Le métapneumovirus humain (hMPV) est un virus qui circule dans la population humaine depuis plus de70 ans et a été isolé pour la première fois en 2001. Il est la troisième cause mondiale en lien avec les hospitalisations d’enfants pour maladies aigües des voies respiratoires supérieures et inférieures. Il est responsable d’une multitude de complications chez les jeunes enfants, les personnes âgées ainsi que les personnes immunosupprimées. À ce jour, il n’existe aucun vaccin commercial contre le hMPV. Dans les récentes années, la protéine de fusion F, qui est le principal antigène viral, a fait l’objet d’une multitude d’essais principalement pré-cliniques en vaccination. La découverte que, chez le virus respiratoire syncytial (VRS), la protéine F stabilisée en forme pré-fusion est plus immunogène a fourni de nouvelles pistes pour le développement vaccinal. Pour ces raisons, l’objectif de ma maîtrise est le développement d’un vaccin sous-unitaire à base de protéine F-hMPV stabilisée en pré-fusion et son test chez le modèle de la souris BALB/C pour vérifier son potentiel protecteur. Nos études ont démontré qu’il n’y a pas de différence significative, en termes d’immunogénicité, entre la forme pré- et post-fusion de la protéine F chez le hMPV. Les essais d’immunogénicité ont également démontré la nécessité de l’ajout de l’adjuvant alum pour élucider une réponse immunitaire chez la souris BALB/C. Les immunisations par les protéines adjuvantées ont démontré le développement d’anticorps neutralisants. Suite à l’infection, la réplication virale pulmonaire a été diminuée sous le seuil de détection des techniques utilisées, mais l’inflammation pulmonaire a persisté. Les vaccins adjuvantés n’ont pas influencé la perte de poids chez la souris, mais ont amélioré les autres symptômes cliniques tels l’activité physique et le poil ébouriffé. Les vaccins F-hMPV sans alum présentent certaines caractéristiques de réponse immune exagérée (titres en anticorps neutralisants nuls; état physique détérioré) et devront être analysés davantage. Les vaccins F-hMPV avec alum n’ont pas démontré des signes de réponse immune exagérée, suite à l’infection par le hMPV, malgré une réponse immune de type Th2 plus forte. Globalement, malgré une réduction des titres viraux à un seuil indétectable, aucun des vaccins n’a protégé complètement le modèle murin contre l’infection par le hMPV. Les vaccins développés au cours de ces études ouvrent la voie à de nouvelles stratégies d’immunisation, de nouveaux essais de vaccination en combinaison avec d’autres adjuvants et peuvent servir de base pour le développement d’un vaccin efficace contre le hMPV / The human metapneumovirus has been first isolated in 2001 despite its circulation in the human population for more than 70 years. HMPV is the third leading cause of children hospitalisations associated with acute respiratory tract infections. Complications occur commonly in young children, the elderly and the immunocompromised. To this day, no vaccine has been licensed for use against hMPV. In recent years, the F protein, considered the most immunodominant antigen, has been the target of many pre-clinical vaccine trials. The discovery, for RSV, that a prefusion bound F protein is more immunogenic than post-fusion has encouraged new vaccination approaches. Based on this discovery, the aim of this project is the development of a prefusion bound F-hMPV subunit vaccine and testing its potency to protect the BALB/C model. Following challenge, no significant difference between potentially prefusion bound proteins and wild type protein was observed. Immunisation trials revealed the necessity of adding an adjuvant, alum in this case, to elicit an immune response in mice. Neutralizing antibodies were observed with F-hMPV vaccines containing the alum adjuvant. Post-immunisation challenge trials revealed reduction of lung viral replication below detection levels and persisting inflammation. Weight loss was not affected by vaccination, but animals immunised with adjuvanted F-hMPV proteins exhibited better physical condition and no signs of disease such as diminished activity and ruffed fur. F-hMPV vaccines without alum exhibited some characteristics of enhanced disease (no neutralizing antibodies; affected physical condition) and require further analysis. Enhanced disease was not observed in the F-hMPV adjuvanted groups despite higher Th2/Th1 ratios with adjuvanted proteins . None of the vaccines tested were able to fully protect the mouse model upon challenge. Vaccines developed in this study will be useful in future trials and could be tested with other adjuvants or vaccination strategies.

