Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont réfractaires à l'application efficace des méthodes structurales pour étudier la structure 3D du complexe récepteur-ligands. Nous présentons une nouvelle méthode basée sur l'analyse de l'interaction ligand-RCPG à différentes températures avec le photomarquage par affinité exploitant des ligands contenant le photomarqueur pBenzoyl-L-phénylalanine (Bpa). Cette approche nous a permis de générer un modèle du complexe du récepteur d'angiotensine H de type 1 (hAT [indice inférieur 1] ) avec le [Sar [indice supérieur 1] , Bpa [indice supérieur 8] AngII à plus haute résolution et aussi d'identifier des différences conformationnelles entre la forme active et la forme inactive du récepteur. Notre laboratoire a démontré que la position 8 du [indice supérieur 125] I-[Sar [indice supérieur 1] , Bpa [indice supérieur 8] AngII formait un lien covalent avec le domaine transmembranaire 7 (DTM7) dans hAT [indice inférieur 1] . Le Bpa, qui a une sélectivité réactionnelle pour les méthionines (Met), était ambigue dans son rayon d'action variable. Néanmoins, cette sélectivité a permis d'élaborer l'essai de proximité aux Met (MPA). La température de photomarquage a été subséquemment identifiée comme un facteur important à contrôler dans les études de photomarquage. En étudiant ainsi les mutants Met positifs en MPA du récepteur hAT 1 , nous avons observé des changements importants lors de l'interaction ligand-récepteur en fonction de la température. A basse température, les fluctuations conformationnelles du complexe ligand-récepteur sont minimisées. Inversement, à 37 [degrés Celsius], le complexe démontre une flexibilité structurale très importante.Les analyses de ces résidus photomarqués suivis d'une digestion au CNBr'démontrent que l'accessibilité aux Met augmente proportionnellement avec la température. Ensuite, en photomarquant le mutant constitutivement actif, le N111G-hAT [indice inférieur 1] , nous pouvons comparer les différences entre une forme basale et une forme plus active du récepteur.Les résultats sont quantifiés en un ratio du marquage Met/DTMVII et ceci nous donne un indice d'accessibilité entre le ligand et le résidu muté dans hAT [indice inférieur 1] . Nous avons observé des différences thermodépendantes entre ces ratios d'accessibilités des mutants X[arrow right]Met et N111G/X[arrow right]Met. Ces ratios d'accessibilités ont été transformés en distance et insérés comme contraintes dans la modélisation moléculaire par refondu simulée. Nous voyons dans le récepteur un éloignement du haut du DTMVI, un rapprochement du DTMII et V et un petit déplacement du DTMIII lors de l'activation.Les différences dans les structures sont à la base des mécanismes d'activations d'hAT [indice inférieur 1] et des RCPGs en général.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Suite à l'observation d'une différence de rendement de photomarquage entre le récepteur AT[indice inférieur 1] humain (hAT[indice inférieur 1]) marqué avec un agoniste et un antagoniste, nous avons voulu identifier le point de contact entre le récepteur et la position 3 du ligand en fonction de l'état d'activation du récepteur ou de l'activité intrinsèque du ligand. Pour ce faire, nous avons utilisé deux analogues de l'angiotensine II, le [Sar[indice supérieur 1] Bpa[indice supérieur 3]] Ang II, un agoniste partiel, et le [Sar[indice supérieur 1] Bpa[indice supérieur 3] Ile[indice supérieur 8]] Ang II, un antagoniste et la méthode de photomarquage par affinité. Les analogues ont une forte affinité pour le récepteur hAT[indice inférieur 1]-WT avec des K[indice inférieur d] respectifs de 1,2nM et 0,7nM. De plus, pour travailler avec différents états d'activation du récepteur nous avons utilisé les récepteurs mutants constitutivement actifs hAT[indice inférieur 1]-N111G et hAT[indice inférieur 1]-N111G-I172M produits par mutagenèse dirigée, le récepteur de type sauvage (hAT[indice inférieur 1]-WT) et un récepteur constitutivement inactif hAT[indice inférieur 1]-N111W. À l'aide des analogues monoiodés ([indice supérieur 125]I-[Sar[indice supérieur 1] Bpa[indice supérieur 3]] Ang II et [indice supérieur 125]I-[Sar[indice supérieur 1] Bpa[indice supérieur 3] Ile[indice supérieur 8]] Ang II), nous avons spécifiquement photomarqué le récepteur hAT[indice inférieur 1]-WT et les différents mutants transfectés dans des cellules COS-7. L'étude des rendements de photomarquage a démontré un meilleur rendement avec le