Malgré la disponibilité d’un traitement curatif et un vaccin largement utilisé, l’OMS estime qu’approximativement un tiers de la population mondiale est infectée par Mycobacterium tuberculosis, l’agent étiologique de la tuberculose, et qu’environ 2 millions de personnes en meurent chaque année. La compréhension de l’épidémiologie de la tuberculose et les actions de contrôle de la maladie ont été, récemment, compliquées par l’émergence de bacilles tuberculeux résistants aux antibiotiques et par la synergie fournie par la co-infection avec le VIH. Une tendance alarmante pour la santé publique est l’émergence de souches résistantes à plusieurs antibiotiques (multi-résistantes, MDR), définies comme des isolats résistants au moins à l’isoniazide (INH) et la rifampicine (RIF), les deux agents anti-tuberculeux les plus puissants. La sélection de mutants résistants se produit chez le patient lorsque les taux d’antibiotiques présents dans le corps sont sub-thérapeutiques ou lorsque la thérapie est inappropriée. Un des facteurs favorisant est l’exceptionnelle durée de la chémothérapie. Le besoin de maintenir des taux élevés d’antibiotiques pendant des mois, combiné avec la toxicité inhérente des agents, résultent en une observance incomplète du traitement par le patient et le risque d’acquérir des résistances. La résistance aux antibiotiques chez M. tuberculosis résulte d’altérations dans des gènes chromosomiques spécifiques. Les causes génétiques de la résistance ont été définies pour certains antibiotiques bien que plusieurs inconnues persistent. Le présent travail a consisté en l’étude du problème de la résistance aux antibiotiques anti-tuberculeux par différentes approches : l’analyse génétique des mécanismes de résistance, l’évaluation de l’activité thérapeutique de nouvelles molécules et la caractérisation du profil de résistance de souches cliniques. L’acide p-aminosalicylique (PAS) est un antibiotique bactériostatique de deuxième ligne dont le mécanisme d'action sur le bacille tuberculeux est incompris. Récemment, en utilisant la mutagenèse par transposon, la résistance au PAS fut associée à des mutations de la thymidylate synthase encodée par le gène thyA. Suite à cette découverte, nous avons entrepris une étude moléculaire de souches cliniques et de mutants spontanés résistants au PAS. Des mutations du gène thyA furent identifiées chez seulement 37% des souches. En tout, vingt-quatre mutations différentes furent identifiées dans le gène thyA. Les séquences nucléotidiques de cinq autres gènes de la voie de synthèse du folate et de la thymine (dfrA, folC, folP1, folP2, et thyX) ainsi que de 3 gènes encodant des N-acétyltransférases (nhoA, aac1 et aac2) furent également analysées mais aucune mutation associée à la résistance au PAS n’a pu être mise en évidence. L’utilisation de techniques bioinformatiques de prédiction structurelle révèle que les mutations identifiées affectent soit la structure soit le site fonctionnel de ThyA. L’étude des profils de croissance des organismes résistants au PAS nous permit de constater que les organismes porteurs d’une mutation de la protéine ThyA présentent un profil de croissance constant en présence de concentrations croissantes de PAS. Les organismes résistants au PAS possédant une protéine ThyA sauvage répondent, quant à eux, aux concentrations croissantes de PAS de façon dose-dépendante, indiquant que le(s) mécanisme(s) alternatif(s) de résistance au PAS est (sont) dose-dépendant(s). La thymidylate synthase est également une des cibles du 5-fluorouracil (5-FU), l’agent chimiothérapeutique le plus largement utilisé pour le traitement du cancer colorectal avancé. Etant donné l’augmentation du nombre de souches résistantes de M. tuberculosis, de nouveaux composés anti-tuberculeux sont nécessaires de façon urgente. Ici, nous avons évalué l’efficacité in vitro et in vivo du 5-FU sur M. tuberculosis. La concentration minimale inhibitrice du 5-FU fut déterminée sur une collection de souches cliniques sensibles et multi-résistantes ainsi que sur des mutants spontanés résistants au PAS. Tous les isolats montrèrent une sensibilité au 5-FU à des concentrations allant de 0.4 à 1.8 µg/ml, et ce indépendamment de leur profil de sensibilité/résistance aux agents anti-tuberculeux actuels. Les études in vivo du 5-FU (sur un modèle murin de tuberculose active) montrèrent une efficacité de celui-ci durant les deux premières semaines de traitement puis une perte d’activité à la troisième semaine, vraisemblablement engendrée par les effets secondaires du 5-FU. L’éthionamide (ETH) est un autre antibiotique de deuxième ligne dont l’utilisation est limitée aux tuberculoses multi-résistantes étant donné les effets secondaires qu’il engendre. Ces dernières années, les études ont montré que l’ETH est un pro-médicament, transformé en forme active par l’enzyme monooxygénase EthA dont l’expression est contrôlée par