Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / La rétroaction tubuloglomérulaire (RTG) est un mécanisme important dans le contrôle de la filtration glomérulaire et de l'hémodynamique rénale. Ce phénomène est relié aux cellules de la macula densa (MD) qui ont la capacité de détecter des changements dans la composition du liquide tubulaire et de transmettre cette information aux artérioles afférentes (AA) qui, en se contractant, diminuent le débit de filtration glomérulaire et augmentent la résistance hydraulique du rein. La nature du signal qui est envoyé des cellules de la MD vers les AA reste encore inconnue. On sait cependant qu'une haute concentration de NaCl dans la lumière tubulaire déclenche la RTG, et que le cotransporteur Na+ +:2Cl^- est probablement le "sensor". Pour progresser dans l'étude de la RTG, une meilleure connaissance des cellules de la MD est absolument requise puisque c'est d'elles qu'origine le signal. La présente thèse a pour but de contribuer à une meilleure identification et à la caractérisation des propriétés membranaires des cellules de la MD. Dans un premier temps, à l'aide de la technique de patch clamp en "single channel" nous avons mis en évidence une grande densité de canaux K+ dans la membrane apicale. Nous montrons que ce type de canal est sensible au pH et au Ca2+ mais insensible à l'ATP. Dans un second temps, nous optons pour la technique de microperfusion de tubule isolé combinée à la microfluorimétrie. Nous démontrons ainsi la présence d'un échangeur Na+ + à la membrane apicale qui répond à toute variation de la concentration luminale de Na+ et de NaCl ([Na+]i et [NaCl]i). Par ailleurs, en utilisant les effets secondaires du cotransporteur Na+ +:2Cl^- sur le pH, nous démontrons que ce transporteur s'équilibre lorsque [NaCl]i atteint 18 mM. Ainsi, nous concluons que dans les conditions physiologiques, le cotransporteur produit une réabsorption de NaCl mais en opérant très près de son équilibre. Dans un troisième temps, nous utilisons une méthode dont nous avons établi la faisabilité pour les cellules de la MD, et qui est basée sur l'utilisation de NH4+ pour déterminer l'amplitude de certains flux. Nous démontrons que le NH4+ entre dans les cellules par le cotransporteur Na+ +:2Cl^- et par un transporteur sensible au Ba2+, et en sort, lors du retrait de NH4+ luminal, exclusivement sous forme de NH3 et de H+. Bien que la nature du transporteur sensible au Ba2+ n'ait pu être résolue de façon définitive, nous démontrons qu'elle ne correspond ni au canal K+ ni à l'échangeur K/(NH4)H. Ces études nous ont toutefois amenés à présenter pour la première fois un modèle qui permet d'évaluer quantitativement les mesures de taux d'acidification (d[pH]i/dt) et d'en tirer des mesures de flux. Grâce à ce modèle, nos données montrent que la membrane apicale est très perméable au NH3 et, contrairement à ce qu'il a été admis jusqu'à présent, le flux de NH4+ n'est pas égal au flux de protons mesuré mais lui est plutôt 2 à 3 fois supérieur. Enfin, dans un dernier temps, nous avons montré que le cotransporteur a une haute affinité pour le Na+ et pour le Cl-. Nous avons aussi commencé à étudier les facteurs régulateurs de ce cotransporteur en observant une inhibition de 40 % du cotransport suite à l'augmentation de la [Cl^-]i par inhibition de sa sortie basolatérale (10 μM NPPB). De plus, l'ajout de dbAMPc + forskoline stimule la conductance basolatérale au Cl^- mais inhibe faiblement le cotransporteur apical. En conclusion, nous considérons que ces études ont significativement contribué à l'amélioration de nos connaissances sur les cellules de la MD et à la progression dans la compréhension de la RTG, puisque nous sommes maintenant en position de spéculer avec un peu plus de précision sur les effets secondaires d'une augmentation de [NaCl]i.

