Cette thèse s'inscrit dans le cadre de la recherche de procédés de détection rapides et sensibles des agents de la menace biologique. Nous avons étudié une nouvelle méthode de dosage immunologique par transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) adaptable à un dosage en flux. Cette méthode est basée sur l'emploi d'un réactif trifonctionnel (tripode) comportant i) un fluorophore Donneur (D), ii) un analogue de la molécule à doser (analyte) et iii) une fonction permettant son immobilisation sur une phase solide. La liaison d'un anticorps anti-analyte marqué avec un fluorophore Accepteur (A) entraîne une diminution de la fluorescence de D (quenching). La présence de l'analyte induit une compétition pour la liaison de l'anticorps avec le tripode et restaure ainsi la fluorescence de D. Le procédé permet d'obtenir un signal localisé et cumulatif et la réalisation de dosages successifs sur une même surface régénérée par ajout d'anticorps. L'évaluation du procédé a été effectuée en plaque de microtitration sur des petites molécules (substance P, atrazine, aflatoxine) et des protéines (β-lactoglobuline, toxine botulinique, ricine). Les propriétés spectrales des fluorophores, le rapport A/D et la distance A-D conditionnent fortement l'efficacité du FRET et donc la sensibilité du dosage qui dépend toutefois surtout des caractéristiques d'affinité relatives de l'anticorps envers l'analyte et envers le tripode. Idéalement l'anticorps devrait présenter une bonne affinité pour le tripode et une encore meilleure pour l'analyte. Des essais de mesure avec circulation de fluide, effectués dans une microcellule en verre en employant comme détecteur une caméra CCD montée sur un microscope à fluorescence, ont montré la faisabilité d'une détection en flux et permettent d'envisager le développement d'un biocapteur fonctionnant selon ce principe. Un autre procédé basé sur la discrimination des fluorophores en solution et immobilisés est également présenté, permettant de développer un dosage rapide et simultané de plusieurs composés.

La détection et quantification d’agent biologique occupe une place prépondérante dans la prévention et la détection des dangers possibles pour la santé publique (épidémie ou pandémie), l’environnement ainsi que d’autres risques contextuelles (bioterrorisme, armes biologique ou chimiques…etc.). Par conséquent, le développement d’un système portable et à moindre coût permettant de détecter ces dangers constitue l’axe de recherche pluridisciplinaire de la collaboration entre différents laboratoires de l’UPMC (Paris 6) et « RWTH university » à Aachen en Allemagne. Dans ce projet, nous avons étudié les aspects pluridisciplinaires d’un microsystème (LoC) électromagnétique de détection immunologique basé sur l’utilisation de nanoparticules magnétiques (MNP). En raison de leur extractabilité et de leur triabilité, les MNP sont adaptées à l'examen d'échantillons biologiques, servant de marqueurs pour des réactions biochimiques. La plupart des techniques classiques de détection existantes sont basées sur des méthodes colorimétrique, fluorescence ou électrochimique qui souffrent en majorité de problème de temps d’analyse et de sensibilité. A cet égard, Les méthodes d’immuno-détection magnétiques constituent une alternative prometteuse. Cette détection est effectuée à l’aide des MNP qui sont spécifiquement bio-fonctionnalisés en surface afin d’être liée à la cible (virus, anticorps…etc). La nouvelle méthode magnétique de mélange de fréquence permet la détection et la quantification de ces MNP avec une grande dynamique. Dans cette thèse, l’effort est dirigé vers la miniaturisation de ce système. Pour ce faire, nous avons développé un ensemble d’outils analytiques et de simulations multiphysiques afin d’optimiser les dimensions des parties électromagnétique (bobines planaires) et microfluidiques. Par la suite, des prototypes de cette structure de détection à partir de bobines en circuits imprimés et de réservoirs microfluidiques en PDMS sont dimensionnés et réalisés. Les performances de ces prototypes ont été évaluées en termes de limite de détection de MNP, linéarité et plage dynamique. En outre, ces prototypes ont permis de valider les outils de dimensionnement réalisés. Une limite de détection de nanoparticules magnétiques de 15ng/mL a été mesurée avec un volume d'échantillon de 14 μL correspondant à une goutte de sang. Finalement, la validation du système quant à l’immuno-détection est abordée avec un état de l’art et le développement d’une procédure de fonctionnalisation biochimique de surface ainsi que des premiers tests pour sa validation. / The detection and quantification of a biological agent or entity has become paramount to anticipate a possible health threat (epidemic or pandemic), environmental threat or to combat other contextual threats (bioterrorism, chemical and biological weapons, drugs). Consequently, developing a portable cost effective device that could detect and quantify such threats is the research focus of the joint multidisciplinary project between UPMC (Paris 6) laboratories and RWTH university in Aachen, Germany. In the framework of this project, we have studied the multidisciplinary aspects of an electromagnetic microsystem for immunologic detection based on magnetic nanoparticles (MNP) in a microfluidic lab-on-chip (LoC). Because of their extractability and sortability, magnetic nanoparticles are adapted for examination of biological samples, serving as markers for biochemical reactions. So far, the final detection step is mostly achieved by well-known immunochemical or fluorescence-based techniques which are time consuming and have limited sensitivity. Therefore, magnetic immunoassays detecting the analyte by means of magnetic markers constitute a promising alternative. MNP covered with biocompatible surface coating can be specifically bound to analytes, cells, viruses or bacteria. They can also be used for separation and concentration enhancement. The novel frequency mixing magnetic detection method allows quantifying magnetic nanoparticles with a very large dynamic measurement range. In this thesis, emphasis is put on the miniaturized implementation of this detection scheme. Following the development of analytical and multiphysics simulations tools for optimization of both excitation frequencies and detection planar coils, first multilayered printed circuit board prototypes integrating all three different coils along with an adapted microfluidic chip has been designed and realized. These prototypes have been tested and characterized with respect to their performance for limit of detection (LOD) of MNP, linear response and validation of theoretical concepts. Using the frequency mixing magnetic detection technique, a LOD of 15ng/mL for 20 nm core sized MNP has been achieved with a sample volume of 14 μL corresponding to a drop of blood. Preliminary works for biosensing have also been achieved with a state of the art of surface functionalization and a developed proposed biochemical immobilization procedure and preliminary tests of its validation.