Thèse d'exercice : Pharmacie : Université de Nantes : 2005. / Bibliogr. f. 94-109 [107 réf.].

Les virus influenza sont des pathogènes respiratoires responsables d’épidémies saisonnières touchant 10 à 20% de la population mondiale chaque année, constituant donc un problème majeur de santé publique. La vaccination annuelle réduit l’impact des épidémies grippales; cependant, un mésappariement entre les souches vaccinales et circulantes peut parfois survenir et résulter en un échec de protection de la population. Dans ces cas, il est important d’avoir un traitement adéquat afin de traiter l’infection virale. Les inhibiteurs de la neuraminidase (INAs) constituent la principale classe d’antiviraux recommandée pour la prévention et le traitement des infections grippales. Les INAs lient de façon compétitive le site actif de la neuraminidase (NA), ce qui bloque la libération des virions des cellules hôtes inhibant de la sorte la dissémination du virus dans le tractus respiratoire. L’émergence sporadique de virus résistants à l’oseltamivir et/ou au zanamivir avec de faibles taux de transmission a été identifiée lors de traitements des souches saisonnières de l’influenza. Le développement de nouveaux antiviraux devient donc un sujet important d’investigation. Le peramivir, un nouvel INA disponible depuis peu en Amérique du Nord, exerce une activité sur des virus influenza A et B et son efficacité contre des mutants résistants à l’oseltamivir ou au zanamivir n’a pas encore été complètement caractérisée. À cause des différences dans la liaison des INAs avec l’enzyme cible, la nature des mutations de résistance peut varier d’un INA à l’autre bien que certaines mutations pourraient engendrer une résistance croisée à plusieurs INAs. Nous avons démontré que le peramivir s’avère très actif contre les différents sous-types de grippe saisonnière, quoique certains variants aient présentés des phénotypes de multi-résistance à l’oseltamivir, au zanamivir ainsi qu’au peramivir. À cet égard, un nouveau mécanisme de résistance d’un variant menant à la résistance croisée aux INAs a été décrit (I427T/Q313R) dans le cadre de ce mémoire et a permis de comprendre comment des substitutions retrouvées hors du site actif de la NA peuvent affecter la capacité de réplication du virus et sa résistance aux antiviraux. / Influenza viruses are respiratory pathogens responsible for seasonal epidemics affecting 10 to 20% of the world's population every year, thus constituting a major public health impact. Annual vaccination reduces the impact of influenza epidemics; however, a mismatch between the vaccine strain and the circulating strain can sometimes occur and result in an unsuccessful attempt in protecting the population. In such cases, it is important to have adequate treatment to treat influenza infections. Neuraminidase inhibitors (NAIs) are the primary class of antiviral agents recommended for the prevention and treatment of influenza infections. NAIs competitively bind the neuraminidase (NA) active site, blocking the release of virions from host cells and thereby inhibiting the spread of the virus into the respiratory tract. The sporadic emergence of oseltamivir- and/or zanamivir-resistant viruses with low transmission rates was identified in seasonal influenza strains. The development of new antivirals thus became an important subject of investigation. Peramivir, a new NAI recently available in North America, exerts its activity against influenza A and B viruses, but its effectiveness against mutations conferring resistance to oseltamivir or zanamivir has not yet been fully characterized. Due to differences in the binding of NAIs to the target enzyme, the nature of the resistance mutations may vary from one NAI to another, although some mutations could induce global NAI cross-resistance. We have demonstrated that peramivir is highly active against the different seasonal influenza subtypes, although some variants have shown multi-resistance phenotypes to oseltamivir, zanamivir as well as peramivir. In this regard, a new resistance mechanism by which a NA variant leads to NAI cross-resistance (I427T/Q313R) has been described in this thesis and has helped to understand how substitutions found outside the NA active site can affect the replication kinetics of the virus and its resistance to antivirals.

