Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Dérivé des deux termes grecs « anti » et «biotikos », le terme antibiotique signifie « contre la vie ». Les antibiotiques attaquent et détruisent les bactéries vivantes et les empêchent de se multiplier dans l'organisme humain. Depuis leur première utilisation, tout un arsenal d'antibiotiques a été développé pour le traitement de diverses infections chez l'humain. L'utilisation à profusion, et dans certains cas à outrance des antibiotiques pour le traitement des infections microbiennes, a permis à certaines souches bactériennes d'acquérir une résistance à ces médicaments. Dans cette optique une alternative aux antibiotiques s'impose de plus en plus. La première étape de nombreuses infections bactériennes est la colonisation des surfaces épithéliale de l'hôte. L'adhésion est médiée par des structures présentes à la surface de la cellule bactérienne, appelées adhésines, qui interagissent avec des composants présents à la surface de la cellule hôte ou à hauteur de la matrice extra-cellulaire, appelés récepteurs. Les lectines sont les adhésines bactériennes les plus étudiées. De nature protéique, elles ont été classées en différents groupes sur la base de leurs propriétés d'hémagglutination, leurs ultrastructures et leurs spécificités de récepteurs. Les lectines du premier groupe sont responsables d'hémagglutination sensible au mannose et présentent une structure de nature fimbriaire (fimbriae de type 1, FimH). Les futures stratégies thérapeutiques résident probablement dans l'utilisation de diverses adhésines, comme cibles thérapeutiques ou comme porteur d'épitopes étrangers, afin de produire des anticorps contre différents facteurs de virulence. Utilisant de nouvelles méthodes de C-glycosidations combinées à la 'click chemistry' une série de C-mannosides a été synthétisée. Le potentiel d'inhibition de l'adhésion du FimH de ses glycomimétiques apportera de précieuses informations dans le cadre d'une grande étude relation-structure-activité (QSAR). ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Antibiotique, Adhésion, Lectine, FimH, C-glycosidation, Click chemistry.

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste responsable de nombreuses maladies nosocomiales ainsi que d'infections graves chez les patients atteints de mucoviscidose ou chez immunodéprimés. La résistance aux antibiotiques observée chez de nombreuses souches fait de cette bactérie un pathogène difficile à éradiquer. Sa capacité à former un biofilm renforce en particulier cette résistance. Au cours de son processus infectieux, la bactérie utilise des lectines qui lui permettent de reconnaitre et de fixer spécifiquement les oligosaccharides présents en particulier sur les cellules hôte. Parmi elles, sont retrouvées la lectine soluble PA-IL (lectine à galactose) ainsi qu'une lectine fimbriale nouvellement identifiée, CupB6. Ces protéines seraient impliquées dans l'adhésion aux tissus de l'hôte et dans l'élaboration du biofilm. Nos travaux portent sur l'étude biochimique et structurale de ces deux lectines. Par des techniques de microcalorimétrie, de résonance plasmonique de surface et de cristallographie aux rayons X, le site de liaison du sucre de PA-IL a été parfaitement caractérisé, et de nombreux inhibiteurs dérivés du galactose ont pu être testés. D'autre part, nous avons exprimé Cup6 sous forme recombinante et nous avons étudié sa spécificité. Nos études ont montré que le sucre reconnu pourrait être le Lewis b et des études structurales sont en cours. Ces travaux s'inscrivent dans l'optique d'élaborer des glycomimétiques qui pourraient apporter une alternative aux antibiotiques.