le répresseur transcriptionnel EthR. Notre étude décrit l’élaboration d’inhibiteur d’EthR capable d’augmenter la sensibilité de M. tuberculosis à l’ETH suite à l’amélioration de son activation. Les composés synthétisés et sélectionnés pour leur capacité à inhiber l’interaction EthR-ADN furent co-cristallisés avec EthR. Les structures tridimensionnelles des complexes furent utilisées pour la synthèse d’analogues capables d’améliorer la puissance de l’ETH en culture. Les molécules les plus prometteuses furent testées sur un modèle murin de tuberculose. Pour un des inhibiteurs d’EthR testés, nous avons montré que sa co-administration avec l’ETH permet une réduction de la dose d’ETH utilisée de 3 fois, pour l’obtention d’une même réduction de charge mycobactérienne pulmonaire. Ce travail démontre la possibilité d’augmenter l’index thérapeutique de l’éthionamide en agissant pharmacologiquement sur le mécanisme régulateur de son activation. Dans certaines régions du monde, le problème de la multi-résistance devient très présent. Nous avons étudié l’état de la situation à Mourmansk (Fédération russe), une région à haute incidence de tuberculose. La résistance aux antibiotiques et l’épidémiologie moléculaire de la tuberculose furent étudiées sur des isolats collectés en 2003 et 2004 dans cette région. Une extrêmement haute prévalence de tuberculose multi-résistante (MDR-TB) fut constatée à la fois pour les nouveaux cas (primaires) (26%) et les cas précédemment traités (72.9%). Le typage des souches MDR primaires révèle une appartenance au génotype Beijing pour la plupart des isolats (79.8%) et l’homogénéité génétique des souches suggère une transmission active au sein de la population. L’analyse moléculaire des gènes impliqués dans la résistance à l’INH et à la RIF montre la présence des mutations katG codon 315 et rpoB codon 531 chez, respectivement, 98,2% et 76,3% des isolats MDR-TB primaires. La haute fréquence de ces mutations « communes » suggère la possible utilisation de tests moléculaires ciblant spécifiquement ces mutations pour détecter rapidement la plupart des cas de MDR-TB. Nos travaux illustrent les différentes voies à suivre pour maitriser le problème de la résistance aux antibiotiques : l’élucidation des mécanismes de résistance, le développement de nouveaux médicaments et la détection rapide des cas de résistance.

L’ostéomyélite chronique est une infection chronique du tissu osseux et de la moelle. C’est une infection grave du fait de sa localisation au sein d’un tissu profond, de la complexité de sa prise en charge thérapeutique et de la mise en jeu du pronostic fonctionnel. L’incidence de l’ostéomyélite chronique est accrue sur certains terrains (drépanocytose, diabète, et polyarthrite rhumatoïde entre autres). Son traitement classique repose sur un curettage chirurgical associé à une antibiothérapie par voie générale durant au moins 6 semaines. Ce traitement est marqué le plus souvent par des échecs du fait de la difficulté de faire parvenir des antibiotiques à doses efficaces et de manière prolongée ou continue au niveau de l'os infecté. Le but de notre travail était de développer une formulation pharmaceutique biodégradable susceptible de libérer de manière prolongée et in situ au niveau du foyer infectieux l'antibiotique qu’est le sulfate de gentamicine. Cette formulation devait être efficace pour le traitement des ostéomyélites chroniques et présenter une grande innocuité pour le patient. Quatre formulations d’implants à base de sulfate de gentamicine et de monoléine ont été préparées en Salle blanche dont le niveau de contamination particulaire et microbiologique a été conforme aux normes européennes. Ces implants se présentaient sous forme de gels bioadhésifs, d’apparence homogène. Ils se prenaient en masse au contact de l’eau. Des observations au microscope optique, des études de Calorimétrie différentielle à balayage (DSC), de Diffraction des rayons X, de thermogravimétrie, de dosage d’eau (méthode Karl Fischer) des gels ont montré que deux formes de monoléine co-existent dans les gels : monoléine liée à l’eau et monoléine libre; aussi, les gels se présentent sous forme de cristaux liquides. Les tests de dissolution ont montré que seul l’implant renfermant 5% de gentamicine, 80% de monoléine et 15% d’eau a libéré la presque totalité de la gentamicine en continu sur 20 jours. Celui-ci a été sélectionné pour la suite des travaux. Le mécanisme de la libération de l’antibiotique a été celui d’une diffusion contrôlée. Ces implants ont été physiquement instables à 30 °C mais stables lorsqu’ils sont conservés au réfrigérateur (2-6 °C) pendant au moins 10 mois. La cinétique de libération des implants reste inchangée dans les mêmes conditions de conservation (2-6 °C pendant 10 mois). Les essais de stérilité réalisés sur membrane filtrante ont montré que les implants fabriqués étaient stériles. En outre, ils