Les résultats présentés dans cette thèse précisent certains aspects de la fonction du cotransporteur Na+/glucose (SGLT1), une protéine transmembranaire qui utilise le gradient électrochimique favorable des ions Na+ afin d’accumuler le glucose à l’intérieur des cellules épithéliales de l’intestin grêle et du rein. Nous avons tout d’abord utilisé l’électrophysiologie à deux microélectrodes sur des ovocytes de xénope afin d’identifier les ions qui constituaient le courant de fuite de SGLT1, un courant mesuré en absence de glucose qui est découplé de la stoechiométrie stricte de 2 Na+/1 glucose caractérisant le cotransport. Nos résultats ont démontré que des cations comme le Li+, le K+ et le Cs+, qui n’interagissent que faiblement avec les sites de liaison de SGLT1 et ne permettent pas les conformations engendrées par la liaison du Na+, pouvaient néanmoins générer un courant de fuite d’amplitude comparable à celui mesuré en présence de Na+. Ceci suggère que le courant de fuite traverse SGLT1 en utilisant une voie de perméation différente de celle définie par les changements de conformation propres au cotransport Na+/glucose, possiblement similaire à celle empruntée par la perméabilité à l’eau passive. Dans un deuxième temps, nous avons cherché à estimer la vitesse des cycles de cotransport de SGLT1 à l’aide de la technique de la trappe ionique, selon laquelle le large bout d’une électrode sélective (~100 μm) est pressé contre la membrane plasmique d’un ovocyte et circonscrit ainsi un petit volume de solution extracellulaire que l’on nomme la trappe. Les variations de concentration ionique se produisant dans la trappe en conséquence de l’activité de SGLT1 nous ont permis de déduire que le cotransport Na+/glucose s’effectuait à un rythme d’environ 13 s-1 lorsque le potentiel membranaire était fixé à -155 mV. Suite à cela, nous nous sommes intéressés au développement d’un modèle cinétique de SGLT1. En se servant de l’algorithme du recuit simulé, nous avons construit un schéma cinétique à 7 états reproduisant de façon précise les courants du cotransporteur en fonction du Na+ et du glucose extracellulaire. Notre modèle prédit qu’en présence d’une concentration saturante de glucose, la réorientation dans la membrane de SGLT1 suivant le relâchement intracellulaire de ses substrats est l’étape qui limite la vitesse de cotransport. / The results presented in this thesis clarify certain functional aspects of the Na+/glucose cotransporter (SGLT1), a membrane protein which uses the downhill electrochemical gradient of Na+ ions to drive the accumulation of glucose in epithelial cells of the small intestine and the kidney. We first used two microelectrodes electrophysiology on Xenopus oocytes to indentify the ionic species mediating the leak current of SGLT1, a current measured in the absence of glucose that is uncoupled from the strict 2 Na+/1 glucose stoichiometry characterising cotransport. Our results showed that cations such as Li+, K+ and Cs+, which interact weakly with SGLT1 binding sites and are unable to generate the conformational changes that are triggered by Na+ binding, were however able to generate leak currents similar in amplitude to the one measured in the presence of Na+. This suggests that the leak current permeating through SGLT1 does so using a pathway that differs from the conformational changes associated with Na+/glucose cotransport. Moreover, it was found that the cationic leak and the passive water permeability could share a common pathway. We then sought to estimate the turnover rate of SGLT1 using the ion-trap technique, where a large tip ion-selective electrode (~100 μm) is pushed against the oocyte plasma membrane, thus enclosing a small volume of extracellular solution referred to as the trap. The variations in ionic concentration occurring in the trap as a consequence of SGLT1 activity made it possible to assess that the turnover rate of Na+/glucose cotransport was 13 s-1 when the membrane potential was clamped to -155 mV. As a last project, we focused our interest on the development of a kinetic model for SGLT1. Taking advantage of the simulated annealing algorithm, we constructed a 7-state kinetic scheme whose predictions accurately reproduced the currents of the cotransporter as a function of extracellular Na+ and glucose. According to our model, the rate limiting step of cotransport under a saturating glucose concentration is the reorientation of the empty carrier that follows the intracellular release of substrates.