F1651, les pili Pap et l’antigène CS31A associé aux antigènes de surface K88 sont tout trois des membres de la famille de type P des facteurs d’adhérence jouant un rôle prépondérant lors de l’établissement d’une maladie causée par des souches Escherichia coli pathogènes, en particulier des souches d’E. coli pathogènes extra-intestinales (ExPEC, Extra-intestinal pathogenic E. coli). Leur expression est sous le contrôle d’un mécanisme de régulation transcriptionnel dépendant de l’état de méthylation de l’ADN, résultant dans l’existence de deux populations définies, l’une exprimant l’adhésine (population ON) et l’autre ne l’exprimant pas (population OFF). Malgré de fortes identités de séquences, ces trois systèmes diffèrent l’un de l’autre, principalement par le pourcentage de cellules ON rencontrées. Ainsi, quand CS31A est systématiquement orienté vers un état considéré comme OFF, F1651 présente une phase ON particulièrement élevée et Pap montre deux états OFF et ON bien distincts, selon le phénotype de départ. La protéine régulatrice sensible à la leucine (Lrp, Leucine-responsive regulatory protein) joue un rôle essentiel dans la réversibilité de ce phénomène épigénétique et il est supposé que les différences de séquences au niveau de la région régulatrice modifient la localisation à ces sites de fixation de Lrp; ce qui résulte, en final, aux différences de phase existant entre CS31A, F1651 et Pap.À l’aide de divers techniques parmi lesquelles l’utilisation de gènes rapporteurs, mutagénèses dirigées et d’analyse des interactions ADN-protéines in vitro, nous montrons dans ce présent projet que la phase OFF prédominante chez CS31A est principalement due à une faible interaction de Lrp avec la région distale de l’opéron clp, et que la présence d’un homologue du régulateur local PapI joue un rôle également clef dans la production de CS31A. Dans le cas de F1651, nous montrons dans cette étude que le taux élevé de cellules en phase ON est dû à une altération dans le maintien de Lrp sur les sites répresseurs 1-3. Ceci est dû à la présence de deux nucléotides spécifiques, situé de part et d’autre du site répresseur 1, qui défavorisent la fixation de Lrp sur ce site précis. Tout comme dans le cas de CS31A, la formation d’un complexe, activateur ou répresseur de la phase ON, dépend également de l’action de du régulatuer local FooI, qui favorise alors le déplacement de Lrp des sites répresseurs 1-3 vers les sites activateurs 4-6. / F1651, the pyelonephritis-associated pili (Pap) and the K88-related surface antigen CS31A are three members of the type P family of adhesive factors that play a key role in the establishment of disease caused by Extra-intestinal Escherichia coli (ExPEC) strains. They are all under the control of methylation-dependent transcriptional regulation that defines the number of fimbriated (ON) and afimbriated (OFF) cells within a clonal population. Despite a high similarity in DNA sequence, these three adhesive systems nonetheless differ in the ratio of ON cells. While CS31A is always turned toward the OFF state, F1651 presents a particularly high level of ON cells and Pap shows two distinct OFF and ON states, depending on the starting phenotype. The leucine-responsive regulatory protein (Lrp) plays an essential role in the reversibility of this epigenetic switch and it is believed that the difference in nucleotides within the regulatory region of each operons could modify the binding of Lrp and, in turn, CS31A, Pap and F1651 phase variation. Using a variety of techniques including gene expression, site-directed mutagenesis, and in vitro protein–DNA interaction analysis, we demonstrate that the preferential OFF state observed in CS31A-positive cells is mainly due to a weak interaction of Lrp with the clp distal region and that the presence of a PapI homologue within the cell plays a key role in CS31A production. For F1651, we show in this study that the high level of ON cells found during F1651 phase variation is due to an altered stability of the DNA complex formed by Lrp at its repressor binding sites 1-3. Again, after each cell cycle, complex formation is modulated by the local regulator FooI (homologue to PapI) which promotes the transit of Lrp toward its activator binding sites 4-6. Furthermore, we identify two nucleotides (T490, G508) surrounding the Lrp-binding site 1 that are critical to maintaining a high OFF to ON switch rate during F1651 phase variation, as well switching Pap fimbriae toward the OFF state.