se sont révélés apyrogènes à travers le test LAL (Lysat d’amoebocyte de Limule). Le test de cytotoxicité in vitro (test MTT) des implants a été réalisé en utilisant la méthode de contact direct. Ils n’ont présenté aucune toxicité vis-à-vis des fibroblastes et des macrophages qui ont été utilisées comme cellules tests. Par ailleurs, ils ont été compatibles avec les érythrocytes d’hémoglobine AA ou SS. L’évaluation in vitro de la génotoxicité des implants a été réalisée en utilisant la technique des essais comètes. Ils n’ont présenté aucun potentiel génotoxique. L’infiltration de l’implant (renfermant 5% de gentamicine, 80% de monoléine et 15% d’eau) sous l’aponévrose plantaire des souris n’a pas perturbé les paramètres biologiques du foie et des reins (bilirubinémie libre, bilirubinémie totale, créatininémie) au bout de 52 jours de test. Le métabolisme des triglycérides n’a pas été affecté. Les études histologiques n’ont révélé ni de signes d’inflammation chronique de l’aponévrose, ni de lésions rénales ou hépatiques. Pour l’étude de la tolérance et de l’efficacité de l’implant dans le traitement des ostéomyélites chroniques, une autorisation préalable du Comité d’Ethique pour la Recherche en Santé (CERS) du Burkina Faso a été obtenue. Une cohorte de 19 patients souffrant d’ostéomyélites chroniques et ayant donné son consentement a été incluse dans l’étude. Tous les patients ont bénéficié d’une séquestrectomie accompagnée d’un curetage et d’un comblement de la cavité osseuse avec l’implant. Les signes cliniques, radiologiques et biologiques obtenus après le traitement ont été en faveur d’une guérison des patients traités dans un délai de 30 à 70 jours. Avec un recul de 2 à 12 mois (une médiane de 10 mois), les suivis cliniques, biologiques et radiologiques ont permis de conclure à l’innocuité de l’implant. Un implant à base de monoléine et de gentamicine ayant montré son efficacité et son innocuité dans le traitement des ostéomyélites chroniques a été ainsi développé. Après la réalisation d’un essai clinique multicentrique randomisé, il fera l’objet d’une demande d’Autorisation de Mise sur le Marché./ Chronic osteomyelitis is a chronic infection of bone and its marrow. It is commonly associated with some diseases like sickle cells disease, diabetes, and arthritis. Chronic osteomyelitis treatment is complex, due to the difficulty to achieve therapeutic drug levels at the site of infection by systemic administration. Our objective was to develop a biodegradable implant based on gentamicin and monoolein. It should be able to make a sustained release of the gentamicin in the site of infection. This novel formulation should be biocompatible and efficacious to treat chronic osteomyelitis. Four formulations of implants based on gentamicin and monoolein were made. The final products were homogenous gels, becoming more solid in contact with water. Hot stage microscopy, DSC, thermogravimetric analysis (TGA), X-ray diffraction, and determination of moisture contents (Karl Fischer titration) showed cubic liquid crystalline and eutectic structures of the implants. Only the formulation consisting of 80-15-5% w/w monoolein-water-gentamicin sulfate progressively released the totality of the antibiotic for a period of twenty days without burst effect. This formulation was selected for the following studies. The implants were physically instable at room temperature by stable when they were kept cool (2-6 °C) during at least 10 months. Their in vitro drug release characteristics were not changed in the same conditions (after storage for 10 months at 2 – 6 ° C). The Lysat d’amoebocyte de Limule (LAL) and sterility assays proved that the implants were made according to the Good Laboratory Practice. They were sterile and apyrogen. The MTT and comet assays performed with fibroblasts and macrophages revealed that the implants were non-cytotoxic and were not potentially genotoxic. They were also compatible in vitro with blood erythrocytes. The biocompatibility and toxicity of the implants assessed in vivo revealed that they were well tolerated and had acceptable biocompatibility at long-term. As for clinical assessment of the implants, 19 patients with chronic osteomyelitis caused by a microorganism sensitive to gentamicin were included. After surgical curettage of the infected bone, the dead space was filled in with the implants. To prevent post-operative septicaemia, a systemic antibiotherapy was prescribed for 3 days following the operation. Clinical, biological and radiological follow-up (range from 2 to 12 months) revealed that 18 patients recovered from chronic osteomyelitis (within 30-70 days) without adverse events. The wound of one patient whose bone was exposed did not scar over after 10 months. However, it was no longer infected. Further investigations through randomized multicentric trials will be done in order to obtain trade license.

