Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / La rétroaction tubuloglomérulaire (RTG) est un mécanisme important dans le contrôle de la filtration glomérulaire et de l'hémodynamique rénale. Ce phénomène est relié aux cellules de la macula densa (MD) qui ont la capacité de détecter des changements dans la composition du liquide tubulaire et de transmettre cette information aux artérioles afférentes (AA) qui, en se contractant, diminuent le débit de filtration glomérulaire et augmentent la résistance hydraulique du rein. La nature du signal qui est envoyé des cellules de la MD vers les AA reste encore inconnue. On sait cependant qu'une haute concentration de NaCl dans la lumière tubulaire déclenche la RTG, et que le cotransporteur Na+ +:2Cl^- est probablement le "sensor". Pour progresser dans l'étude de la RTG, une meilleure connaissance des cellules de la MD est absolument requise puisque c'est d'elles qu'origine le signal. La présente thèse a pour but de contribuer à une meilleure identification et à la caractérisation des propriétés membranaires des cellules de la MD. Dans un premier temps, à l'aide de la technique de patch clamp en "single channel" nous avons mis en évidence une grande densité de canaux K+ dans la membrane apicale. Nous montrons que ce type de canal est sensible au pH et au Ca2+ mais insensible à l'ATP. Dans un second temps, nous optons pour la technique de microperfusion de tubule isolé combinée à la microfluorimétrie. Nous démontrons ainsi la présence d'un échangeur Na+ + à la membrane apicale qui répond à toute variation de la concentration luminale de Na+ et de NaCl ([Na+]i et [NaCl]i). Par ailleurs, en utilisant les effets secondaires du cotransporteur Na+ +:2Cl^- sur le pH, nous démontrons que ce transporteur s'équilibre lorsque [NaCl]i atteint 18 mM. Ainsi, nous concluons que dans les conditions physiologiques, le cotransporteur produit une réabsorption de NaCl mais en opérant très près de son équilibre. Dans un troisième temps, nous utilisons une méthode dont nous avons établi la faisabilité pour les cellules de la MD, et qui est basée sur l'utilisation de NH4+ pour déterminer l'amplitude de certains flux. Nous démontrons que le NH4+ entre dans les cellules par le cotransporteur Na+ +:2Cl^- et par un transporteur sensible au Ba2+, et en sort, lors du retrait de NH4+ luminal, exclusivement sous forme de NH3 et de H+. Bien que la nature du transporteur sensible au Ba2+ n'ait pu être résolue de façon définitive, nous démontrons qu'elle ne correspond ni au canal K+ ni à l'échangeur K/(NH4)H. Ces études nous ont toutefois amenés à présenter pour la première fois un modèle qui permet d'évaluer quantitativement les mesures de taux d'acidification (d[pH]i/dt) et d'en tirer des mesures de flux. Grâce à ce modèle, nos données montrent que la membrane apicale est très perméable au NH3 et, contrairement à ce qu'il a été admis jusqu'à présent, le flux de NH4+ n'est pas égal au flux de protons mesuré mais lui est plutôt 2 à 3 fois supérieur. Enfin, dans un dernier temps, nous avons montré que le cotransporteur a une haute affinité pour le Na+ et pour le Cl-. Nous avons aussi commencé à étudier les facteurs régulateurs de ce cotransporteur en observant une inhibition de 40 % du cotransport suite à l'augmentation de la [Cl^-]i par inhibition de sa sortie basolatérale (10 μM NPPB). De plus, l'ajout de dbAMPc + forskoline stimule la conductance basolatérale au Cl^- mais inhibe faiblement le cotransporteur apical. En conclusion, nous considérons que ces études ont significativement contribué à l'amélioration de nos connaissances sur les cellules de la MD et à la progression dans la compréhension de la RTG, puisque nous sommes maintenant en position de spéculer avec un peu plus de précision sur les effets secondaires d'une augmentation de [NaCl]i.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Les petites protéines G de la famille Rhô jouent un rôle primordial dans l'organisation de la morphologie cellulaire qu'elles accordent aux besoins de la cellule. Elles constituent également une voie importante de signalisation vers le noyau, participent à la régulation du cycle cellulaire et sont impliquées lors du phénomène apoptotique. Ces protéines oscillent entre un état inactif lié au G DP et un état actif lié au GTP. Le passage de l'un à l'autre est assisté par des protéines stimulant (GDS) ou inhibant (GDI) l'activité d'échange des nucléotides et par des protéines stimulant leur activité GTPasique (GAP) intrinsèquement faible. Ce cycle d'activation s'accompagne d'un cycle de localisation, les protéines Rhô étant actives à la membrane et inactives dans la fraction soluble. La protéine GDI, elle-même cytosolique, sert de navette aux protéines Rhô lors de leur transit cytoplasmique. Nous avons caractérisé l'activité de solubilisation des protéines Rhô par la protéine de fusion GST-GDI in vitro, utilisant comme modèle les membranes à bordure en brosse rénales. Deux petites protéines G de ta famille Rhô, RhoA et Cdc42, sont spécifiquement extraites en présence de GST-GDI. Cette activité d'extraction est cependant saturable. Une fraction importante (près de 50%) des protéines RhoA et Cdc42 ne peut être extraite suggérant la présence de sous-populations membranaires. L'activité de solubilisation des protéines Rhô par GST-GDI s'est avérée sensible à la force ionique et est complètement inhibée en conditions physiologiques de température et de sel. La présence de set n'empêche pas la liaison des protéines Rhô à GST-GDI puisque les complexes GST-GDI/Rho coprécipitent sur billes de glutathion-sépharose, en milieu de force ionique physiologique. D'autre part, un prélavage des membranes avec une solution saline inhibe l'extraction subséquente des Rhô par GDI, suggérant fortement qu'un facteur essentiel soit inhibé ou perdu lors du traitement. Ces faits suggèrent que la translocation des protéines Rhô par