La 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) est une base modifiée de l'ADN. Chez le mammifère, cette base était considérée jusqu'à récemment comme une espèce mineure produite par des dommages oxydatifs. Cependant, des travaux publiés en 2009 ont profondément changé cette vision. En effet, d'une part, la 5hmC est abondante dans certains types cellulaires, d'autre part la formation de 5hmC est un processus actif, dirigé par des enzymes spécialisées (TET1-3) à partir d'une autre base modifiée de l'ADN, la 5-méthylcytosine. Ces découvertes récentes posent naturellement la question du rôle biologique de la 5hmC. En effet, le rôle biologique de la 5hmC est en cours d'exploration et nécessite donc le développement de méthodes dédiées à son étude. Nous avons pris part au développement de méthodes pour l'étude de l'hydroxyméthylation de l'ADN et des protéines partenaires de cette base en proposant des outils chimiques, biochimiques et analytiques. Nous avons adapté une méthode utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à l'étude de l'hydroxyméthylation. Nous avons également participé au développement de méthodes de marquage spécifique des 5hmC selon deux stratégies : (i) une stratégie enzymatique basée sur l'utilisation d'une glucosyltransférase et d'un donneur de glucose (uridine diphosphate glucose) modifié chimiquement; (ii) une stratégie chimique basée sur l'oxydation sélective de l'alcool allylique de la 5hmC. Enfin, nous avons conçu, synthétisé et étudié les propriétés de différentes sondes oligonucléotidiques photoactivables destinées à l'identification de protéines interagissant spécifiquement avec la 5hmC. / 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) is a modified DNA base, who was until recently believed be a minor modification, resulting of oxidative damage. However, results published in 2009 have challenged this understanding. Indeed, 5hmC is abundant in some cell types and its formation is an active process, mediated by specific enzymes (TET1-3) using another modified DNA base, 5-methylcytosine (5mC). These recent discoveries raise the question of the biological role of 5hmC. Indeed, if the role of 5mC in gene expression regulation is established, the biological role of 5hmC is still in study and require the development of specific methods. We participated in the development of methods to study 5hmC and its partner proteins using chemical, biochemical and analytical tools. We showed that mass spectrometry is a powerful tool to quantify global methylation levels and adapted a method, using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry to study hydroxymethylation. We have also taken part in the development of two 5hmC specific labeling methods: (i) an enzymatic strategy, using a glucosyltransferase and a chemically modified glucose donor, allowing the introduction of a probe by a bio-orthogonal reaction; (ii) a chemical strategy based on the selective oxidation of the 5hmC allylic alcohol. Finally, we have designed, synthesized and assessed the properties of photoactivable oligonucleotidic probes in order to identify proteins interacting with 5hmC.

L'objectif de ces travaux est de découvrir et de valoriser des petites molécules organiques inhibant l'influx de l'iode dans les cellules thyroïdiennes. Ces composés présentent en effet un double intérêt : à court terme, ils peuvent être dérivés en biosondes afin de mieux caractériser les protéines impliquées dans les mécanismes de transport d'iode par génétique chimique directe. A plus long terme, ces inhibiteurs représentent des candidats-médicaments potentiels pour le traitement de pathologies thyroïdiennes et/ou pour la protection de populations exposées aux radioisotopes de l'iode. Pour chacune des deux familles d'inhibiteurs considérées, nous avons donc tout d'abord synthétisé une chimiothèque d'une centaine d'analogues ; puis ces derniers ont été évalués biologiquement afin de fournir un ensemble de relations structure-activité. Par ailleurs, la configuration absolue des centres stéréogènes nécessaire à l'activité biologique a été déterminée : dans chacun des cas, une stéréochimie particulière est responsable du pouvoir inhibiteur des composés. A partir de ces informations, une dizaine d'analogues " de seconde génération " a été synthétisée dans chaque famille, en combinant plusieurs modifications structurales contribuant à l'activité biologique. Après évaluation biologique, neuf d'entre eux possèdent des IC50 < 6 nM et des propriétés physico-chimiques satisfaisantes pour des candidats-médicaments. Enfin, dans chaque famille, une biosonde photoactivable biotinylée a été synthétisée et utilisée en photomarquage d'affinité. Plusieurs protéines marquées spécifiquement ont été repérées, qui correspondraient à des protéines-cibles de chacun des inhibiteurs et dont l'identification reste à achever.