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Staphylococcus aureus est une bactérie pathogène d’importance pouvant causer une multitude d’infections allant d’infections cutanées à des infections systémiques mortelles. Ce pathogène infecte l’homme ainsi que les animaux comme les porcs, bovins, volailles, etc. Chez les animaux, cette bactérie cause, entre autres, la mammite bovine. Il existe des souches de S. aureus qui sont résistantes à la méthicilline (SARM). Le nombre d’infections reliées aux SARMs est en constante évolution, car en plus de leur forte présence dans les hôpitaux, ces bactéries sont aussi présentes dans la communauté et auprès des animaux d’élevage. En plus de la résistance à la classe antibiotique des ß-lactamines, dont la méthicilline fait partie, plusieurs souches de SARMs sont résistantes à d’autres classes d’antibiotiques (macrolides, fluoroquinolones, aminoglycosides). De plus, plusieurs souches de S. aureus produisent des biofilms, soit des structures qui protègent les bactéries contre plusieurs facteurs de leur environnement. La plupart des antibiotiques sont moins efficaces pour tuer les bactéries se retrouvant dans cette structure. L’inefficacité de la plupart des antibiotiques existants envers ce pathogène demande la recherche de nouvelles classes d’antibiotiques ayant de nouvelles cibles thérapeutiques ce qui permettrait de cibler ce pathogène et de l’éliminer. De récentes recherches ont permis de découvrir une nouvelle classe d’antibiotiques, soit des pyrimidines modifiées, qui sont des ligands spécifiques du riborégulateur guanine, compris dans la classe des riborégulateurs purines. Ces molécules antibiotiques ont une cible très spécifique : elles sont efficaces lorsque le riborégulateur guanine contrôle spécifiquement la transcription du gène guaA, qui code pour la GMP synthétase. La position activée du riborégulateur résulte en la pleine transcription du gène guaA et subséquemment en la synthèse du GMP. Lorsqu’il y a un excès de guanine intracellulaire, ce ligand se lie spécifiquement à l’aptamère en 5’ du riborégulateur provoquant ainsi la formation d’une tige de terminaison qui empêche la transcription de guaA. En fait, chez S. aureus, le riborégulateur guanine contrôle tout l’opéron xpt-pbuX-guaB-guaA. Il a été démontré que la molécule 2,5,6-triaminopyrimidine-4-un (PC1), une pyrimidine modifiée, favorise la conformation terminatrice du riborégulateur guanine et ainsi, l’arrêt artificiel de la transcription de guaA. Par contre, cette molécule n’est pas encore parfaite. Il y a dimérisation en un composé inactif en présence d’oxygène. La suite des efforts de recherche a consisté à produire et identifier de nouvelles molécules de type pyrimidine dérivées de PC1 ou autres analogues de guanine et qui agissent comme antibiotiques en liant le riborégulateur guanine retrouvé chez les staphylocoques. En particulier, nous avons démontré l’efficacité in vitro et in vivo de la molécule GRL-206 contre les infections causées par les SARMs et les souches bovines de S. aureus. En parallèle, l’efficacité de GRL-206 a aussi été testée contre Staphylococcus epidermidis, un staphylocoque à coagulase négative (SCN) produisant des biofilms.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Étude de la Sous-Classe B3 et des Inhibiteurs des Métallo β-Lactamases En raison de l'introduction dagents antibactériens, les bactéries ont développé divers moyens de résistance. Le plus commun, déjà fortement développé, est la production denzymes qui hydrolysent la forme la plus largement répandue d'agent antibactérien, les antibiotiques à noyau β-lactame (Frère 1995). Ces enzymes, appelées β-lactamases, ont deux origines. Les β-lactamases à sérine correspondant aux classe A, C et D auraient évolué à partir dune DD-transpeptidase ancestrale, alors que les métallo β-lactamases (MBLs), nont pour linstant aucun ancêtre connu (Ambler 1980) (Matagne et al. 1999). Les MBLs sont importantes médicalement, puisqu'elles peuvent hydrolyser la plupart des β-lactames, y compris les carbapénèmes, qui échappent à l'activité des enzymes à sérine les plus actives (Rasmussen et al. 1997). Un transfert des MBLs entre espèce est également envisageable, du fait que certains gènes codant pour ces enzymes sont présents sur des plasmides (Osano et al. 1994) (Laraki