GDI soit normalement inhibée in vivo et nous amènent à proposer un modèle de régulation de leur cycle d'activation. Nos travaux ont également mis en évidence une protéolyse de GSTGDI au cours des essais d'extraction en présence de membranes à bordure en brosse rénales. Le phénomène est observé en présence de quelques autres tissus et dans tous les cas, un fragment protéolytique majeur de 17 kDa est généré, révélant la présence d'une zone de vulnérabilité protéotytique sur GDI. Le fragment ne peut extraire les Rhô des membranes, suggérant que l'activité GDI puisse être régulée par protéolyse. L'intégrité de GST-GDI est préservée en présence de Ac-YVAD-CHO, un inhibiteur spécifique de caspases. Le séquençage du fragment généré a cependant révélé que le site de coupure sur GST-GDI ne correspond pas à un site d'activité caspase. Ces faits suggèrent que l'activité des protéines Rhô puisse être régulée par une cascade protéolytique incluant une caspase endogène à la membrane à bordure en brosse rénale. D'autre part, notre étude de la stimulation par le GTPyS d'une activité de carboxyméthylation des protéines du rein a démontré que l'activité stimulée implique une isoaspartyle métyltransférase (PIMT). Cette enzyme catalyse le transfert de groupements méthyles provenant du S-adénosyl-Lméthionine, vers la fonction carboxylique portée par la chaîne latérale de résidus isoaspartyles. La PIMT est réputée participer à la réparation de protéines endommagées issues de modifications spontanées de résidus asparagines et aspartates. L'effet stimulateur du GTPyS sur l'activité PIMT est modulé par le vanadate et complètement inhibé par la génistéine et le tyrphostin. L'analyse des profils de méthylation sur gel révèle des modes d'action différents. La génistéine prévient l'accroissement du rythme des cycles de méthylation/déméthylation sur l'ensemble des substrats tel qu'observé habituellement en présence de GTPyS, tandis que le tyrphostin agit plutôt en bloquant une étape de déméthylation. Les résultats obtenus en présence de vanadate et de génistéine suggèrent fortement l'implication d'une activité tyrosine kinase lors de la stimulation de l'activité PIMT par le GTPyS au niveau du rein.

Les muscles squelettiques sont principalement composés de fibres musculaires, des longues cellules multinucléées. Ces fibres sont classifiées en fonction de leur phénotype métabolique et contractile en type I (fibres oxydatives lentes), IIA (fibres oxydatives rapides) ou IIX et IIB (fibres glycolytiques rapides). La détermination du phénotype musculaire dépend de plusieurs facteurs intrinsèques (ex. voies signalétiques, facteurs de transcription) et extrinsèques (ex. hormones, stress physique). Les cellules souches musculaires (cellules satellites) sont aussi impliquées dans ce processus. À la suite d'une lésion musculaire, les cellules satellites s'activent, prolifèrent, sortent du cycle cellulaire pour s’autorenouveler ou se différencier en myoblastes qui fusionnent ensemble et avec les fibres musculaires endommagées pour régénérer le muscle blessé. Récemment, nous avons démontré que les résolvines, des médiateurs lipidiques dérivés des omégas-3, favorisent la différenciation et la fusion des cellules satellites provenant d’un modèle de souris dystrophique. Toutefois, leur effet sur la détermination du phénotype musculaire demeure inconnu. Ce mémoire présente un travail de recherche visant à déterminer l’impact des médiateurs lipidiques sur le phénotype musculaire pendant la myogenèse. Pour répondre à cet objectif, in vitro, nous avons caractérisé l’impact des résolvines sur le phénotype des myotubes (quantification par immunofluorescence) et la signalisation cellulaire (analyse de RNAseq) lors de la myogenèse. In vivo, nous avons caractérisé l’impact des résolvines sur les propriétés contractiles (mesure de la force in situ) et le phénotype des fibres musculaires (quantification par immunofluorescence) lors de la régénération musculaire précoce et tardive. Un article a été rédigé et présente les différents résultats obtenus. In vitro, nous avons démontré que la résolvine D2 (RvD2), augmente la formation de myotube embryonnaire promouvant la myogenèse. La RvD2 favorise également le développement de myotubes lents. De plus, KD107, un agoniste du récepteur de la RvD2 (GPR18), induit l’activation des voies signalétiques AMPK, PPAR et mTOR reconnues pour favoriser le métabolisme oxydatif et la synthèse de protéines contractiles. In vivo, nos résultats démontrent qu’au cours de la régénération musculaire, l’administration locale de RvD2 améliore la force musculaire, promeut la formation du type de fibre caractéristique dans les muscles lents (type I) et rapides (type IIB), et augmente leur taille. L’administration systémique de RvD2 induit également un changement du type de fibre en faveur du type lent. La RvD2 présente un potentiel thérapeutique prometteur pour les maladies musculaires, car elle pourrait contribuer à prévenir la diminution des capacités myogéniques, la perte de force, les altérations du typage des fibres musculaires et/ou l'atrophie, qui sont des caractéristiques couramment observées dans de nombreuses myopathies. / Skeletal muscles are predominantly composed of long, multinucleated muscle fibers. These fibers are classified according to their metabolic and contractile phenotype as type I (oxidative slow fibers), IIA (oxidative fast fibers) or IIX and IIB (glycolytic fast fibers). The determination of fiber type is influenced by various intrinsic (e.g., signaling pathways and transcription factors) and extrinsic factors (e.g., hormones and physical stress). Muscle stem cells, also called satellite cells, have been suggested to play a role in this process of fiber type determination. Following an injury, satellite cells become activated, undergo proliferation, and exit cell cycle to self-renew or differentiate into myoblasts. These