Les résultats présentés dans cette thèse précisent certains aspects de la fonction du cotransporteur Na+/glucose (SGLT1), une protéine transmembranaire qui utilise le gradient électrochimique favorable des ions Na+ afin d’accumuler le glucose à l’intérieur des cellules épithéliales de l’intestin grêle et du rein. Nous avons tout d’abord utilisé l’électrophysiologie à deux microélectrodes sur des ovocytes de xénope afin d’identifier les ions qui constituaient le courant de fuite de SGLT1, un courant mesuré en absence de glucose qui est découplé de la stoechiométrie stricte de 2 Na+/1 glucose caractérisant le cotransport. Nos résultats ont démontré que des cations comme le Li+, le K+ et le Cs+, qui n’interagissent que faiblement avec les sites de liaison de SGLT1 et ne permettent pas les conformations engendrées par la liaison du Na+, pouvaient néanmoins générer un courant de fuite d’amplitude comparable à celui mesuré en présence de Na+. Ceci suggère que le courant de fuite traverse SGLT1 en utilisant une voie de perméation différente de celle définie par les changements de conformation propres au cotransport Na+/glucose, possiblement similaire à celle empruntée par la perméabilité à l’eau passive. Dans un deuxième temps, nous avons cherché à estimer la vitesse des cycles de cotransport de SGLT1 à l’aide de la technique de la trappe ionique, selon laquelle le large bout d’une électrode sélective (~100 μm) est pressé contre la membrane plasmique d’un ovocyte et circonscrit ainsi un petit volume de solution extracellulaire que l’on nomme la trappe. Les variations de concentration ionique se produisant dans la trappe en conséquence de l’activité de SGLT1 nous ont permis de déduire que le cotransport Na+/glucose s’effectuait à un rythme d’environ 13 s-1 lorsque le potentiel membranaire était fixé à -155 mV. Suite à cela, nous nous sommes intéressés au développement d’un modèle cinétique de SGLT1. En se servant de l’algorithme du recuit simulé, nous avons construit un schéma cinétique à 7 états reproduisant de façon précise les courants du cotransporteur en fonction du Na+ et du glucose extracellulaire. Notre modèle prédit qu’en présence d’une concentration saturante de glucose, la réorientation dans la membrane de SGLT1 suivant le relâchement intracellulaire de ses substrats est l’étape qui limite la vitesse de cotransport. / The results presented in this thesis clarify certain functional aspects of the Na+/glucose cotransporter (SGLT1), a membrane protein which uses the downhill electrochemical gradient of Na+ ions to drive the accumulation of glucose in epithelial cells of the small intestine and the kidney. We first used two microelectrodes electrophysiology on Xenopus oocytes to indentify the ionic species mediating the leak current of SGLT1, a current measured in the absence of glucose that is uncoupled from the strict 2 Na+/1 glucose stoichiometry characterising cotransport. Our results showed that cations such as Li+, K+ and Cs+, which interact weakly with SGLT1 binding sites and are unable to generate the conformational changes that are triggered by Na+ binding, were however able to generate leak currents similar in amplitude to the one measured in the presence of Na+. This suggests that the leak current permeating through SGLT1 does so using a pathway that differs from the conformational changes associated with Na+/glucose cotransport. Moreover, it was found that the cationic leak and the passive water permeability could share a common pathway. We then sought to estimate the turnover rate of SGLT1 using the ion-trap technique, where a large tip ion-selective electrode (~100 μm) is pushed against the oocyte plasma membrane, thus enclosing a small volume of extracellular solution referred to as the trap. The variations in ionic concentration occurring in the trap as a consequence of SGLT1 activity made it possible to assess that the turnover rate of Na+/glucose cotransport was 13 s-1 when the membrane potential was clamped to -155 mV. As a last project, we focused our interest on the development of a kinetic model for SGLT1. Taking advantage of the simulated annealing algorithm, we constructed a 7-state kinetic scheme whose predictions accurately reproduced the currents of the cotransporter as a function of extracellular Na+ and glucose. According to our model, the rate limiting step of cotransport under a saturating glucose concentration is the reorientation of the empty carrier that follows the intracellular release of substrates.