et al. 1999). Les inhibiteurs classiques des β-lactamases à sérine active ont peu ou pas d'effet sur les MBLs et dans certains cas ils peuvent même être hydrolysés par les MBLs. Les MBLs sont produites, comme les β-lactamases à sérine, dans le périplasme des bactéries Gram-négatives ou sont sécrétées par les bactéries Gram-positives, cependant elles ont un mode d'action différent. À la différence des β-lactamases à sérine qui emploient une sérine dans leur site actif pour hydrolyser le noyau β-lactame, les MBLs utilisent lion zinc (Bush et al. 1995). Puisque ces enzymes ne présentent pas le même besoin en ions zinc pour faire preuve dune activité maximale, un débat continuel est mené afin de savoir si les MBLs utilisent un ou deux ions zinc dans leur site actif in vivo. Les MBLs forment un groupe hétérogène qui a été divisé en sous-groupes B1, B2 et B3 par similitude de séquence et spécificité de substrat (Galleni et al. 2001) (Garau et al. 2004). C'est l'hétérogénéité de cette classe qui a rendu la recherche d'un inhibiteur générique difficile. Divers inhibiteurs de MBLs ont été décrits; ceux-ci incluent le captopril, un inhibiteur compétitif des MBLs qui sest avéré efficace contre les enzymes mono-zinc BcII et CphA (Heinz et al. 2003). L'acide thiomandelique s'est avéré un inhibiteur à large spectre pour le composé racémique, avec des valeurs de Ki en-dessous de 1 µM, pour toutes les enzymes testées des sous-classes B1 et B3; bien qu'il ait été inefficace sur CphA du sous-groupe B2 (Mollard et al. 2001). Les hydrazones de sulfonyle inhibent IMP-1, le plus bas Ki étant de 0.7 µM, mais ont un effet limité sur d'autres enzymes B1 telles que BcII (Siemann et al. 2002). Les acides succiniques substitués inhibent également IMP-1 montrant des valeurs dIC50 impressionnantes mais aucune valeur de Ki nest donnée (Toney et al. 2001). L'incubation de CphA avec les β-lactames, moxalactame et céfoxitine, cause l'inactivation de l'enzyme par les produits de la réaction, mais ces inactivateurs sont des substrats pour les enzymes des sous-classes B1 et B3 (Zervosen et al. 2001). La recherche dinhibiteurs s'est tout naturellement concentrée sur les variants IMP et VIM, qui sont des MBLs portées par un plasmide; pour linstant, aucun inhibiteur identifié nest efficace sur tous les sous-groupes (Jin et al. 2004) (Kurosaki et al. 2005) (Siemann et al. 2002). La première partie de cette étude s'est concentrée sur lidentification de molécules modèles potentiellement inhibitrices de MBLs pouvant être développées en inhibiteurs à large spectre des MBLs. Par le criblage nous avons identifié trois modèles différents susceptibles de donner des inhibiteurs efficaces; lun deux est capable de chélater l'espèce mono-zinc, lacide 2,4 pyridine dicarboxylique; un autre est spécifique de FEZ-1, le N,3-Dihydroxy-5-(4-hydroxybenzoyl) benzamide et le dernier est efficace contre toutes les MBLs testées, lacide [(3-Mercaptopropanoyl)amino](phenyl) propanoic. Les résultats obtenus montrent des constantes dinhibition allant du micromolaire au nanaomolaire. La sous-classe B3 contient la MBL L1, dont le spectre daction est le plus large. Cette enzyme peut hydrolyser un éventail de substrats tel que les pénicillines, les céphalosporines et les carbapénèmes (Crowder et al. 1998). Elle partage le repliement αβ/βα et le site di-zinc des autres MBLs mais cest un tétramère, une caractéristique unique parmi les β-lactamases (Saino et al. 1982) (Bicknell et al. 1985). La forme tétramerique de L1 la rend plus difficile à étudier par des techniques telles que la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire ou la spectrométrie de masse. Par conséquent, pour la deuxième partie de cette étude, nous avons décidé d'étudier L1, visant à trouver les conditions dans lesquelles l'enzyme était présente comme monomère, sans besoin de mutation. Les résultats que nous avons obtenus étaient imprévus et nous ont menés à examiner une méthode de production d'apo-enzyme pour les MBLs. L'enzyme a pu facilement être dénaturée et le zinc être enlevé. L'activité a été trouvée après renaturation suite à l'addition de zinc. Cette étude pourrait être poursuivie à l'avenir, les résultats préliminaires obtenus ici sont peu concluants, mais présentent un intérêt cinétique ainsi quun bénéfice à l'étude des MBLs commencée