myoblasts can either fuse with each other or with damaged muscle fibersto regenerate the injured muscle. Our laboratory recently shows that resolvins, lipid mediators derived from omega-3 fatty acids, promote the differentiation and fusion of satellite cells from a dystrophic mouse model. Despite these findings, their impact on muscle phenotype determination remains unknown. Therefore, the objective of our study was to investigate the influence of lipid mediators on muscle phenotype during myogenesis. In vitro experiments were conducted using immunofluorescence and RNAseq analysis to examine the effects of resolvins on the phenotype of myotubes and cell signaling during myogenesis. In vivo experiments involved measuring in situ strength and utilizing immunofluorescence techniques to evaluate the effects of resolvins on contractile properties and muscle fiber phenotype at both the early and late stages of muscle regeneration. We wrote a manuscript presenting all the results obtained. Our in vitro experiments demonstrated that resolvin-D2 (RvD2) enhances the formation of embryonic myotubes, thereby promoting the process of myogenesis. RvD2 also promotes the development of slow myotubes. Moreover, KD107, an agonist of the resolvin-D2 receptor GPR18, activates AMPK, PPAR and mTOR pathways which enhance the oxidative capacity and the synthesis of contractile protein. In vivo, our finding reveals that the local administration of RvD2 enhances muscle strength, facilitates the formation of the characteristic fiber type in slow (type I) and fast (type IIB) muscle, and increase their size. The systemic administration of RvD2 also promotes the fiber type switch in favor of the slow phenotype. Resolvin-D2 shows significant potential as a therapeutic intervention for muscle diseases. It could mitigate the loss of myogenic capacity, muscle strength, alterations in muscle fiber typing, and atrophy, which are frequently observed in numerous myopathies

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Angiotensinogen (ANG) is a single peptide glycoprotein that contains 452 amino acids in human (453 amino acids in rodents). ANG releases a 10-amino acids peptide known as angiotensin l (Ang I) from it's N-terminal when acted by renin, a acidic protease. Ang I can be fiirther converted into angiotensin II (Ang II) by angiotensin converting enzyme (ACE). Ang II is one of the most potent vasoconstrictors known. Ang II also acts on the brain to mcrease blood pressure. Ang II acts on the adrenal cortex to increase the secretion of aldosterone. The levels of ANG in plasma or local tissues diïectly contribute to the levels ofAng II. Therefore the studies of regulation ofANG gene expression is important to understand the molecular mechanisms of some related diseases, such as hypertension. Previous studies m which the transfection of the fusion genes that were generated with various lengths of 5'-flanking region of the rat ANG gene linked to a bacterial chloramphenicol acetyl transferase (CAT) gene as a reporter into mouse hepatoma (Hepa 1- 6) ceUs and opossum kidney (OK) cells, identified a putative cyclic AMP responsive element (CRE) in the rat ANG gene 5'-regulatory region (N-806/-779). Compared with palindromic CRE octamer (TGACGTCA), the putative CRE of the ANG gene (ANG-CRE) is almost identical except the last two bases were in reversed order (TGACGTAC). In the present study, we isolated a fuU-length cDNA of 1345 base pairs from mouse liver cDNA library, which encodes a nuclear DNA-binding protein consisting of 436 amino acids with an apparent molecular weight of 52 kilodalton (kDa). This protein binds to the ANG-CRE, and was designated as 52-kDa protein. Southwestern blot revealed that this 52 kDa protein was present in the following tissues, such as liver, kidney, testis, brain, but not in spleen. Analysis of the deduced amino acid sequence shows no apparent basic regionleucine zipper (bZIP) stmcture, indicatmg ANG-CREB is structurally distinct fi-om bZIP family members. The antiserum against 43-kDa-CREB or ATF-2 can not interact with this 52-kDa protein, further supporting that the 52-kDa protem is immunologically different fi-om the bZIP family. The 52-kDa protein may represent a new group of CRE-binding proteins. Competitive gel mobility shift assays and Southwestern blot analysis revealed that the ANG-CREB binds to ANG-CRE, and this bindmg is not displaceable by excess amounts of CREs fi-om somatostatin (SOM), phosphoenopymvate carboxyl kmase PEPCK), and tyrosine ammo transferase (TAT) genes in vitro. These data suggest that the 52-kDa protein binds specifically to ANG-CRE and may regulate the ANG gene expression. The biological function of the 52-kDa protein is not known at present. The primary data from transient gene transfection assays showed that this protein has represser activity on the ANG gene promoter when ANG gene was stimulated by isoproterenol, but showed no effect on the ANG basal level (without any stimulation). Further experiments will be needed to study the biological function of the 52-kDa protein. / L'angiotensinogène (ANG) est une glycoprotéine fonnée de 452 acide aminés chez l'humain (453 acide aminés chez les rongeurs). Une protéase acide, la rénine, clive l'ANG de son côté N-tenninal en libérant un peptide de 10 acide aminés connu sous le nom de l'angiotensine I (Angl). Ce dernier, peut être converti en angiotensine II (AngII) sous Faction d'une enzyme de conversion dite ACE. L'Ang II est un puissant vasocoiisticteur. Il agit au niveau du cerveau en augmentant la pression sanguine et au niveau du cortex rénal en augmentant la sécrétion de l'aldostérone. Les niveaux de l'ANG daiis le plasma ou dans les tissus locaux sont directement proportionnels aux niveaux de Ang II. Ainsi les études de regulation de l'expression du gène d'Ang II sont importantes pour comprendre les mécanismes moléculaires de