idéalement, ces systèmes membranaires devraient permettre à l’expérimentateur de contrôler la composition lipidique et protéique, ainsi que la topologie membranaire, afin de rendre compte de l’importante variabilité observée entre les différents compartiments de fusion cellulaire. La reconstitution dans des liposomes offre une incroyable flexibilité avec la possibilité de faire varier la plupart des paramètres clefs et de créer un environnement minimal dans lequel les facteurs solubles et/ou membranaires peuvent être ajoutés, seuls ou en combinaison, pour dévoiler leur rôle avec clarté. Nous avons mis au point des systèmes in vitro de reconstitution de protéines dans des plateformes membranaires artificielles pour nos deux systèmes d’études (les deux protéines Longin-SNAREs TI-VAMP et Sec 22b, ainsi que les domaines « coiled-coil » des Mitofusines) et nous avons réalisé des expériences biochimiques pour caractériser le mode d’action de ces protéines. L’objectif à long-terme de ce projet est de comparer les mécanismes moléculaires des machineries de fusion associés aux protéines SNAREs et Mitofusines, et ainsi de dévoiler des similitudes structurelles et fonctionnelles entre (1) leur protéines de fusion principales et (2) leur facteurs régulateurs. / The molecular mechanisms involved in membrane fusion have been extensively studied for the past thirty years. Our current understanding of this phenomenon is mainly based on results obtained by (i) the development of physical models describing the fusion of membranes, (ii) structural and mechanistic investigations on fusion proteins of enveloped viruses and (iii) studies of SNARE protein-mediated intracellular fusion events of eukaryotic cells. Discovery of the SNARE complex was the outcome of interdisciplinary works which involved a wide range of techniques including yeast genetics, electrophysiology, molecular biology, cell-free biochemistry, adhesion/fusion biophysics and imaging. Taking advantage of the paradigms and biophysical techniques that emerged from these studies, we investigated the function and regulation of coiled-coil domains in intracellular fusion processes involving Longin-SNAREs or Mitofusins, two fusion protein machineries whose exact mode of action still remains unclear. A comprehensive understanding of the molecular mechanisms of membrane fusion requires the in vitro reconstitution of fusion proteins into a wide variety of membrane environments with defined and tunable biophysical properties. Ideally, these membrane systems should allow the experimentalists to control the lipid and protein composition as well as the membrane topology, to account for the variability observed across cellular fusing compartments. Reconstitution into liposomes offers amazing flexibility with the capacity to vary most of these relevant parameters, and to create a minimal environment in which membrane and/or soluble factors can be added, one at a time or in combination, to reveal their role with clarity. We have set up the in vitro reconstitution of proteins into various artificial membrane platforms for both systems (the Longin-SNAREs TI-VAMP and Sec22b and the coiled-coil domains of Mitofusins) and performed biochemical assays to gain insight into how these proteins execute their functions. The long-term goal of this project is to compare the molecular mechanisms of SNARE and Mitofusin fusion machineries and thus reveal structural and functional similitudes between (i) their core fusion proteins, and (ii) their regulatory factors.

Les mécanismes moléculaires impliqués dans la fusion membranaire ont été amplement étudiés au cours des trente dernières années. Notre compréhension actuelle de ce phénomène est principalement basée sur des résultats obtenus par (1) le développement de modèles physiques décrivant la fusion des membranes biologiques, (2) l’étude mécanistique et structurale des protéines de fusion membranaire des virus à enveloppe et (3) l’étude des évènements de fusion intracellulaire médiés par les protéines SNARES dans les cellules eucaryotes. La découverte du complexe SNARE fut l’aboutissement de travaux interdisciplinaires qui ont exigés un large éventail de techniques tel que la génétique de la levure, l’électrophysiologie, la biologie moléculaire, la biochimie cellulaire, la biophysique expérimentale et l’imagerie. Tirant parti des paradigmes et techniques biophysiques qui ont émergés de ces études, nous avons examiné les fonctions et mécanismes de régulation des domaines « coiled-coil » dans les processus de fusion intracellulaire impliquant des protéines de la famille des Longin-SNAREs ou des Mitofusines, deux machineries protéiques de fusion dont le mode d’action exact reste encore peu clair. La conception exacte des mécanismes moléculaires de la fusion membranaire requiert la reconstitution in vitro des protéines de fusion dans un large spectre d’environnement membranaire avec des propriétés biophysiques définies et facilement modulables. Idéalement, ces systèmes membranaires devraient permettre à l’expérimentateur de contrôler la composition lipidique et protéique, ainsi que la topologie membranaire, afin de rendre compte de l’importante variabilité observée entre les différents compartiments de fusion cellulaire. La reconstitution dans des liposomes offre une incroyable flexibilité avec la possibilité de faire varier la plupart des paramètres clefs et de créer un environnement minimal dans lequel les facteurs solubles et/ou membranaires peuvent être ajoutés, seuls ou en combinaison, pour dévoiler leur rôle avec clarté. Nous avons mis au point des systèmes in vitro de reconstitution de protéines dans des plateformes membranaires artificielles pour nos deux systèmes d’études (les deux protéines Longin-SNAREs TI-VAMP et Sec 22b, ainsi que les domaines « coiled-coil » des Mitofusines) et nous avons réalisé des expériences biochimiques pour caractériser le mode d’action de ces protéines. L’objectif à long-terme de ce projet est de comparer les mécanismes moléculaires des machineries de fusion associés aux protéines SNAREs et Mitofusines, et ainsi de dévoiler des similitudes structurelles et fonctionnelles entre (1) leur protéines de fusion principales et (2) leur facteurs régulateurs. / The molecular mechanisms involved in membrane fusion have been extensively studied for the past thirty years. Our current understanding of this phenomenon is mainly based on results obtained by (i) the development of physical models describing the fusion of membranes, (ii) structural and mechanistic investigations on fusion proteins of enveloped viruses and (iii) studies of SNARE protein-mediated intracellular fusion events of eukaryotic cells. Discovery of the SNARE complex was the outcome of interdisciplinary works which involved a wide range of techniques including yeast genetics, electrophysiology, molecular biology, cell-free biochemistry, adhesion/fusion biophysics and imaging. Taking advantage of the paradigms and biophysical techniques that emerged from these studies, we investigated the function and regulation of coiled-coil domains in intracellular fusion processes involving Longin-SNAREs or Mitofusins, two fusion protein machineries whose exact mode of action still remains unclear. A comprehensive understanding of the molecular mechanisms of membrane fusion requires the in vitro reconstitution of fusion proteins into a wide variety of membrane environments with defined and tunable biophysical properties. Ideally, these membrane systems should allow the experimentalists to control the lipid and protein composition as well as the membrane topology, to account for the variability observed across cellular fusing compartments. Reconstitution into liposomes offers amazing flexibility with the capacity to vary most of these relevant parameters, and to create a minimal environment in which membrane and/or soluble factors can be added, one at a time or in combination, to reveal their role with clarity. We have set up the in vitro reconstitution of proteins into various artificial membrane platforms for both systems (the Longin-SNAREs TI-VAMP and Sec22b and the coiled-coil domains of Mitofusins) and performed biochemical assays to gain insight into how these proteins execute their functions. The long-term goal of this project is to compare the molecular mechanisms of SNARE and Mitofusin fusion machineries and thus reveal structural and functional similitudes between (i) their core fusion proteins, and (ii) their regulatory factors.