ligand [Sar[indice supérieur 1] Bpa[indice supérieur 3] Ile[indice supérieur 8]] Ang II pour le récepteur hAT[indice inférieur 1]-WT. Le récepteur mutant hAT[indice inférieur 1]-N111G ne voyait pas de différence entre les deux ligands et avait un rendement très élevé, il en était de même pour le récepteur mutant hAT[indice inférieur 1]-N111W. Ainsi, l'état d'activation du récepteur ne changerait pas la proximité du résidu 3 et de son contact. Alors le contact serait peut-être réorienté. Pour déterminer cette région, nous avons fait l'analyse des complexes covalents séparés sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) qui a révélé une bande radioactive de poids similaire pour tous les récepteurs correspondant à la masse relative apparente d'environ 100 kDa. Les complexes marqués ont ensuite subi diverses digestions pour déterminer la région de contact entre la 3[indice supérieur e] position de l'Ang II et les différents récepteurs mutés. Suite à ces digestions nous avons été en mesure de conclure que la région de contact se situait entre N[indice supérieur 168]-E[indice supérieur 173]. Afin de vérifier si la région de contact était la même pour le récepteur hAT[indice inférieur 1]-WT et le récepteur mutant hAT[indice inférieur 1]-N111G nous avons déterminé s'il y avait une monopolisation du marquage, qui est un indice de proximité du point de contact. Ces résultats permettent de conclure que la région de contact entre la position 3 de l'angiotensine II et le récepteur hAT[indice inférieur 1] activé est la même que pour le récepteur inactivé. Ainsi, peu de mouvements seraient observés dans cette région lors de l'activation du récepteur.

Au cours des dernières décennies, la méthylation de l'ADN en position 5 de la cytosine est apparue comme une importante modification épigénétique qui joue un rôle essentiel dans le contrôle spécifique de l'expression des gènes. Cependant, les mécanismes impliqués dans la régulation de la méthylation de l'ADN restent incompris. Des études récentes ont montré que des protéines de type oxydases, nommées TET, peuvent catalyser l'oxydation de la 5-méthylcytosine (5mC) et générer des dérivés oxydés de celle-ci ce qui soulève la question du rôle biologique des formes oxydées de la 5mC. L'identification et la caractérisation des protéines interagissant avec ces formes oxydées devraient permettre une meilleure compréhension de la fonction de ces modifications de l'ADN et de la régulation de la méthylation de l'ADN. Dans ce projet, nous avons développé des sondes photoactivables basées sur l'ADN pour capturer, isoler et caractériser les protéines associées à ces modifications épigénétiques de l'ADN. Tout d'abord, nous avons conçu et évalué les propriétés de différentes sondes oligonucléotidiques photoactivables. Nous avons ensuite réalisé une étude méthodologique afin de caractériser au niveau moléculaire les photoadduits obtenus par MALDI-TOF. Enfin, nous avons développé une méthode de pull-down couplé à du photomarquage et associée à une analyse protéomique par spectrométrie de masse afin d’identifier les protéines ayant une affinité spécifique pour ces modifications épigénétiques. / Over the past few decades, DNA methylation at the 5-position of cytosine has emerged as an important epigenetic modification that plays essential roles in the specific control of gene expression. However, the mechanisms involved in the regulation of DNA methylation remain unclear. Recent studies have shown that oxidase proteins, called TETs, can catalyze the oxidation of 5-methylcytosine (5 mC) and generate oxidized derivatives thereof, raising the question of the biological role of the oxidized forms of 5mC. The identification and characterization of proteins interacting with these oxidized forms should allow for a better understanding of the function of these DNA modifications and the regulation of DNA methylation.In this project, we develop DNA-based photoactivatable probes to capture, isolate and characterize the proteins associated with these epigenetic DNA modifications. First, we designed and evaluated the properties of different photoactivatable oligonucleotide probes. We then carried out a methodological study in order to characterize at the molecular level the obtained photoadducts by MALDI-TOF. Finally, we developed a pull-down method coupled to photolabelling and associated with proteomic analysis by mass spectrometry to identify proteins with specific affinity for these epigenetic changes.