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Les Escherichia coli pathogènes extra-intestinaux (ExPEC) sont responsables d’une grande variété de maladies. Plus particulièrement, certaines souches ExPEC, du sous-groupe d’E. coli uropathogènes, sont porteuses de fimbriae de type P. Cette famille d’adhésines est soumise à une régulation transcriptionnelle appelée variation de phase; un mécanisme du tout ou rien. Il s’agit d’une compétition entre deux protéines régulatrices : la Dam méthylase et la nucléoprotéine Lrp. Ce mécanisme est aussi soumis à l’influence des régulateurs locaux PapB et PapI, deux régulateurs essentiels. Afin d’étudier PapI et ses homologues ainsi que leur impact sur la variation de phase des fimbriae F1651, Pap et CS31A. Grâce à une fusion chromosomique entre la région régulatrice de clp et les gènes lacZYA, nous avons étudié l’effet, en trans, de PapI et FooI qui ont pu restaurer la variation de phase avec une forte tendance pour la phase OFF. Pour étudier l’action de ces protéines sur foo et pap, nous avons utilisé un système utilisant gfp comme gène rapporteur de l’activité des promoteurs des opérons pap et foo. Cela a permis d’observer la variation de phase au niveau cellulaire par cytométrie en flux et en temps réel par microscopie à fluorescence. Ces expériences ont confirmé que la population de cellules F1651 positives a un phénotype d’expression de F1651 partielle alors que les cellules Pap sont en majorité en phase OFF. PapI et FooI n’ont pas la même influence sur la variation de phase, puisque FooI favorise une plus grande fréquence de variation de phase. / Escherichia coli extra-intestinal pathogenic (ExPEC) are responsible for a wide variety of diseases. Particularly ExPEC strains from the subset called uropathogenic E.coli (UPEC) are carrying fimbriae type P. This adhesin family is subject to transcriptional regulation called phase variation, an all or nothing mechanism. It is a competition between two regulatory proteins: the Dam methylase and the nucleoprotein Lrp. This mechanism is also under the influence of the local regulators PapB and PapI. These two regulators are essential to the phase variation. We therefore sought to investigate PapI and its homologs and their impact on the phase variation of fimbriae F1651, Pap, and CS31A. By means of a chromosomal fusion between the regulatory region of clp gene and lacZYA, we studied the effect in trans of PapI and FooI which could restore the phase variation with a strong tendency to phase OFF. To study the action of PapI and FooI, we used a system with gfp as a reporter gene in operons pap and foo. This allowed the observation of the phase variation at the cellular level by flow cytometry and real-time fluorescence microscopy. These experiments confirmed that the population of F165 positive cells have a partial expression state whereas Pap cells mostly have an OFF expression state. We also confirmed that FooI and PapI do not have the same influence on phase variation and that FooI promotes greater frequency of phase variation.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Les infections ostéo-articulaires (IOA) regroupent plusieurs entités cliniques hétérogènes ayant en commun l'invasion et la destruction progressive des tissus osseux et cartilagineux par un ou plusieurs micro-organismes. Le genre Staphylococcus, impliqué dans plus de 65% des IOA, représente la première étiologie dans ces infections particulièrement sévères et difficiles à traiter. Les Staphylococcus non-aureus (SNA) incluant des espèces tels que Staphylococcus epidermidis sont responsables de près de 40% de certaines formes cliniques notamment les IOA sur matériels. Contrairement à S. aureus, pour lequel les mécanismes physiopathologiques incluent : (i) la capacité d'internalisation dans les cellules de l'hôte et (ii) la formation de biofilm, peu de données sont disponibles concernant ceux impliqués dans les IOA dues aux SNA. Dans ce contexte, mon travail de doctorat s'est attaché à caractériser les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la genèse des IOA causées par différentes espèces de SNA. A l'aide d'une approche in silico puis in vitro conduite dans un modèle d'invasion d'ostéoblastes humains, nos travaux ont mis en évidence une capacité d'internalisation et de persistance dans les cellules osseuses pour seulement deux espèces (S. pseudintermedius et S. delphini) sur les 17 testées. De façon similaire à S. aureus, le processus d'invasion cellulaire pour ces espèces fait intervenir une liaison tripartite entre les adhésines bactériennes liant la fibronectine (FnBPs), la fibronectine de la matrice extracellulaire et l'intégrine cellulaire α5β1. Un autre point essentiel de ce travail est la mise en évidence du phénotype hautement cytotoxique de l'espèce S. pseudintermedius après internalisation dans les cellules hôtes. Nous démontrons ici que cette cytotoxicité est, au moins en