certames maladies, comme l'hypertension. Des études antérieiu-es par transfection en utilisant des gènes de fusion générés avec différentes longueurs de région flanquées en 5' du gène ANG de rat lié au gène rapporteur de bactérie, le chloramphénicol acetyl transférase (CAT), dans les ceUules hépatome (Hepa 1-6) de souris et dans les ceUules rénales de sarigue, ont permis d'identifier un présumé élément réponse (CRE) d'AMP cyclique dans la région régulatrice en 5' du gène ANG de rat (N- 806/-779). En comparant l'octamère palindromique de CRE (TGACGTCA) avec le présumé CRE du gène ANG (ANG-CRE), il semble qu'ils sont identiques à l'exception des deux dernières bases qui sont dans un ordre inversé (TGACGTAC). Dans cette étude, nous avons isolé à partir d'une banque de cDNA du foie de souris, une cDNA de 1345 paire de bases qui code pour une protéine de liaison à l'ADN nucléaire. Cette protéine est fonnée de 436 acide aminés avec un poids moléculaire apparent de 52 kilodalton (kDa). En se liant à ANG-CER, cette protéme est désignée comme la 52-kDa protéine. Le "Southwestern blot" a révélé que la 52-kDa protéine de 52 kDa est présente dans les tissus suivants: foie, rein, testicule et cerveau; mais absente dans la rate. L'analyse de cette séquence déduite d'acide aminés ne montre pas du stmcture apparent à la région basique de la fermeture éclaire à leucine, bzip (basic region-leucme zipper), indiquant que la 52-kDa protéine est structurellement distincte des membres de la famille bzip. L'antisérum dérigé contre le 43- kDa-CREB ou contre ATF-2 n'intéragit pas avec la 52-kDa protéme confermant amsi que la 52-kDa protéine est immunologiquenient dififérente des membres de famille bzip. La 52-kDa protéine représente donc, un nouveau groupe des protéines de liaison à CRE. Les essais sur gel à mobilité compétitive et les analyses de "southwestern blot" ont révélé que la 52-kDa protéine lié ANG-CRE et que cette liaison n'était pas déplaçable par un excès du gène CRE de somatostatin (SOM), phosphoenopymvate carboxy kmase (PEPCK) et tyrosme ammo transférase (TAT) m vitro, suggérant que la 52-kDa protéine se lié spésifiquement à ANGCRE et qu'il peut réguler l'expression du gène ANG. Les fonctioiis biologiques de la 52- kDa protéine ne sont pas encore connus. Les premiers résultats obtenus à partir des essais de transfections des gènes transitoirs montrent que cette protéine a une activité represseur sur le promoteur du gène d'ANG quand ce dernier est stimulé par l'isoprotérénol, et que, sans stimulation, elle a aucun effet sur le niveau basai d'ANG. Les expériences futures seront nécessaires poiir étudier les fonctions biologiques d'AND.

Les empreintes papillaires sont principalement utilisées à des fins d'identification par les forces policières, chez les individus vivants et décédés. Dans les contextes forensiques, l'étendue de la conservation/décomposition de restes peut avoir un impact sur la capacité de restaurer et prélever les empreintes papillaires, et par conséquent, sur les méthodes utilisées. L’application de ces méthodes sur le terrain (p. ex. en cas de catastrophes de masse ou fosses communes) ne peut pas compter sur les mêmes installations/ressources de laboratoire, et nécessite des adaptations pratiques. Ce travail de recherche représente la première application et comparaison dans un cadre expérimental des méthodes de restauration et prélèvement des empreintes papillaires à partir de restes humains en décomposition dans des conditions contrôlées au Québec. Deux essais ont été menés sur quatre donneurs au site de Recherche en Sciences Thanatologiques Expérimentales et Sociales (REST[ES]); un à l’été 2021 et un à l’automne/hiver 2021-2022. Au total, cinq méthodes existantes de restauration et trois méthodes de prélèvement, développées sous d'autres climats, ont été expérimentées. Les résultats ont montré que les méthodes pouvaient être adaptées pour une application sur le terrain, de manière simple, rapide et économique. Les restaurations et prélèvements après l'hiver ont été réalisées de façon moins invasive et destructrice qu'en été, où des variables incontrôlables ont limité leur application. Basé sur ces résultats, deux outils ont été développés pour soutenir la prise de décision des praticiens du Québec (Canada) lors du choix des méthodes à prioriser dans les cas réels forensiques. / Fingerprints are primarily used for identification purposes by law enforcement, for both living and deceased individuals. In forensic contexts, the extent of preservation or decomposition of remains can impact the ability to restore and collect fingerprints, and subsequently the methods used. Additionally, implementation of these methods in the field in cases of mass disasters or mass graves cannot rely on laboratory facilities and resources, and therefore require practical adaptations. This research work represents the first application and comparison in an experimental setting of fingerprints restoration and collection methods from decomposing remains under controlled conditions in Quebec. Two trials were conducted on four donors at the site for Research in Experimental and Social Thanatology (REST[ES]); one in summer 2021 and one in fall/winter 2021-2022. In total, five existing restoration methods and three collection methods, developed in other climates, were tested. Results showed that fingerprint restoration and collection methods could be adapted for practical applications in real forensic contexts, in a simple, rapid, and cost-effective way. Fingerprints restorations and collections after winter were achieved in less invasive and destructive manners than in summer, where uncontrollable variables limited their application. Based on these results, two tools have been developed to support the decision-making of forensic practitioners in Quebec (Canada) when choosing which methods to prioritize in real forensic cases.