Le métapneumovirus humain (hMPV) est un virus responsable d’infections aiguës des voies respiratoires telles que des bronchiolites, des bronchites ou des pneumonies, principalement chez les populations à risques que sont les jeunes enfants de moins de 5ans, ainsi que les personnes âgées ou immunodéprimées. Découvert en 2001, ce virus et sa pathogénèse ne restent encore aujourd’hui que partiellement caractérisés. De ce fait et malgré les besoins, il n’y a aucun vaccin ou traitement thérapeutique spécifique et efficace contre le HMPV disponible sur le marché. Dans ce contexte, mon projet de thèse s’est articulé autour de deux axes principaux: (i) L’étude de la protéine de fusion F du virus hMPV, protéine majeure antigénique de surface et responsable de l’entrée du virus dans la cellule cible. Elle a pour particularité d’induire de manière autonome la fusion membranaire in vitro et d’être associée à des effets cytopathiques variable selon les souches virales. De par son rôle clé pour le virus hMPV, la protéine F a déjà fait l’objet de plusieurs études structurales et fonctionnelles mais les déterminants de cette activité fusogénique ne sont pas encore entièrement caractérisés. Nous nous sommes donc intéressés à l’identification de déterminants du phénotype viral hyperfusogénique, localisés dans les domaines heptad repeats de la protéine F du hMPV. (ii) L’atténuation de deux souches virales cliniques (CAN98-75 et C-85473) par délétion de gènes accessoires dans le but de développer des candidats vaccinaux adaptés aux enfants en bas âge. Différents virus ont été générés par génétique inverse et les délétions des gènes accessoires SH et G dans les deux fonds génétiques viraux ont été étudiées pour leur impact sur l’infectivité, la réplication et la pathogénèse virale in vitro et in vivo ainsi que leur contribution pour le développement de virus atténués candidats vaccinaux. / Human metapneumovirus (hMPV) is a major pathogen responsible of acute respiratory tract infections, such as bronchiolitis or pneumonia, affecting especially infants, under five years old, elderly individuals and immunocompromised adults. Identified since2001, this virus and its pathogenes is still remain largely unknown and no licensed vaccines or specific antivirals against hMPV are currently available. In this context, my research project was built over two main subjects: (i) The study of the fusion F glycoprotein which is the major antigenic protein of hMPV and is responsible of viral entry into host cell. By its crucial role for the virus, the F protein has already been characterized in several structural and/or functional studies. Thus, it has been described that the hMPV F protein induces membrane fusion autonomously, resulting in variable cytopathic effects in vitro, in a strain-dependent manner. However, as the determinants of the hMPV fusogenic activity are not well characterized yet, we focused on identification of some of these, located in heptad repeats domains of the protein. (ii) The evaluation of hMPV SH and G gene deletion for viral attenuation. Live-attenuated hMPV vaccine candidates for infants’ immunization has been constructed thank to this deletion approach at the beginning of hMPV vaccine development efforts. Despite encouraging results, these candidates have not been further characterized and the importance of the viral background has not been evaluated.

