Les infections à virus influenza demeurent un problème de santé majeur dans le monde entier. Une nouvelle classe d'agent anti-influenza servant au traitement et à la prévention a été développée, soit les inhibiteurs de neuraminidase. L'objectif premier de ce projet de maîtrise était de générer différents variants du virus influenza A/WSN/33 (HlNl) résistants au peramivir et au zanamivir. En second lieu, nous avons étudié l'effet de certaines mutations du gène NA, en utilisant des protéines NA recombinantes, quant à leur degré de susceptibilité face à différents inhibiteurs de neuraminidase. La virulence d'un virus A/WSN/33 généré par génétique inverse contenant les mutations H274Y et N294S dans le gène NA, a été étudiée dans un modèle murin Balb/c. Nous avons également caractérisé des virus A/H3N2 isolés d'un enfant immunosupprimé traité avec trois antiviraux (oseltamivir, amantadine et zanamivir). / Influenza infections remain a major health problem Worldwide. For the treatment and prevention of influenza infections, a new class of anti-influenza agents, the neuraminidase inhibitors (NAIs), has been developed. The objectives of this master project were firstly the in vitro generation of peramivir and zanamivir-resistant variants. Secondly, we have studied the effect of selected NA mutations on the susceptibility profiles to different NAIs using recombinant NA proteins. We have also investigated the virulence of reverse genetics-rescued A/WSN/33 viruses harboring H274Y and N294S NA mutations in a Balb/c model. Finally, we studied influenza A/H3N2 viruses isolated from an immunocompromised child who was treated with three antivirals (oseltamivir, amantadine and zanamivir).

Les virus influenza sont des pathogènes respiratoires responsables d’épidémies saisonnières touchant 10 à 20% de la population mondiale chaque année, constituant donc un problème majeur de santé publique. La vaccination annuelle réduit l’impact des épidémies grippales; cependant, un mésappariement entre les souches vaccinales et circulantes peut parfois survenir et résulter en un échec de protection de la population. Dans ces cas, il est important d’avoir un traitement adéquat afin de traiter l’infection virale. Les inhibiteurs de la neuraminidase (INAs) constituent la principale classe d’antiviraux recommandée pour la prévention et le traitement des infections grippales. Les INAs lient de façon compétitive le site actif de la neuraminidase (NA), ce qui bloque la libération des virions des cellules hôtes inhibant de la sorte la dissémination du virus dans le tractus respiratoire. L’émergence sporadique de virus résistants à l’oseltamivir et/ou au zanamivir avec de faibles taux de transmission a été identifiée lors de traitements des souches saisonnières de l’influenza. Le développement de nouveaux antiviraux devient donc un sujet important d’investigation. Le peramivir, un nouvel INA disponible depuis peu en Amérique du Nord, exerce une activité sur des virus influenza A et B et son efficacité contre des mutants résistants à l’oseltamivir ou au zanamivir n’a pas encore été complètement caractérisée. À cause des différences dans la liaison des INAs avec l’enzyme cible, la nature des mutations de résistance peut varier d’un INA à l’autre bien que certaines mutations pourraient engendrer une résistance croisée à plusieurs INAs. Nous avons démontré que le peramivir s’avère très actif contre les différents sous-types de grippe saisonnière, quoique certains variants aient présentés des phénotypes de multi-résistance à l’oseltamivir, au zanamivir ainsi qu’au peramivir. À cet égard, un nouveau mécanisme de résistance d’un variant menant à la résistance croisée aux INAs a été décrit (I427T/Q313R) dans le cadre de ce mémoire et a permis de comprendre comment des substitutions retrouvées hors du site actif de la NA peuvent affecter la capacité de réplication du virus et sa résistance aux antiviraux. / Influenza viruses are respiratory pathogens responsible for seasonal epidemics affecting 10 to 20% of the world's population every year, thus constituting a major public health impact. Annual vaccination reduces the impact of influenza epidemics; however, a mismatch between the vaccine strain and the circulating strain can sometimes occur and result in an unsuccessful attempt in protecting the population. In such cases, it is important to have adequate treatment to treat influenza infections. Neuraminidase inhibitors (NAIs) are the primary class of antiviral agents recommended for the prevention and treatment of influenza infections. NAIs competitively bind the neuraminidase (NA) active site, blocking the release of virions from host cells and thereby inhibiting the spread of the virus into the respiratory tract. The sporadic emergence of oseltamivir- and/or zanamivir-resistant viruses with low transmission rates was identified in seasonal influenza strains. The development of new antivirals thus became an important subject of investigation. Peramivir, a new NAI recently available in North America, exerts its activity against influenza A and B viruses, but its effectiveness against mutations conferring resistance to oseltamivir or zanamivir has not yet been fully characterized. Due to differences in the binding of NAIs to the target enzyme, the nature of the resistance mutations may vary from one NAI to another, although some mutations could induce global NAI cross-resistance. We have demonstrated that peramivir is highly active against the different seasonal influenza subtypes, although some variants have shown multi-resistance phenotypes to oseltamivir, zanamivir as well as peramivir. In this regard, a new resistance mechanism by which a NA variant leads to NAI cross-resistance (I427T/Q313R) has been described in this thesis and has helped to understand how substitutions found outside the NA active site can affect the replication kinetics of the virus and its resistance to antivirals.