dans ce travail. Le nombre de MBLs connues augmente constamment et la caractérisation de chaque enzyme doit être accomplie pour gagner une pleine compréhension des β-lactamases, afin quil reste un espoir d'empêcher la diffusion supplémentaire de la résistance bactérienne. Pour cette raison le but de la troisième partie de cette étude était de caractériser plus profondément la MBL, GOB-1 de Chryseobacterium meningosepticum. L'analyse de sa séquence en acides aminés, par Bellais et al. 2000 place GOB-1 dans la sous-classe B3 en dépit de son unique résidu liant le zinc Gln116. Nous avons produit GOB-1 en utilisant un vecteur d'expression basé sur le système dexpression du phage T7 et avons purifié l'enzyme. Des mutants de GOB-1 ont été créés par mutagénèse dirigée du résidu liant le zinc Gln116. Une étude cinétique détaillée a alors été réalisée en présence et absence de zinc additionnel montrant que GOB-1 est une enzyme très efficace, capable dhydrolyser efficacement tous les β-lactames testés. Les mutants du résidu Gln116 de GOB-1, produits par mutagénèse dirigée ont montré une perte d'activité qui ne peut pas être corrigée par addition de zinc, démontrant ainsi que GOB-1 n'est pas une enzyme hybride des sous-classes B2 et B3, comme cela avait été précédemment suggéré (Garau et al. 2004), mais plutôt une enzyme nouvelle et améliorée de la sous-classe B3, utilisant les dispositifs structuraux précédemment utilisés par les enzymes de la sous-classe B2 mais en améliorant l'effet.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

La fibrose kystique est une maladie génétique et transmissible qui affecte particulièrement les fonctions respiratoires des patients atteints. Ce déclin du système respiratoire est entre autres le résultat de la présence de différents pathogènes causant des infections. Staphylococcus aureus est l'un des pathogènes les plus fréquemment retrouvés dans cet environnement. Ce pathogène pouvant être associé à différents types d'infections chez l'être humain, utilise différentes stratégies qui lui permettre [i.e. permettent] de tirer avantage des multiples environnements où il peut se retrouver. L'une de ces stratégies est d'adopter un phénotype particulier nommé : small-colony variant (SCV). Le profil transcriptionnel particulier des SCVs tend à les associer aux infections de type chronique. De plus, la résistance accrue aux aminoglycosides aussi bien qu'aux inhibiteurs de la voie des folates font des SCVs des pathogènes plus difficiles à éliminer par les traitements conventionnels. Malgré le fait que nos connaissances sur les SCVs ne cessent d'augmenter, les facteurs sous-jacents à leur présence dans certaines pathologies comme celle retrouvée chez les patients fibro-kystiques sont encore mal définis. Il est connu que certains facteurs tels que des antibiotiques et des exoproduits bactériens favorisent leur présence in vitro. Cependant, l'impact in vivo de ces facteurs ainsi que le rôle que jouent les infections à S. aureus chez ces patients ne sont toujours pas bien compris. Les projets présentés dans ce travail ont pour but de mieux caractériser les infections à S. aureus et plus particulièrement celles produites par les SCVs chez les patients atteints de cette maladie. Le premier volet est une étude clinique qui a permis de faire le constat de l'importante proportion d'isolats de S. aureus portant des résistances à différents antibiotiques cliniquement utilisés. Bien qu'aucun facteur environnemental n'ait pu être mis en cause pour la présence de SCVs, leur capacité à produire plus de biofilm ainsi que leur sensibilité réduite aux aminoglycosides a été mise en évidence. Malgré ces caractéristiques inquiétantes, les résultats de cette étude pilote semblent montrer que la présence de S. aureus et des SCVs à [i.e. a] peu d'impact sur les fonctions respiratoires des patients comparativement à P. aeruginosa. Cependant, il n'est pas exclu que la présence de S. aureus et des SCVs ait un effet important sur l'incidence de P. aeruginosa et les interactions bactériennes pouvant modulées [i.e. moduler] la santé des patients. Dans cette optique, le deuxième projet à [i.e. a] permis de mieux comprendre les mécanismes qu'utilisaient S. aureus lui permettant, face à la présence de P. aeruginosa, de passer au phénotype SCV. Ce projet connexe a