Dans cette thèse nous avons utilisé des méthodes de systèmes dynamiques et des simulations numériques pour étudier les mécanismes d'oscillations d'épilepsie associés à des concentrations d’ions dynamiques et au comportement bimodal des cellules Purkinje du cervelet. Le propos général de ce travail est l'interaction entre les propriétés intrinsèques des neurones simple et la structure d'entrée synaptique contrôlant l'excitabilité neuronale. Dans la première partie de la thèse nous avons développé un modèle de transition de crise épileptique dans le lobe temporal du cerveau. Plus précisément nous nous sommes concentrés sur le rôle du cotransporteur KCC2, qui est responsable de la maintenance du potassium extracellulaire et du chlorure intracellulaire dans les neurones. Des données expérimentales récentes ont montré que cette molécule est absente dans un groupe significatif de cellules pyramidales dans le tissue neuronal de patients épileptiques suggérant son rôle épileptogène. Nous avons trouvé que l'addition d’une quantité critique de cellules pyramidale KCC2 déficient au réseau de subiculum, avec une connectivité réaliste, peut provoquer la génération d’oscillations pathologiques, similaire aux oscillations enregistrées dans des tranches de cerveau épileptogène humaines. Dans la seconde partie de la thèse, nous avons étudié le rôle du bruit synaptique dans les cellules de Purkinje. Nous avons étudié l'effet de l'inhibition de la génération du potentiel d’action provoquée par injection de courant de bruit, un phénomène connu comme résonance stochastique inverse (RSI). Cet effet a déjà été trouvé dans des modèles neuronaux, et nous avons fournis sa première validation expérimentale. Nous avons trouvé que les cellules de Purkinje dans des tranches de cerveau peuvent être efficacement inhibées par des injectionsde bruit de courant. Cet effet est bien reproduit par le modèle phénoménologique adapté pour différentes cellules. En utilisant des méthodes de la théorie de l'information, nous avons montré que RSI prend en charge une transmission efficace de l'information des cellules de Purkinje simples suggérant son rôle pour les calculs du cervelet. / In this thesis we used dynamical systems methods and numericalsimulations to study the mechanisms of epileptic oscillations associated with ionconcentration changes and cerebellar Purkinje cell bimodal behavior. The general issue in this work is the interplay between single neuron intrinsicproperties and synaptic input structure controlling the neuronal excitability. In the first part of this thesis we focused on the role of the cellular intrinsicproperties, their control over the cellular excitability and their response to thesynaptic inputs. Specifically we asked the question how the cellular changes ininhibitory synaptic function might lead to the pathological neural activity. We developed a model of seizure initiation in temporal lobe epilepsy. Specifically we focused on the role of KCC2 cotransporter that is responsible for maintaining the baseline extracellular potassium and intracellular chloride levels in neurons. Recent experimental data has shown that this cotransporter is absent in the significant group of pyramidal cells in epileptic patients suggesting its epileptogenic role. We found that addition of the critical amount of KCC2-deficient pyramidal cells to the realistic subiculum network can switch the neural activity from normal to epileptic oscillations qualitatively reproducing the activity recorded in human epileptogenic brain slices. In the second part of this thesis we studied how synaptic noise might control the Purkinje cell excitability. We investigated the effect of spike inhibition caused by noise current injection, so-called inverse stochastic resonance (ISR). This effect has been previously found in single neuron models while we provided its first experimental evidence. We found that Purkinje cells in brain slices could be efficiently inhibited by current noise injections. This effect is well reproduced by the phenomenological model fitted for different cells. Using methods of information theory we showed that ISR supports an efficient information transmission of single Purkinje cells suggesting its role for cerebellar computations.

La polyneuropathie sensitivomotrice héréditaire (PNSMH) est une maladie rare qui entraîne un ralentissement du développement moteur et mental, une déficience sensitivomotrice et des syndromes neuropsychiatriques, et qui s’accompagne souvent d’une agénésie du corps calleux. Par ailleurs, plusieurs évaluations rapportent une petite stature ou une masse corporelle anormalement basse chez les patients. La PNSMH est causée par des mutations perte de fonction du cotransporteur K⁺-Cl⁻ de type 3 (KCC3). Des évaluations cliniques détaillées et la caractérisation de souris inactivées pour Kcc3 (Kcc3ᴷᴼ) ont permis d’établir qu’un défaut d’export K⁺-Cl⁻ cause les atteintes neurologiques anatomiques et fonctionnelles dans la maladie. Chez les souris Kcc3ᴷᴼ, des manifestations extraneurologiques ont également été relevées : masse corporelle réduite, pression artérielle (PA) élevée, polydipsie et polyurie. Puisque la physiopathologie des désordres extraneurologiques découlant de la perte de fonction de KCC3 reste incomplètement décrite, mes travaux avaient pour objectif d’en comprendre les mécanismes sous-jacents en utilisant un modèle Kcc3ᴷᴼ. Une caractérisation initiale de notre lignée