Les îlots de Langerhans, principalement composés de cellules bêta sécrétant l’insuline, jouent un rôle majeur dans l’homéostasie glucidique grâce à leur sécrétion hormonale finement régulée. Dans un contexte d’insulino-résistance associée à l’obésité, la masse fonctionnelle des cellules bêta pancréatiques augmente, en partie grâce à une prolifération accrue. Le diabète de type 2 survient lorsque les mécanismes de compensation échouent et que la sécrétion d’insuline devient insuffisante. Par conséquent, augmenter la prolifération des cellules bêta a été proposée comme approche thérapeutique afin de retarder l’apparition du diabète de type 2. Parmi les différents facteurs pouvant moduler la prolifération des cellules bêta, les nutriments, en particulier le glucose et les acides gras, jouent un rôle important et plusieurs études chez le rongeur montrent que les nutriments augmentent la prolifération et la masse des cellules bêta avant l’apparition de l’insulino-résistance. De plus, des travaux de notre laboratoire ont montré que l’infusion d’un mélange d’acide gras, le ClinOleic (65% oléate, 20% linoléate et 15% palmitate) et de glucose provoquait une augmentation marquée de la prolifération des cellules bêta chez le rat. L’objectif de cette thèse est donc d’évaluer les mécanismes par lesquels les acides gras stimulent la prolifération des cellules bêta. Dans un premier article, seul l’oléate, parmi plusieurs acides gras testé, a démonté un effet significatif sur l’augmentation de la prolifération des cellules bêta en présence de glucose ex vivo. La prolifération induite par l’oléate nécessite la formation de sphingolipides à très longue chaîne monoinsaturée, tandis que la perturbation de leur synthèse provoque une diminution de la réponse proliférative. Dans une seconde étude, l’analyse par séquençage d’ARN sur cellules uniques a mis en évidence le rôle important des espèces réactives de l’oxygène, des peroxyrédoxines et du proto-oncogène MYC dans le processus prolifératif des cellules bêta induit par l’oléate. Dans l’ensemble, les travaux présentés dans cette thèse apportent un éclairage nouveau sur le potentiel prolifératif encore énigmatique des cellules bêta pancréatiques et soulignent le rôle des sphingolipides et des espèces réactives de l’oxygène dans ce processus. / The islets of Langerhans, mainly composed of insulin-secreting beta cells, plays a major role in glucose homeostasis due to their finely regulated hormone secretion. In a context of insulin resistance associated with obesity, the functional mass of pancreatic beta cells increases, in part due to increased proliferation. Type 2 diabetes occurs when these compensatory mechanisms fail and insulin secretion becomes insufficient. Therefore, increasing beta cell proliferation has been proposed as a therapeutic approach to delay the onset of type 2 diabetes. Among the various factors that can modulate the proliferation of beta cells, nutrients, in particular glucose and fatty acids, play an important role, and several studies in rodents show that nutrients increase beta-cell proliferation before insulin resistance can be detected. Previous work from our laboratory has shown that infusion of the fatty-acid mixture ClinOleic (65% oleate, 20% linoleate and 15% palmitate) in the presence of glucose markedly increases beta-cell proliferation in rats. The objective of this thesis is to evaluate the underlying mechanisms by which fatty acids stimulate beta-cell proliferation. In a first study, among several fatty acids tested, only oleate increased beta cell proliferation in presence of glucose ex vivo. Oleate-induced beta-cell proliferation requires the formation of monounsaturated very long chain sphingolipids, while blockade of their biosynthesis dampens the proliferative response. In a second study, single-cell RNA sequencing analysis highlighted the role of reactive oxygen species, peroxiredoxins, and the proto-oncogene MYC in oleate-induced beta cell proliferation. Overall, the work presented in this thesis sheds new light on the enigmatic proliferative potential of pancreatic beta cells and identifies a role for sphingolipids and reactive oxygen species in this process.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Afin d'étudier le processus de transport rénal d'albumine, nous avons mis au point une technique permettant de mesurer ce transport par des segments isolés de tubules proximaux de rein de chien in vitro. De l'albumine marquée au Bleu Evans (BE) est présentée à ces tubules et l'accumulation cellulaire du BE est utilisée comme index de transport d'albumine. L'accumulation de BE observée après exposition des tubules au BE seul a été comparée à celle observée après leur exposition aux complexes albumine, la liaison s'effectuant avec différents rapports de ces complexes albumine. Nous avons établi que l'accumulation lysosomiale de BE témoignait d'un transport de l'albumine. Nous montrons que ce transport est supprimé par une hypothermie (37°C versus 4°C), par l'anoxie (demande de l'énergie), par des inhibiteurs de la synthèse d'ATP (KCN, penténoate-4), par la cytochalasine B mais pas par la colchicine. Le transport d'albumine est influencé par les charges cationiques portées par cette molécule. En effet, un excès de BE (complexes albumine: BE saturés de BE) réduit le transport d'albumine. L'osmolarité (de 300 à 600 mOsm) inhibe également ce transport. L'acidification des compartiments vésiculaires impliqués dans le cycle d'endocytose est importante pour le transport puisque son inhibition par la bafilomycine (H+-ATPase), le DIDS (canaux chlore compensant le potentiel membranaire), le NH3 (liaison du H+ intra-vésiculaire) montre le même effet sur le transport d'albumine. Par contre, l'amiloride qui inhibe les échangeurs Na+/H+ (NHE-3) n'a pas d'effet sur le transport mais semble accroître la liaison de l'albumine aux récepteurs de la membrane de la bordure en brosse. On peut conclure que les mécanismes d'acidification luminale et endosomiale peuvent affecter différemment le transport d'albumine dans des suspensions tubulaires proximales. De plus, le transport d'albumine par le tubule proximal est un processus rapide et potentiellement considérable. Toute réduction du transport tubulaire pourrait se traduire par un accroissement important de la protéinurie. Cette anomalie ne reflète donc pas le seul dommage tubulaire mais aussi le transport de l'albumine. Finalement, nous avons spéculé sur les conséquences du catabolisme rénal accru d'albumine au cours des néphropathies. Ce catabolisme peut en effet conduire à une toxicité tubulaire qui contribue peut-être au développement de la néphropathie. L'ensemble de notre réflexion nous amène à conclure qu'une intervention précoce réduisant la fuite glomérulaire d'albumine pourrait améliorer la condition du patient atteint de diabète.