partie, médiée par une action combinée de (i) la leucocidine Luk-I (toxine homologue de la leucocidine Panton-Valentine de S. aureus) qui cible spécifiquement les cellules immunitaires exprimant le récepteur CXCR2 (récepteur 2 à l'interleukine 8) et (ii) les phénol-soluble modulins (PSMs) qui perturbent les membranes des cellules immunes et non immunes. Sachant que les SNA sont les agents infectieux les plus incriminés dans les IOA sur matériel, une technique d'étude du biofilm sur biomatériaux orthopédiques (acier inoxydable, titane et polyéthylène) a été mise au point pour étudier le biofilm mature formé par les six espèces SNA les plus prévalentes dans les IOA (S. epidermidis, S. lugdunensis, S. heamolyticus, S. warneri, S. caprae, S. capitis). A l'exception de S. epidermidis qui forme plus de biofilm sur le polyéthylène, constituant placé à l'interface des pièces métalliques et/ou des os dans les prothèses orthopédiques, aucune différence significative n'a été observée entre les trois biomatériaux orthopédiques pour l'ensemble des espèces de SNA testées. Néanmoins, nos observations indiquent une forte hétérogénéité au sein des SNA en matière de capacité à former un biofilm mature. Les espèces telles que S. capitis et S. lugdunensis se distinguent significativement de S. haemolyticus et S. warneri par leurs aptitude à former plus de biofilm. La grande diversité des phénotypes observés vis-à-vis des mécanismes physiopathologiques impliqués lors des IOA par les différentes espèces de SNA testées démontre qu'il ne faut pas considérer les SNA comme une entité clinique unique. L'amélioration des connaissances apportées au cours de ce travail devraient contribuer à l'optimisation de la prise en charge chirurgicale, médicale, et thérapeutique des patients / Bone and joint infections (BJI) include several heterogeneous clinical entities that share the invasion and the progressive destruction of bone and cartilage tissue by one or more microorganisms. The genus Staphylococcus, involved in over 65% of the BJI, represents the first etiology in these particularly severe and difficult-to-treat infections. Staphylococcus non-aureus (SNA), including species such as Staphylococcus epidermidis, are responsible for nearly 40% of some clinical forms, including device-associated BJI. In contrast to S. aureus, for which pathophysiological mechanisms include (i) internalization capacity in host cells and (ii) biofilm formation, few data are available regarding those involved in BJIs due to SNA. In this context, my PhD work focused on characterizing the pathophysiological mechanisms involved in the genesis of BJI caused by different SNA species. Using an in silico together with an in vitro approach conducted in a human osteoblast invasion model, our work revealed an ability to internalize and persist in bone cells for only two species of SNA out of the 17 tested. Indeed, we have been able to demonstrate that only S. pseudintermedius and S. delphini have the ability to invade the cytoplasmic compartment of the host cells. Similar to S. aureus, the cellular invasion process for these species involves a tripartite association between bacterial adhesins fibronectin-binding proteins (FnBPs), fibronectin of the extracellular matrix, and α5β1 cell integrin. Another key point of this work is the demonstration of the highly cytotoxic phenotype of the S. pseudintermedius species after internalization in the host cells. We demonstrate here that this cytotoxicity is, at least in part, mediated by a combined action of (i) the Leukocidin Luk-I (homologous to S. aureus Panton-Valentine Leukocidin) that specifically targets immune cells expressing the CXC chemokine receptor 2 (CXCR2) with (ii) phenol-soluble modulins (PSMs) that disrupt the membranes of immune and non-immune cells. Knowing that SNA are the most incriminated infectious agents in device-associated BJI, a technique for studying biofilm on orthopedic biomaterials (stainless steel, titanium and polyethylene) has been developed to study the mature biofilm formed by the six SNA species with the highest prevalence in BJI (S. epidermidis, S. lugdunensis, S. heamolyticus, S. warneri, S. caprae, S. capitis). With the exception of S. epidermidis, which forms more biofilm on polyethylene (constituting at the interface of metal parts and / or bone in orthopedic prostheses), no significant difference was observed between the three orthopedic biomaterials for all the SNA species tested. The great diversity of phenotypes observed with respect to the pathophysiological mechanisms involved in BJI by the different SNA species tested demonstrates that SNA should not be considered as a single clinical entity. Improved knowledge provided during this work should contribute to the optimization of the surgical management, medical and therapeutic patient

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

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