La 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) est une base modifiée de l'ADN. Chez le mammifère, cette base était considérée jusqu'à récemment comme une espèce mineure produite par des dommages oxydatifs. Cependant, des travaux publiés en 2009 ont profondément changé cette vision. En effet, d'une part, la 5hmC est abondante dans certains types cellulaires, d'autre part la formation de 5hmC est un processus actif, dirigé par des enzymes spécialisées (TET1-3) à partir d'une autre base modifiée de l'ADN, la 5-méthylcytosine. Ces découvertes récentes posent naturellement la question du rôle biologique de la 5hmC. En effet, le rôle biologique de la 5hmC est en cours d'exploration et nécessite donc le développement de méthodes dédiées à son étude. Nous avons pris part au développement de méthodes pour l'étude de l'hydroxyméthylation de l'ADN et des protéines partenaires de cette base en proposant des outils chimiques, biochimiques et analytiques. Nous avons adapté une méthode utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à l'étude de l'hydroxyméthylation. Nous avons également participé au développement de méthodes de marquage spécifique des 5hmC selon deux stratégies : (i) une stratégie enzymatique basée sur l'utilisation d'une glucosyltransférase et d'un donneur de glucose (uridine diphosphate glucose) modifié chimiquement; (ii) une stratégie chimique basée sur l'oxydation sélective de l'alcool allylique de la 5hmC. Enfin, nous avons conçu, synthétisé et étudié les propriétés de différentes sondes oligonucléotidiques photoactivables destinées à l'identification de protéines interagissant spécifiquement avec la 5hmC. / 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) is a modified DNA base, who was until recently believed be a minor modification, resulting of oxidative damage. However, results published in 2009 have challenged this understanding. Indeed, 5hmC is abundant in some cell types and its formation is an active process, mediated by specific enzymes (TET1-3) using another modified DNA base, 5-methylcytosine (5mC). These recent discoveries raise the question of the biological role of 5hmC. Indeed, if the role of 5mC in gene expression regulation is established, the biological role of 5hmC is still in study and require the development of specific methods. We participated in the development of methods to study 5hmC and its partner proteins using chemical, biochemical and analytical tools. We showed that mass spectrometry is a powerful tool to quantify global methylation levels and adapted a method, using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry to study hydroxymethylation. We have also taken part in the development of two 5hmC specific labeling methods: (i) an enzymatic strategy, using a glucosyltransferase and a chemically modified glucose donor, allowing the introduction of a probe by a bio-orthogonal reaction; (ii) a chemical strategy based on the selective oxidation of the 5hmC allylic alcohol. Finally, we have designed, synthesized and assessed the properties of photoactivable oligonucleotidic probes in order to identify proteins interacting with 5hmC.

L'objectif de ces travaux est de découvrir et de valoriser des petites molécules organiques inhibant l'influx de l'iode dans les cellules thyroïdiennes. Ces composés présentent en effet un double intérêt : à court terme, ils peuvent être dérivés en biosondes afin de mieux caractériser les protéines impliquées dans les mécanismes de transport d'iode par génétique chimique directe. A plus long terme, ces inhibiteurs représentent des candidats-médicaments potentiels pour le traitement de pathologies thyroïdiennes et/ou pour la protection de populations exposées aux radioisotopes de l'iode. Pour chacune des deux familles d'inhibiteurs considérées, nous avons donc tout d'abord synthétisé une chimiothèque d'une centaine d'analogues ; puis ces derniers ont été évalués biologiquement afin de fournir un ensemble de relations structure-activité. Par ailleurs, la configuration absolue des centres stéréogènes nécessaire à l'activité biologique a été déterminée : dans chacun des cas, une stéréochimie particulière est responsable du pouvoir inhibiteur des composés. A partir de ces informations, une dizaine d'analogues " de seconde génération " a été synthétisée dans chaque famille, en combinant plusieurs modifications structurales contribuant à l'activité biologique. Après évaluation biologique, neuf d'entre eux possèdent des IC50 < 6 nM et des propriétés physico-chimiques satisfaisantes pour des candidats-médicaments. Enfin, dans chaque famille, une biosonde photoactivable biotinylée a été synthétisée et utilisée en photomarquage d'affinité. Plusieurs protéines marquées spécifiquement ont été repérées, qui correspondraient à des protéines-cibles de chacun des inhibiteurs et dont l'identification reste à achever.