Les expériences suivantes testent l’hypothèse que la sérine/thréonine kinase p38α/β MAPK inhibe la rentrée dans le cycle cellulaire des cardiomyocytes ventriculaires de rats nouveau-nés (CVRNs), et induit l’expression d’un panel de cytokines/chimiokines inflammatoires. Le traitement des CVRNs par le phorbol 12,13-butyrate (PDBu), activateur de la protéine kinase C (PKC), aboutit au recrutement de l’isoforme conventionnelle (PKC-α) et des isoformes nouvelles (PKC-δ et PKC-ε) de PKC en l’absence de la rentrée dans le cycle cellulaire. Cette absence d’entrée dans le cycle cellulaire à la suite du traitement par PDBu est associée à une augmentation d’expression des ARNm des gènes qui bloquent la rentrée dans le cycle cellulaire. Les gènes comprennent Runx1(Runt-related transcription factor 1) et CDKN2a (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A) également connu sous le nom de p16, inhibiteur du cycle cellulaire. En présence de l’inhibiteur de p38α/β MAPK, SB203580, le traitement PDBu induit une entrée dans le cycle cellulaire de deux populations distinctes de cardiomyocytes caractérisées par l’absence ou l’expression de novo de la protéine filamenteuse Nestine. En parallèle, le co-traitement PDBu/SB203580 atténue l’augmentation du niveau d’expression de l’ARNm de Runx1 et CDKN2a. L’inhibition pharmacologique du recrutement de PKC-α par GF109203X, inhibe sélectivement la rentrée dans le cycle cellulaire des CVRNs qui présentent une expression de novo de Nestine. En parallèle, le traitement par PDBu augmente le niveau d’ARNm d’un panel de cytokines inflammatoires et la co-administration de SB203580 inhibe cette réponse. Ces données révèlent que le cœur des rats nouveau-nés contient deux sous-populations distinctes de cardiomyocytes ventriculaires qui rentrent dans le cycle cellulaire à la suite d’un co-traitement PDBu / SB203580, et que la réponse proliférative est associée à une diminution des cytokines inflammatoires. Collectivement, ces résultats mettent en relief une nouvelle prémisse selon laquelle le recrutement de p38α/β MAPK médié par PKC-α joue un rôle central dans l’inhibition de l’entrée dans le cycle cellulaire et induit une réponse inflammatoire robuste par les CRVNs. / The following experiments test the hypothesis that the serine/threonine kinase p38α/β MAPK inhibits the cell cycle re-entry of neonatal rat ventricular cardiomyocytes (NNVMs) and induces the expression of a panel of inflammatory cytokines/chemokines. Treatment of NNVMs with phorbol 12,13-butyrate (PDBu), an activator of protein kinase C (PKC), results in the recruitment of the conventional isoform (PKC-α) and novel isoforms (PKC-δ and PKC-ε) of PKC in the absence of cell cycle re-entry. This lack of cell cycle re-entry following PDBu treatment is associated with an increase in the expression of mRNA of genes that inhibit cell cycle re-entry. These genes include Runx1 (Runt-related transcription factor 1) and CDKN2a (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A), also known as p16, a cell cycle inhibitor. In the presence of the p38α/β MAPK inhibitor, SB203580, PDBu treatment induces cell cycle re-entry in two distinct populations of cardiomyocytes characterized by the absence or de novo expression of the filamentous protein Nestin. In parallel, co-treatment with PDBu/SB203580 attenuates the increase in Runx1 and CDKN2a mRNA levels. Pharmacological inhibition of PKC-α recruitment by GF109203X selectively inhibits cell cycle re-entry of NNVMs exhibiting de novo Nestin expression. Additionally, PDBu treatment increases the mRNA levels of a panel of inflammatory cytokines, and co-administration of SB203580 inhibits this response. These data reveal that the heart of neonatal rats contain two distinct subpopulations of ventricular cardiomyocytes that re-enter the cell cycle following PDBu/SB203580 co-treatment, and that the proliferative response is associated with a decrease in inflammatory cytokines. Collectively, these results highlight a novel premise whereby p38α/β MAPK recruitment mediated by PKC-α plays a central role in inhibiting cell cycle re-entry and induces a robust inflammatory response by NNVMs.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / L'interaction moléculaire de la cyclosporine A (CsA) avec ses deux cibles pharmacologiques principales, la P-glycoprotéine (P-gp) et la cyclophiline A (CypA), a été examinée au cours de cette étude. Dans une première approche, nous avons évalué l'efficacité avec laquelle la CsA et ses différents analogues interagissent avec la P-gp par deux méthodes. La première méthode utilisée consiste à mesurer l'activité ATPasique de la P-gp en présence de la CsA et de ses analogues. La P-gp a été solubilisée par une extraction séquentielle au CHAPS à partir des membranes des cellules d'ovaires d'hamster chinois résistantes à la colchicine (CHRC5). Ensuite, l'activité ATPasique de la P-gp solubilisée a été mesurée en absence ou en présence de la CsA et de ses analogues par une méthode continue où on mesure le