démontré l'importance du facteur alternatif sigB dans le mécanisme d'acquisition du phénotype SCV en réponse au HQNO, un exoproduit de P. aeruginosa. Il a également permis de mieux comprendre les effets transcriptionnels de cette molécule sur S. aureus ainsi que son impact global sur la production de biofilm. Ces travaux ont contribué à mieux comprendre les infections bactériennes, en grande partie responsables de la diminution des fonctions respiratoires chez les patients atteints de la fibrose kystique. Éventuellement, ces travaux pourront permettre de mieux gérer ces infections et d'améliorer ainsi la qualité de vie des personnes aux prises avec cette pathologie, encore incurable.

Les résidus d'antibiotiques et de psychotropes sont déversés dans l'environnement, en conséquence d'une utilisation massive et souvent inadaptée de ces substances dans les domaines médicaux et vétérinaires et d’une métabolisation incomplète dans l’organisme. Les eaux de surface et les eaux souterraines sont les réceptacles majeurs de ces polluants et représentent également les sources d'eau utilisées pour la consommation humaine. Notre recherche s’est focalisée sur la phototransformation et l’oxydation par le chlore et le peroxyde d’hydrogène de quatre composés : deux antibiotiques et deux psychotropes : sulfaméthazine, sulfaméthoxypyridazine, amitriptyline et clomipramine). Ces deux derniers processus sont utilisés fréquemment dans les filières de traitement de l’eau.D’abord, une étude cinétique nous a permis à déterminer des constantes cinétiques. Pour chaque composé, une dégradation plus ou moins rapide a été observée suivant le procédé de photolyse ou d’oxydation employé. L’étude cinétique a été appliquée également sur des eaux naturelles pour prévoir le devenir des composés pharmaceutiques et estimer leur dégradation après photoréaction et chloration. Puis, de nombreux sous produits de chloration et de photolyse ont été identifiés par LC/MS/MS et des mécanismes réactionnels ont été proposés. / Antibiotics and psychiatrics residues are dumped into the environment due to their massive and inappropriate use in human and veterinary medicine either to an incomplete metabolism into organism. Surface waters and ground waters are the major receptacles of these pollutants and also represent sources of water used for human consumption. This study was specifically focused on photolysis of four pharmaceuticals compounds: two antibiotics and two psychiatrics (sulfamethazine, sulfamethoxypyridazine, amitriptyline and clomipramine) also on their oxidation by chlorine and hydroxyl radicals, two processes mainly used in water treatment.First, kinetic studies were conducted and rate constants were determined. For each pharmaceutical, different rates of degradation were observed depending on photolysis or oxidation process. To better assess pharmaceutical removal under water treatment conditions, an estimation of pharmaceutical removal in natural water was undertaken. Secondly, several degradation products formed during chlorination and photolysis were identified by LC/MS/MS and degradation pathways were proposed

Les Streptocoques Béta-hémolytiques du groupe A (GAS) sont responsables de manifestations cliniques variées et de séquelles non suppuratives comme notamment le rhumatisme articulaire aigu (RAA). Les affections sévères à GAS tuent plus de 500.000 personnes chaque année. Le pouvoir pathogène du GAS est encore mal compris. Il semble être notamment lié à la présence de nombreux gènes codant pour des facteurs de virulence dans le génome du GAS, dont celui codant la protéine emm. La protéine transmembranaire M joue un rôle essentiel dans la virulence du GAS. Le typage moléculaire des GAS se base sur la séquence de la partie hypervariable de ce gène (emm-typing). L’épidémiologie du GAS semble varier au cours du temps et en fonction de la localisation géographique et/ou du contexte socio-économique. Cependant, les différences dans les critères d’inclusion des différentes études épidémiologiques disponibles dans la littérature rendent les comparaisons difficiles. Pour mieux évaluer ces variations, nous avons mené une analyse prospective de l’épidémiologie clinique et moléculaire d’isolats de GAS provenant d’enfants présentant une infection à GAS, simultanément en deux localisations