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / L'interaction moléculaire de la cyclosporine A (CsA) avec ses deux cibles pharmacologiques principales, la P-glycoprotéine (P-gp) et la cyclophiline A (CypA), a été examinée au cours de cette étude. Dans une première approche, nous avons évalué l'efficacité avec laquelle la CsA et ses différents analogues interagissent avec la P-gp par deux méthodes. La première méthode utilisée consiste à mesurer l'activité ATPasique de la P-gp en présence de la CsA et de ses analogues. La P-gp a été solubilisée par une extraction séquentielle au CHAPS à partir des membranes des cellules d'ovaires d'hamster chinois résistantes à la colchicine (CHRC5). Ensuite, l'activité ATPasique de la P-gp solubilisée a été mesurée en absence ou en présence de la CsA et de ses analogues par une méthode continue où on mesure le taux d'oxydation de NADH en fonction du temps. La deuxième méthode utilisée consiste à mesurer l'accumulation de la rhodamine 123 à l'intérieur des cellules CHRC5 en présence de la CsA et de ses analogues. L'activité ATPasique de la P-gp a été inhibée par la CsA, par ses analogues et par ses métabolites à des concentrations de l'ordre du nM. Les métabolites de la CsA (AM1C, AM1, AM1C9 et AM9) ainsi que les métabolites de la CsG (GM4N, GM1 et GM9) causent une inhibition similaire de l'activité ATPasique de la P-gp. Parmi les analogues de la CsA étudiés, le PSC-833, une molécule non immunosuppressive, a été le meilleur inhibiteur de l'activité ATPasique de la P-gp. Le peptolide 280-446, un peptide cyclique non apparenté, a été presqu'aussi efficace que le PSC-833. Ces résultats révèlent que l'interaction des analogues de la CsA avec la P-gp n'est pas en corrélation avec leur activité immunosuppressive et que les modifications de la CsA en position 1 et 2 sont critiques pour leur interaction avec la P-gp. Dans une deuxième approche, nous avons caractérisé la CypA qui semble être présente dans les membranes à bordure en brosse (MBB) préparées à partir du cortex rénal de rat. Nous avons tenté de caractériser la nature de son attachement membranaire et de déterminer la quantité de la CypA dans les MBB. Nous avons également étudié les conditions où la CypA membranaire est relarguée, ainsi que son interaction avec la CsA. La CypA semble se trouver dans les MBB et dans la fraction soluble à une concentration de 4,9 et 3,6 g/mg de protéines, respectivement. Nous avons observé une extraction complète de la CypA des MBB par le Na2CO3 et par le CHAPS mais non par le NaC1, indiquant son attachement membranaire par des interactions hydrophobes. Nous avons aussi tenté de vérifier l'effet de différentes substances sur le relargage de la CypA des MBB. Ainsi, la CsA et le P-mercaptoéthanol n'ont pas entraîné un relargage de la CypA des MBB in vitro. Par contre, le substrat pour mesurer l'activité de peptidyle prolyle cis trans isomérase (PPIase) de la CypA, le peptide succinyl-alanine-alanine-cis-proline-phényl-pnitroanilide, cause un relargage significatif de la CypA associée aux MBB. Le photomarquage de la CypA relarguée et de la CypA qui reste membranaire suite à une centrifugation par un analogue photoactivable de la CsA (Diazérine-CsA) (Dz-CsA), démontre que la CypA relarguée est photomarquée plus efficacement que la CypA qui reste attachée aux MBB. La présence de la CypA au niveau des MBB, nous a incité à vérifier si la CypA recombinante pourrait se transférer dans les MBB in vitro. Ainsi, lorsque nous avons incubé la CypA recombinante en présence de MBB, elle se transfère à 40 % dans les MBB. Suite à cette observation, nous avons analysé l'effet de la formation des complexes CypA recombinante-CsA et CypA recombinante-CsA-Calcineurine sur la translocation de la CypA recombinante dans les MBB. Nos résultats révèlent que la translocation de la CypA recombinante dans les MBB diminue de 9 et de 38 %, lorsqu'elle se trouve sous une forme complexée avec la CsA ou avec la CsA/Calcineurine, respectivement. Afin de vérifier si la translocation de la CypA recombinante dans les MBB se fait par l'interaction avec une ou plusieurs autre(s) protéine(s) membranaire(s), nous avons procédé à la translocation de la CypA recombinante dans les MBB chauffées, dans les MBB prétraitées avec des concentrations croissantes de trypsine et dans des protéoliposomes