Le virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (vFHCC), l'agent étiologique causant la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (FHCC), est répandu à travers l'Afrique, l'Europe et l'Asie. La FHCC présente un taux de mortalité pouvant atteindre jusqu'à 30% et est considérée comme une infection virale émergente ou ré-émergente de haut niveau de surveillance internationale. Chez l'humain, le virus se transmet par des piqûres de tiques du genre Hyalomma sp infectées ainsi que par contact avec des fluides corporels d'animaux et humains infectés. À l'heure actuelle, il n'existe aucun vaccin approuvé par les principaux organismes de réglementation contre le vFHCC ni son vecteur, la tique. À cet effet, des vaccins à base d'ADN pourraient être utilisés afin d'induire les réponses immunitaires cellulaire et humorale, une technologie qui permettrait la fabrication et le déploiement flexible de vaccins en situation de pandémie. Dans la présente étude, la conception et le développement de nouveaux plasmides d'ADN, appelés plasmides pour l'administration intradermique de vaccins (pIDV, de l'anglais plasmids for intradermal delivery of vaccines) ont été optimisés pour l'expression dans les cellules eucaryotes en incorporant des éléments génétiques réutilisés d'autres plasmides bien caractérisés. Le clonage de l'élément PRE Woodchuck dans un plasmide pIDV-II a amélioré l'expression d'un transgène de protéine fluorescente verte (GFP), comparativement aux plasmides « parents » pVax et pCAGGS, d'où sa sélection pour les tests d'immunisation ultérieurs. Il a été démontré que le plasmide pIDV-II convient à la vaccination animale et qu'il augmente l'antigénicité chez la souris contre des glycoprotéines-cibles du virus Ebola, du VIH et du vFHCC, en comparaison avec le plasmide d'ADN pVax1, une technologie plus standard. Plus précisément, deux gènes précurseurs de glycoprotéines (GPC) des souches Turkey04 et Turkey-Keltit06 du vFHCC, dont la sélection des codons a été optimisée, ont été clonés pour former les plasmides pIDV-II-GPC-Tky-04 et pIDV-II-GPC-Kelkit06. Seule la construction comprenant la séquence GPC Turkey04 a été retenue pour les tests d'immunogénicité en raison de sa capacité à générer des simili-virus ou VLP, de l'anglais virus-like particles, dans un système de minigénome rapporteur. Ce plasmide a permis d'augmenter la réponse immunitaire cellulaire, mesurée par la liaison des IgG sériques aux VLP de vFHCC et la production d'interféron-gamma dans les splénocytes murins stimulés par peptides analogues. La réponse immunitaire chez des moutons injectés avec le plasmide pIDV-II-GPC-Tky04 par voie intradermique avec un appareil à tatouer IONAID (Intradermal Oscillatory Needle-Acquired Device), développé à l'interne, s'est montrée supérieure à la réponse immunitaire induite par électroporation. Cette étude a aussi examiné le potentiel immunogène des différents antigènes de tiques lorsqu'insérés dans pIDV-II. L'ADN codant pour l'antigène HA86 de la glycoprotéine a été sélectionné, car le gène est très similaire au seul vaccin anti-tiques de type Bm86 à avoir été commercialisé. L'antigène de tique 64P et le peptide pP0 ont été sélectionnés pour leur potentiel d'application comme éléments vaccinaux contre d'autres espèces de tiques. Le peptide pP0 a été employé pour fusionner les gènes HA86 et 64P. Des recherches antérieures suggèrent que le peptide immunostimulant 5mer4 encodé dans un fragment d'ADN puisse agir comme un adjuvant simple et efficace pour améliorer la réponse immunitaire chez des souris vaccinées. Ainsi, ce peptide a été retenu pour créer des antigènes de tiques ayant des propriétés adjuvantes encodés dans l'ADN plasmidique. Afin d'évaluer les IgG totaux chez la souris, un plasmide pIDV-II-10HIS a été généré afin d'exprimer et de purifier in vitro des antigènes recombinants de tiques. Néanmoins, seulement les constructions d'ADN basées sur le gène HA86 ont pu induire une réponse humorale chez la souris. Ce travail de thèse a également révélé que la séquence d'ADN du peptide 5mer4 fusionnée aux antigènes de tiques, encodés dans l'ADN, augmentait la liaison des IgG totaux aux antigènes HA86 chez des souris vaccinées. Dans l'ensemble, l'étude présentée ici décrit le développement d'un vaccin à ADN contre le vFHCC, qui pourrait être utilisé à l'avenir en conjonction avec un vaccin à ADN anti-tiques pour stimuler la reconnaissance immunitaire d'antigènes basés sur HA86 ciblant les tiques du genre Hyalomma sp dans un but de prévenir la transmission du vFHCC chez l'humain et les animaux. Cette stratégie