taux d'oxydation de NADH en fonction du temps. La deuxième méthode utilisée consiste à mesurer l'accumulation de la rhodamine 123 à l'intérieur des cellules CHRC5 en présence de la CsA et de ses analogues. L'activité ATPasique de la P-gp a été inhibée par la CsA, par ses analogues et par ses métabolites à des concentrations de l'ordre du nM. Les métabolites de la CsA (AM1C, AM1, AM1C9 et AM9) ainsi que les métabolites de la CsG (GM4N, GM1 et GM9) causent une inhibition similaire de l'activité ATPasique de la P-gp. Parmi les analogues de la CsA étudiés, le PSC-833, une molécule non immunosuppressive, a été le meilleur inhibiteur de l'activité ATPasique de la P-gp. Le peptolide 280-446, un peptide cyclique non apparenté, a été presqu'aussi efficace que le PSC-833. Ces résultats révèlent que l'interaction des analogues de la CsA avec la P-gp n'est pas en corrélation avec leur activité immunosuppressive et que les modifications de la CsA en position 1 et 2 sont critiques pour leur interaction avec la P-gp. Dans une deuxième approche, nous avons caractérisé la CypA qui semble être présente dans les membranes à bordure en brosse (MBB) préparées à partir du cortex rénal de rat. Nous avons tenté de caractériser la nature de son attachement membranaire et de déterminer la quantité de la CypA dans les MBB. Nous avons également étudié les conditions où la CypA membranaire est relarguée, ainsi que son interaction avec la CsA. La CypA semble se trouver dans les MBB et dans la fraction soluble à une concentration de 4,9 et 3,6 g/mg de protéines, respectivement. Nous avons observé une extraction complète de la CypA des MBB par le Na2CO3 et par le CHAPS mais non par le NaC1, indiquant son attachement membranaire par des interactions hydrophobes. Nous avons aussi tenté de vérifier l'effet de différentes substances sur le relargage de la CypA des MBB. Ainsi, la CsA et le P-mercaptoéthanol n'ont pas entraîné un relargage de la CypA des MBB in vitro. Par contre, le substrat pour mesurer l'activité de peptidyle prolyle cis trans isomérase (PPIase) de la CypA, le peptide succinyl-alanine-alanine-cis-proline-phényl-pnitroanilide, cause un relargage significatif de la CypA associée aux MBB. Le photomarquage de la CypA relarguée et de la CypA qui reste membranaire suite à une centrifugation par un analogue photoactivable de la CsA (Diazérine-CsA) (Dz-CsA), démontre que la CypA relarguée est photomarquée plus efficacement que la CypA qui reste attachée aux MBB. La présence de la CypA au niveau des MBB, nous a incité à vérifier si la CypA recombinante pourrait se transférer dans les MBB in vitro. Ainsi, lorsque nous avons incubé la CypA recombinante en présence de MBB, elle se transfère à 40 % dans les MBB. Suite à cette observation, nous avons analysé l'effet de la formation des complexes CypA recombinante-CsA et CypA recombinante-CsA-Calcineurine sur la translocation de la CypA recombinante dans les MBB. Nos résultats révèlent que la translocation de la CypA recombinante dans les MBB diminue de 9 et de 38 %, lorsqu'elle se trouve sous une forme complexée avec la CsA ou avec la CsA/Calcineurine, respectivement. Afin de vérifier si la translocation de la CypA recombinante dans les MBB se fait par l'interaction avec une ou plusieurs autre(s) protéine(s) membranaire(s), nous avons procédé à la translocation de la CypA recombinante dans les MBB chauffées, dans les MBB prétraitées avec des concentrations croissantes de trypsine et dans des protéoliposomes préparés à partir des MBB. Nos résultats démontrent que le chauffage des MBB ne diminue pas la translocation de la CypA recombinante, et que la CypA recombinante se transfère au même taux dans les MBB que dans les protéoliposomes préparés à partir des MBB. Par contre, la translocation de la CypA recombinante diminue considérablement, lorsque les MBB sont prétraitées avec des concentrations croissantes de trypsine. Le relargage de la CypA associée aux MBB, ainsi que la translocation de la CypA recombinante dans les MBB a lieu de façon maximale à un pH proche du pH physiologique, soit aux pH 7 et 8, suggérant un équilibre dynamique entre la CypA cytosolique et la CypA membranaire dans les conditions physiologiques. Enfin, nous avons étudié l'effet des différents métaux divalents sur le photomarquage de la CypA des MBB, de la fraction soluble et de la CypA recombinante par un analogue photoactivable de la CsA (Dz-CsA). Parmi les métaux divalents étudiés (Mg2+, Mn2+, Ca2+, Zn2+ et Cis-Pt2+), seulement le Zn2+ a démontré une inhibition significative du photomarquage de la CypA des MBB, de la fraction soluble et de la CypA recombinante par la Dz-CsA. Cette inhibition causée par le Zn2+, est dépendante de la concentration et est de l'ordre du pM. Les agents réducteurs, le Hg2+ et le 13-mercaptoéthano1, ont aussi diminué le photomarquage de la CypA des MBB et de la fraction soluble par la Dz-CsA, tandis que la CypA recombinante, prétraitée avec le Hg2+ et le 13-mercaptoéthano1, démontre une augmentation du photomarquage par la Dz-CsA.