de souris Kcc3ᴷᴼ constitutive et systémique a montré des anomalies vasculaires et cardiaques accompagnant une élévation de PA diastolique. Cette lignée affichait également une polydipsie et une polyurie isoosmotique, de même qu’une réduction de masse corporelle et d’adiposité sans réduction d’apport alimentaire. Une caractérisation métabolique détaillée de notre modèle a ensuite permis de révéler des réductions de masse grasse et de masse maigre. Cette minceur résulte sûrement en partie des augmentations d’activité locomotrice et de dépense énergétique mesurées. Une nette amélioration de la tolérance au glucose a aussi été trouvée, ainsi que des concentrations réduites de triacylglycérols plasmatiques. Enfin, nous avons noté que notre modèle est résistant à l’obésité induite par une diète hyperlipidique et affiche une élévation concomitante de l’expression d’enzymes lipogéniques et lipolytiques dans le gras viscéral, engendrant potentiellement une dissipation calorique. En revisitant la fonction cardiovasculaire dans notre modèle par des méthodes de pointe, nous n’avons pas observé de changement de PA ni de différence de réactivité artériolaire en conditions basales, mais nous avons noté une élévation de distensibilité artériolaire passive. Chez notre modèle, nous n’avons pas non plus remarqué de sensibilité particulière de la PA au sel alimentaire, mais une excrétion urinaire fortement accrue de solutés sous diète hypersodée ainsi qu’une préférence marquée pour le sel. Ces observations sont compatibles avec un défaut de réabsorption hydrosodée par le rein pouvant d’ailleurs prévenir les élévations de PA. En somme, nos travaux ont permis de mieux comprendre les atteintes cardiométaboliques qui accompagnent le tableau neurologique d’un modèle murin de PNSMH. Nous avons notamment relevé des bénéfices inattendus dans le métabolisme glucidique et lipidique suivant l’inactivation de Kcc3. Nous soupçonnons également que l’absence de KCC3 dans le rein engendre une fuite ionique urinaire s’accentuant sous diète hypersodée et pouvant influencer la PA en limitant l’expansion volémique. Nos observations d’anomalies pléiotropiques liées à l’inactivation de Kcc3 font de ce gène une nouvelle cible pharmacologique potentielle et justifient la nécessité d’étudier l’anatomophysiologie cardiométabolique des patients atteints de PNSMH de façon plus approfondie. / Hereditary motor and sensory neuropathy (HMSN) is a rare disease that leads to delayed motor and mental development, loss of sensory and motor function and neuropsychiatric syndromes, and that is often accompanied by partial or complete agenesis of the corpus callosum. Additionally, several cases of short stature or low body weight have been reported in patients. HMSN is caused by loss-of-function mutations in K⁺-Cl⁻ cotransporter type 3 (KCC3). Detailed clinical reports and characterizations of mice inactivated for Kcc3 (Kcc3ᴷᴼ) have allowed to establish that defective K⁺-Cl⁻ export causes the anatomical and functional neurologic impairments in the disease. In Kcc3ᴷᴼ mice, extra-neurological abnormalities have also been noted: lower body weight, high blood pressure (BP), polydipsia and polyuria. Because the pathophysiology of extra-neurological traits arising from KCC3 loss of function remains incompletely described, my work aimed at understanding the mechanisms at play using a Kcc3ᴷᴼ model. An initial characterization of a constitutive and systemic Kcc3ᴷᴼ mouse line showed vascular and cardiac abnormalities along with a rise in diastolic BP. This model also showed polydipsia and iso-osmolar polyuria along with reduced body weight and adiposity but no decrease in food intake. A detailed metabolic characterization of our model further revealed reductions in fat and lean body masses. This leanness results certainly in part from increased locomotor activity and energy expenditure as measured. A marked improvement in glucose tolerance was also found in addition to lower plasmatic triglyceride concentrations. Lastly, we also demonstrated that our model is resistant to high-fat-diet-induced obesity and shows concomitant increase in expression of both lipogenic and lipolytic enzymes in visceral fat, thereby potentially generating caloric dissipation. When revisiting the cardiovascular function of our model with cutting-edge methods, we measured normal BP and arteriolar reactivity in baseline conditions. However, we noted an increase in passive arteriolar distensibility. In our model, we did not notice sensitivity of BP to dietary salt but found a marked increase in urinary solute excretion under high-salt diet and a strong preference for salt. These observations are consistent with a defect in hydromineral reabsorption by the nephron that may prevent BP from rising. In short, our work allowed to better understand the cardiometabolic characteristics that accompany the neurologic portrait of an HMSN mouse model. In particular, we noted unexpected benefits in carbohydrate and lipid metabolism upon Kcc3 inactivation. We also suspect that KCC3 ablation in the kidney leads to urinary hydromineral wasting that can be more salient under dietary salt loading and can influence BP by blunting extracellular volume expansion. The pleiotropic abnormalities arising from Kcc3 inactivation identify this gene as a new potential pharmacological target and argue for improving efforts at describing the cardiometabolic features of patients with HMSN.