préparés à partir des MBB. Nos résultats démontrent que le chauffage des MBB ne diminue pas la translocation de la CypA recombinante, et que la CypA recombinante se transfère au même taux dans les MBB que dans les protéoliposomes préparés à partir des MBB. Par contre, la translocation de la CypA recombinante diminue considérablement, lorsque les MBB sont prétraitées avec des concentrations croissantes de trypsine. Le relargage de la CypA associée aux MBB, ainsi que la translocation de la CypA recombinante dans les MBB a lieu de façon maximale à un pH proche du pH physiologique, soit aux pH 7 et 8, suggérant un équilibre dynamique entre la CypA cytosolique et la CypA membranaire dans les conditions physiologiques. Enfin, nous avons étudié l'effet des différents métaux divalents sur le photomarquage de la CypA des MBB, de la fraction soluble et de la CypA recombinante par un analogue photoactivable de la CsA (Dz-CsA). Parmi les métaux divalents étudiés (Mg2+, Mn2+, Ca2+, Zn2+ et Cis-Pt2+), seulement le Zn2+ a démontré une inhibition significative du photomarquage de la CypA des MBB, de la fraction soluble et de la CypA recombinante par la Dz-CsA. Cette inhibition causée par le Zn2+, est dépendante de la concentration et est de l'ordre du pM. Les agents réducteurs, le Hg2+ et le 13-mercaptoéthano1, ont aussi diminué le photomarquage de la CypA des MBB et de la fraction soluble par la Dz-CsA, tandis que la CypA recombinante, prétraitée avec le Hg2+ et le 13-mercaptoéthano1, démontre une augmentation du photomarquage par la Dz-CsA.

L’objectif de ces travaux est de découvrir et de valoriser des petites molécules organiques inhibant l’influx de l’iode dans les cellules thyroïdiennes. Ces composés présentent en effet un double intérêt : à court terme, ils peuvent être dérivés en biosondes afin de mieux caractériser les protéines impliquées dans les mécanismes de transport d’iode par génétique chimique directe. A plus long terme, ces inhibiteurs représentent des candidats-médicaments potentiels pour le traitement de pathologies thyroïdiennes et/ou pour la protection de populations exposées aux radioisotopes de l’iode. Pour chacune des deux familles d’inhibiteurs considérées, nous avons donc tout d’abord synthétisé une chimiothèque d’une centaine d’analogues ; puis ces derniers ont été évalués biologiquement afin de fournir un ensemble de relations structure-activité. Par ailleurs, la configuration absolue des centres stéréogènes nécessaire à l’activité biologique a été déterminée : dans chacun des cas, une stéréochimie particulière est responsable du pouvoir inhibiteur des composés. A partir de ces informations, une dizaine d’analogues « de seconde génération » a été synthétisée dans chaque famille, en combinant plusieurs modifications structurales contribuant à l’activité biologique. Après évaluation biologique, neuf d’entre eux possèdent des IC50 < 6 nM et des propriétés physico-chimiques satisfaisantes pour des candidats-médicaments. Enfin, dans chaque famille, une biosonde photoactivable biotinylée a été synthétisée et utilisée en photomarquage d’affinité. Plusieurs protéines marquées spécifiquement ont été repérées, qui correspondraient à des protéines-cibles de chacun des inhibiteurs et dont l’identification reste à achever. / This work was intended to discover small organic molecules acting as iodide uptake inhibitors in thyroid cells. These compounds can indeed be derivatized into biochemical probes for further characterization of proteins involved in iodide transport mechanisms. On the long term, these inhibitors also appear as attractive drug candidates for treatment of thyroid pathologies or radioprotection against iodine isotopes. A similar strategy was adopted for both of the two inhibitor families. First, we synthesized a chemical library of around 100 analogues; we measured their IC50 against iodide uptake in FRTL-5 cells to get structure-activity relationships. Absolute configuration of stereogenic centers was also investigated, and a preferential stereochemistry was found to be responsible for activity. From this basis, around twenty « second-generation » analogues were synthesized by combining fragments contributing to biological activity. Biological evaluation indicated that nine were very potent inhibitors, with IC50 < 6 nM and satisfying physicochemical properties required for drug candidates. Finally, one photoactivatable biotinylated probe was developed in each family and used for photoaffinity labeling. Several specifically labeled proteins are still under identification and constitute new potential therapeutic targets.