Les virus influenza ont toujours eu un impact considérable sur l’humanité. Les virus influenza B (IB) ont longtemps été négligés et sous-estimés par rapport aux virus influenza A (IA). Ils ne représentent que 10 à 20% des infections annuelles par les virus influenza, mais peuvent devenir majoritaire certaines années et entrainer des symptômes similaires à ceux des virus IA. Les inhibiteurs de la neuraminidase (INA) sont les principaux traitements disponibles contre les virus influenza. Cependant, à la suite de mutations, certains virus influenza ont développé des mécanismes de résistance limitant dangereusement les options thérapeutiques. Actuellement, très peu de souches résistantes sont isolées en clinique car le fitness de ces virus résistants, c’est-à-dire leur capacité à se répliquer et se transmettre, est altéré. Or, il a été montré que des virus IA peuvent améliorer leur fitness et propager le phénotype de résistance. L’objectif de ce projet de thèse est de mieux comprendre la résistance des virus influenza B et son impact sur le fitness viral afin de mieux prévenir l’émergence de souches résistantes. Nous avons, dans un premier temps, étudié la résistance des virus influenza A et B au peramivir, le plus récent des INA. Nous avons confirmé que cette molécule est hautement active contre les souches saisonnières A et B. De plus, elle conserve une activité antivirale in vitro contre certaines souches virales ayant une sensibilité réduite ou hautement réduite contre d’autres INA (l’oseltamivir et le zanamivir). Dans un second temps, nous avons étudié le fitness de virus influenza B contemporains résistants in vitro et chez la souris. Nous avons montré que certains virus influenza B, ayant un phénotype de résistance croisée, peuvent maintenir un fitness similaire à celui du virus sauvage in vitro et in vivo. De plus, nous avons pu décrire et analyser un nouveau mécanisme de résistance chez les virus influenza B observé chez un cas clinique. Ces résultats soulignent la dangerosité de notre dépendance aux INA et nous encouragent à faire évoluer les stratégies thérapeutiques.

Les inhibiteurs de la neuraminidase (INAs) jouent un rôle central dans le contrôle des infections grippales, tant dans le cas des épidémies et des pandémies comme chez les patients immunosuprimés et d'autres patients à risque. Cependant, le développement et la dissémination de la résistance compromettent l'utilité à long terme de cette intervention. En fait, le problème de la résistance aux INAs a été mis en évidence pendant les épidémies de grippe annuelles de 2007-09, avec la dissémination globale d’une variante de la souche A(H1N1) saisonnière résistante à l'oseltamivir. Dans ce cas, les observations préliminaires ont spéculé avec l'existence d'un ensemble de mutations “permissives” qui auraient facilité cette transmission mondiale. Heureusement, l'émergence et la propagation mondiale de la souche pandémique en 2009 a mené au remplacement de la souche saisonnière A/Brisbane/59/2007 (H1N1) résistante à l'oseltamivir, par le virus A(H1N1)pdm09 naturellement sensible aux INA, et, par conséquent, l'oseltamivir a récupéré son utilité clinique. En fait, la plupart des virus A(H1N1)pdm09, A(H3N2) et B circulants à ce jour restent sensibles à l'oseltamivir, avec seulement 1-2% de souches résistantes. Néanmoins, le nombre croissant de souches résistantes récemment détectées en l’absence de traitement fait craindre que ce problème puisse encore augmenter. À cet égard, l'impact de l'émergence et la dissémination de la résistance sur le choix limité des antiviraux actuellement disponibles renforce la nécessité d’une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à ce phénomène ainsi que de nouvelles approches thérapeutiques. Les différentes études présentées dans le cadre de cette thèse convergent vers l'objectif général de mieux décrire les mécanismes de développement de la résistance aux INAs dans les virus de la grippe. En outre, nous prévoyons que les thérapies combinées pourraient induire une meilleure réponse virologique et immunologique par rapport à la monothérapie antivirale. À la fin, nous nous attendons à ce que notre travail ait un impact sur la gestion des infections grippales en guidant la surveillance mondiale des marqueurs potentiels de résistance, ainsi qu’en proposant des traitements novateurs qui minimisent le développement de souches résistantes. / Neuraminidase inhibitors (NAIs) play a central role in the control of influenza infections, with important implications in the management of outbreaks and pandemics as well as in immunocompromised and other at risk patients, with both prophylactic and therapeutic indications. However, the development and dissemination of antiviral drug resistance represents a major limitation that compromises the long-term usefulness of this intervention. Actually, the problem of resistance to NAIs was highlighted by the worldwide dissemination of the oseltamivir-resistant seasonal A(H1N1) neuraminidase H274Y variant during the 2007-09 annual influenza epidemics. In that case, preliminary observations speculated with the existence of a set of “permissive” mutations that could have facilitated this global transmission. Fortunately, the antigenic shift that enabled the emergence of and global spread of the 2009 pandemic strain meant the replacement of the oseltamivir-resistant seasonal A/Brisbane/59/2007 (H1N1) virus by the naturally NAI-susceptible A(H1N1)pdm09 virus, and, consequently, oseltamivir recovered its clinical utility. In fact, most of the circulating A(H1N1)pdm09, A(H3N2) and B viruses remain susceptible to oseltamivir with only 1-2% of tested strains exhibiting phenotypic or genotypic evidence of resistance. Nevertheless, the growing number of resistant strains recently detected in the absence of therapy raises concern that this problem could increase. In that regard, the impact of the emergence and dissemination of resistance on the limited choice of antivirals currently available underscores a better understanding of the mechanisms underlying this phenomenon as well as the necessity for innovative therapeutic approaches. The different studies presented in this thesis converge to the general objective of better describing the mechanisms underlying the development of resistance to NAIs in influenza viruses. Also, we anticipate that combination therapies will induce better virological and immunological responses compared to antiviral monotherapy. In the end, we expect that our work will have an impact on the management of influenza infections by guiding the global surveillance of potential drug resistance markers, as well as proposing innovative ways to improve the clinical outcome and minimizing the development of drug-resistant strains.