s'avère très prometteuse pour la protection contre d'autres vecteurs et pathogènes causant la maladie de Lyme, la Dengue et le Zika. / Crimean-Congo hemorrhagic fever virus (CCHFV), the etiologic agent of Crimean-Congo hemorrhagic fever (CCHF), has a wide presence in Africa, Europe, and Asia. CCHF is associated with a mortality rate of up to 30% and is considered an emergent or re-emergent virus of global concern due to its continuing spread. In humans, the virus is transmitted by infected Hyalomma sp ticks as well as from contact with body fluids from infected animals through transient viremia and nosocomial transmission. Currently, there are no clinical or veterinary vaccines approved by major regulatory agencies against CCHFV or the tick vector. DNA-based vaccine technology can be used to induce cellular and humoral immune responses and allows for manufacturing and flexible deployment of vaccines in pandemic scenarios. In this study, the design and development of novel DNA plasmids for intradermal delivery of vaccines (pIDVs) were first generated and optimized for eukaryotic expression using repurposed genetic elements from well-characterized plasmids. The cloning of a known Woodchuck post-translational regulatory element (PRE) in a pIDV-II plasmid improved transgene expression of a cloned green fluorescent protein similarly compared to a cloned version of the parent plasmids pVax and pCAGGS, and was chosen for subsequent immunization assays. The pIDV-II plasmid was demonstrated to be suitable for animal immunization and improved antigenicity in mice against glycoproteins from EBOV, HIV, and CCHFV targets, which differed in their molecular complexity, compared to the standard pVax1 DNA plasmid technology. Specifically, two codon-optimized glycoprotein precursor (GPC) CCHFV genes from Turkey04 and Turkey-Keltit06 strains, two clinically related isolates, were cloned to create pIDV-II-GPC-Tky-04 and pIDV-II-GPC-Kelkit06 plasmids. Only the construct bearing the GPC sequence Turkey04 was selected for immunogenicity assays due to its capacity to generate CCHF virus-like particles (CCHFV-VLPs) in a Biosafety Level 2 surrogate minigenome reporter system. This plasmid improved the humoral and adaptive cell-mediated immune responses as assessed by serum IgG binding to CCHFV-VLPs and production of interferon-gamma by peptide-stimulated mice splenocytes, respectively. The immune response to pIDV-II-GPC-Tky04 in sheep delivered by intradermal oscillatory needle-acquired injection device (IONAID) tattooing technology made in-house was more robust than the immune response to an electroporation-assisted procedure. This study also examined concealed and exposed tick antigens that were tested as pIDV-II vaccines to potentially control tick infestation in animals. The "concealed" DNA-encoded HA86 antigen truncated glycoprotein was selected since the gene is closely related to the only commercially successful Bm86-like anti-tick vaccine; furthermore, its recombinant form has shown efficacy in decreasing the survival of Hyalomma ticks in vaccinated calves. The exposed 64P tick antigen and pP0 peptide were also selected for this study based on previous research suggesting broader applicability of these factors to tick species other than the original isolate. The pP0 peptide was used to fuse the HA86 and 64P genes. Previous research suggests that the use of the DNA-encoded immune peptide 5mer4 as an effective adjuvant with a simple composition enhances the immune response of vaccinated mice; thus, this peptide was used to create adjuvant DNA-encoded tick immunogens. For proper evaluation of total IgG responses in mice, a pIDV-II-10HIS plasmid was created to transiently express and purify in-vitro recombinant tick antigens. Generally, in this study, after a single immunization, only HA86-based DNA constructs were able induce humoral responses in mice. This thesis work also determined that using the peptide 5mer4 fused to DNA-encoded tick antigens efficiently enhanced total IgG binding to HA86 antigens in groups of vaccinated mice. Overall, the study presented here describes the development of CCHFV DNA-based vaccine, which can be combined with a DNA-based anti-tick vaccine and recombinant proteins for immune detection of HA86-based antigens targeting ticks of the genus Hyalomma sp. to prevent CCHFV spread in animals and humans in the future. This strategy offers great promise for protecting against other pathogens and their vectors, such as Borrelia sp, ticks, and mosquitoes that cause diseases including Lyme disease, Zika, and Dengue.