géographiques différentes (Bruxelles et Brasília, Brésil). Un des points importants de notre étude a été la mise en évidence de la diversité génétique de la protéine M des isolats belges et brésiliens. Alors que de nombreux emm-types différents sont retrouvés à Brasília (48 emm-types sur 128 isolats), ceux retrouvés à Bruxelles sont relativement peu nombreux (20 emm-types sur 200 isolats) et sont ceux communément retrouvés dans les pays industrialisés. Afin de mieux comprendre les bases moléculaires de cette différence, une analyse phylogénétique basée sur la quasi-totalité de la séquence de la protéine M exposée à la surface de la bactérie a été réalisée. Cette analyse a permis de montrer que les emm-types belges sont génétiquement éloignés les uns des autres alors que les emm-types brésiliens sont génétiquement plus proches. De manière intéressante, cette analyse a montré que les souches belges présentent une grande diversité au niveau de la région de la protéine M dite ‘constante’. En conséquence, la diversité génétique globale des protéines M belges et brésiliennes est similaire, mais elle se situe dans des régions différentes de la protéine M, ce qui pourrait indiquer l’existence de pressions de sélection différentes entre les deux pays. D’un point de vue vaccinal, ces résultats indiquent qu’un vaccin dirigé contre certaines des parties constantes de M présenterait une bonne couverture théorique dans les deux pays. Par contre, le vaccin 26-valent, en cours d’évaluation clinique, aurait une couverture théorique de 76% à Bruxelles et de 32% à Brasília. Notre analyse phylogénétique a également permis de montrer que la non-sensibilité à la ciprofloxacine (observée dans 22,5 % et 9% des souches belges et brésiliennes respectivement) survient dans des souches génétiquement éloignées, contrairement à ce qui est proposé actuellement dans la littérature. De plus, nous avons mis en évidence un polymorphisme au sein des gènes codant les topoisomérases cibles de la ciprofloxacine. L’identification de mutations responsables du phénotype de non-sensibilité nécessite par conséquent une confirmation expérimentale. Les manifestations cliniques sont assez différentes entre Bruxelles et Brasília. Les infections cutanées sont beaucoup plus fréquentes à Brasília. De manière intéressante au Brésil, des souches de GAS présentant un tropisme cutané sont isolées du pharynx. Ces souches ‘cutanées’ pourraient avoir acquis des déterminants génétiques leur permettant de se développer dans des tissus pharyngés. De plus, ces résultats pourraient remettre en question le postulat que seules les souches de tropisme pharyngé sont impliquées dans le développement du RAA. D’autres études épidémiologiques dans des pays où le RAA est endémique devront être réalisées afin de préciser nos résultats et de mieux comprendre les mécanismes moléculaires menant au développement du RAA. Cependant, étant donné la prévalence du RAA et l’accès limité au diagnostic microbiologique des pharyngites dans le réseau public de soins au Brésil, nous avons développé un score clinique permettant de limiter les traitements antibiotiques chez les enfants probablement atteints de pharyngites virales. L’utilisation de ce score permettrait de réduire le nombre de prescriptions antibiotiques dans les pharyngites de l’enfant de 41 à 55% à Brasília. Le choc toxi-infectieux est une pathologie relativement rare et le RAA n’est quasi plus décrit dans les pays développés. Cependant, deux nourrissons ont présenté un choc toxi-infectieux suivi d’un RAA (HUDERF, Bruxelles). A notre connaissance, cette association clinique n’a jamais été décrite. L’analyse de ces deux cas du point de vue de la virulence bactérienne a révélé la présence de nombreux gènes de facteurs de virulence, portés par des phages et différents dans les deux souches. Nos résultats illustrent la complexité de la relation hôte-pathogène. La capacité des bactéries à s’adapter à leurs hôtes et à causer des pathologies dépend de nombreux facteurs, qui varient d’un isolat à l’autre, et dont l’importance varie d’un hôte à l’autre. Notre travail a permis d’exemplifier la diversité génétique des GAS, aussi bien au niveau du gène emm qu’au niveau des facteurs de virulence, et de l’implication de ceux-ci dans le développement de pathologies streptococciques rares.