L’ovaire est un organe indispensable à la fonction reproductive, car il permet la production, la maturation et la libération de la cellule germinale femelle, l’ovocyte. Malgré son rôle central dans la régulation de la reproduction chez la femme, plusieurs de ses processus physiologiques et de ses conditions pathologiques sont encore imparfaitement décrits. La caractérisation du rôle de nouveaux régulateurs pourrait permettre l’élucidation de plusieurs questionnements actuels en physiologie ovarienne. Initialement étudiée dans l’organogenèse et l’oncogenèse pour son implication dans la prolifération, la migration, la différenciation et l’apoptose cellulaire, la voie de signalisation Hippo pourrait s’avérer être un facteur déterminant dans la physiologie ovarienne. En effet, elle a été récemment rapportée comme participant à la régulation de l’activation folliculaire, de la prolifération des cellules de la granulosa et de l’ovulation. La voie Hippo consiste en une cascade de kinases menant ultimement à la phosphorylation des deux co-régulateurs transcriptionnels YAP1 (yes-associated protein 1) et TAZ (transcriptional coactivator with a PDZ-binding motif). L’objectif général de ce projet de thèse était de caractériser les rôles de Yap1/Taz dans la physiologie ovarienne en utilisant des modèles murins transgéniques d’inactivation conditionnelle de ces gènes dans les cellules de la granulosa. La première portion du projet a conduit à la caractérisation d’un phénotype inattendu de défaut des oviductes. Les souris femelles adultes étaient sous-fertiles et leur fonction ovarienne était intacte. En fait, la sous-fertilité était causée par le piégeage des embryons dans des dilatations de la paroi de l’oviducte, empêchant ainsi leur transport adéquat vers l’utérus. Nous sommes parvenus à démontrer que la perte d’expression de YAP1/TAZ dans les couches musculeuses de l’oviducte conduisait à un amincissement progressif de sa paroi et était ultimement responsable de l’échec du transport embryonnaire. Dans la seconde portion du projet, nous avons utilisé la culture primaire de cellules de la granulosa afin de décrire l’implication de la voie Hippo dans l’ovulation. Nous avons identifié la protéine kinase A comme modulateur clé de l’activation de la voie Hippo par l’hormone lutéinisante (LH). En utilisant un système adénoviral de délétion de Yap1/Taz, nous avons mis en évidence l’importance de leur expression pour l’induction de plusieurs gènes cibles de la LH. Ensuite, au moyen d’une expérience d’immunoprécipitation de la chromatine, nous avons démontré l’implication de YAP1 dans la régulation de la transcription de l’amphiréguline, un effecteur central de la cascade de signalisation de la LH. Dans son ensemble, ce projet a permis de mettre la lumière sur de nouveaux rôles de la voie de signalisation Hippo dans la régulation des cellules musculaires lisses de l’oviducte et des cellules de la granulosa durant l’ovulation chez la souris. Elles ouvrent la voie à une investigation plus précise de l’implication de la voie Hippo dans ces deux organes clés du système reproducteur femelle. / The ovary is a central organ of the female reproductive tract involved in oocyte production, maturation and release. Still, many physiological and pathological ovarian processes remain to be described more comprehensively. The precise characterization of the roles of new ovarian regulators would contribute to a better understanding of its physiology. The Hippo signaling pathway was initially studied for its roles in cellular proliferation, apoptosis, migration and differentiation during organ and tumor development. Recently, it has been shown to be involved during normal physiological processes of multiple organs, including the ovary. Hippo was shown to be involved in the activation of primordial follicles, in the proliferation of granulosa cells and during ovulation. Hippo consists of a central kinase cascade leading to the phosphorylation of YAP1 (yes-associated protein 1) and TAZ (transcriptional coactivator with a PDZ-binding motif), the two transcriptional coactivators of the pathway. The objective of this thesis was to characterize the precise roles of Yap1/Taz in ovarian physiology using transgenic mouse models of their genetic deletion in granulosa cells. The first part of this thesis project led to the characterization of an unexpected oviductal phenotype. Adult females were subfertile and their ovarian function was unaffected. The subfertility was rather caused by the entrapment of embryos in oviductal dilations, preventing their normal transport to the uterus. We demonstrated that loss of YAP1/TAZ expression in oviductal smooth muscle cells led to a gradual thinning of the oviductal wall and was responsible for the embryo transport impediment. In the second part of this project, we cultured primary mouse granulosa cells to characterize the roles of the Hippo signaling pathway during ovulation. We showed that protein kinase A is a key effector of Hippo activation following the luteinizing hormone (LH) surge. We then demonstrated that Yap1/Taz expression is required for the induction of several LH target genes. Using a chromatin immunoprecipitation experiment, we were able to show that YAP1 drives the expression of amphiregulin, a key paracrine transmitter of the LH signal, during the early events of ovulation. Together, these results identified new roles of the Hippo signaling pathway in the regulation of oviductal smooth muscle cells and of granulosa cells during ovulation. This thesis project opens the door to new avenues of investigation of Hippo involvement in the regulation of the female reproductive system.