La sécurité des vaccins est évaluée par le biais du système de surveillance passive des manifestations cliniques indésirables (MCI). À cause du très grand nombre de personnes vaccinées lors des campagnes massives de vaccination contre l'influenza, si un effet secondaire modérément fréquent (ex. 1/1 000 vaccinés) survenait, le délai avant que la surveillance passive ait détecté un problème serait suffisamment long pour que des millions de personnes aient été vaccinés et que des milliers aient souffert de cet effet secondaire. Lors de la vaccination de masse contre l'influenza pandémique H1N1 en 2009, un projet pilote de surveillance électronique active de la sécurité du vaccin contre l'influenza pandémique chez plusieurs milliers de travailleurs de la santé a été mis sur pied. Cette surveillance visait à évaluer très rapidement la fréquence des problèmes de santé suffisamment sévères pour causer de l'absentéisme au travail ou une consultation médicale. La présente étude a évalué la qualité de cette surveillance par le biais de ses attributs comme définis dans le cadre de référence des Centers for Disease Control and Prevention (CDC) pour l'évaluation des systèmes de surveillance. Une méthodologie mixte (analyse quantitative et qualitative) a été utilisée. Les résultats montrent que la simplicité, la flexibilité, l'acceptabilité et la valeur prédictive positive (VPP) étaient des attributs plutôt acquis par le système de surveillance, mais que des déficiences étaient présentes dans le contrôle de la qualité des données, la sensibilité, la représentativité et la réactivité. Des recommandations ont été émises pour améliorer ce système, qui pourraient servir dans le cas d'une nouvelle pandémie ou s'intégrer au processus formel de surveillance de la vaccination saisonnière contre l'influenza.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2015-2016 / Cette étude visait à caractériser la croissance, la capacité photosynthétique, la concentration en azote et protéines totales solubles, la production de protéines recombinantes (HA) ainsi que la quantité de lumière interceptée à différents stades de développement de plants de Nicotiana benthamiana afin d’optimiser la production de vaccins. L’évolution des réponses physiologiques étudiées fut similaire chez toutes les feuilles primaires, suggérant que le processus de sénescence s’initie et progresse de façon semblable indépendamment de leur ordre d’initiation. Toutefois, la superposition des patrons temporels de sénescence et de croissance foliaire a mené à un rendement HA maximal se situant invariablement dans la partie médiane du plant lorsqu’exprimé sur une base foliaire. À l’échelle du plant entier, nos résultats suggèrent qu’il est possible d’augmenter la production de vaccins en récoltant les plants à un stade de développement plus tardif, ou en augmentant la densité de culture et en récoltant ces plants plus tôt. / Nicotiana benthamiana is a wild relative of tobacco increasingly used as a plant protein expression platform to produce recombinant vaccine antigens against the influenza virus. Investigation on the physiological determinants of this production is essential to optimize and regulate vaccines production following a new flu outbreak. We examined the photosynthetic photon flux density, growth, light-saturated photosynthesis, total soluble protein, nitrogen content and recombinant protein production at different phenological stages. The similar evolution of the studied physiological responses suggested that the senescence process is initiated and progresses in a similar way in all primary leaves, regardless of the order of initiation. In contrast, the superposition of the time pattern of senescence with that of leaf growth shows that maximal HA yield expressed on a leaf basis is invariably located in the middle part of the plant. At the whole plant scale, our results suggest that it is possible to increase the production of antigens by harvesting plants at a later developmental stage, or by increasing plant density and harvesting these plants earlier.