La formation du duramen est un processus physiologique clé impliqué dans la qualité du bois puisqu'il contribue notamment à sa durabilité naturelle. L'objectif de cette thèse est de comprendre les mécanismes mis en jeu lors de la formation du duramen chez le douglas. L'étude a été menée aux niveaux phénotypiques, biochimiques et moléculaires sur plusieurs génotypes de douglas. Des études phénotypiques, il ressort que la proportion de duramen serait sous influence génétique et très peu environnementale, et que l'expansion du bois de coeur se déroule principalement en automne-hiver. Afin de caractériser la composition biochimique du bois, une nouvelle méthode a été développée. Elle repose sur la dissolution du bois dans des liquides ioniques, les solutions obtenues sont ensuite immuno-marquées à l'aide d'anticorps dirigés contre des épitopes de polymères pariétaux. Cette méthode a permis d'observer l'évolution, cerne par cerne, de la composition pariétale du bois de l'aubier externe au coeur du duramen. Certains polymères sont plus abondants dans l'aubier (arabinanes), tandis que d'autres dans le duramen (pectines, xylanes et galactanes). En parallèle, les gènes impliqués dans la formation du duramen ont été étudiés par RNA-Seq à partir de douglas appartenant à un seul génotype et abattus en hiver. Les résultats montrent que des gènes codant des facteurs de transcription, des protéines de défense, des enzymes de la voie de biosynthèse des phénylpropanoides et des enzymes impliquées dans le remodelage de la paroi sont surexprimés dans la zone de transition par rapport à l'aubier. Des hormones, l'éthylène et le jasmonate notamment, semblent jouer un rôle important dans la maturation de l'aubier. / The heartwood formation is a key physiological process involved in wood quality because it contributes to its natural durability. The goal of this thesis is to understand mechanisms involved in the heartwood formation in douglas fir. This study has been carried out at phenotypic, biochemical and molecular levels from several douglas-fir genotypes. Thanks to phenotypic analysis, we showed that heartwood proportion is probably under genetic control, and little influenced by the environment. In douglas fir, heartwood expansion mainly occurs during autumn and winter. To characterize the biochemical composition of wood, a new method has been developed. The method implies the wood dissolution in ionic liquid, the solution obtained are then analyzed by immunodetection with monoclonal antibodies against plant cell wall glycan epitopes. Thanks to this method, the wood cell wall composition has been studied, ring-by-ring, from the outer sapwood to the inner heartwood. Some polymers are more abundant in the sapwood (arabinans) while others in the heartwood (pectins, xylans and galactans). Then, genes involved in the heartwood formation have been studied by RNA-Seq from trees belonging to one genotype sampled during winter. Results show that genes encoding transcription factors, defence related proteins, enzymes involved in phenylpropanoid biosynthesis and plant cell wall modification are upregulated in transition zone compared to sapwood. Hormones, ethylene and jasmonate especially, seem to play an important role during sapwood maturation.

Les protéines LIM constituent une famille de molécules régulatrices possédant dans leur séquence protéique un ou plusieurs motifs en doigts de zinc – les domaines LIM – dont la fonction principale est de diriger les interactions protéine-protéine. Les protéines LIM ont ainsi la capacité d'interagir avec de multiples partenaires protéiques, et participent à l'assemblage et au maintien de certains des complexes macromoléculaires présents au sein de la cellule. La plupart des protéines LIM ont été caractérisées dans les cellules animales, où elles sont impliquées dans l'organisation du cytosquelette d'actine, ainsi que dans la régulation de la transcription. A ce jour, seules quelques protéines LIM ont été décrites chez les végétaux. La fonction de ces protéines LIM végétales reste encore à identifier. Afin de préciser le rôle des protéines LIM chez le tournesol, nous avons choisi comme modèle expérimental le protoplaste d'hypocotyle de tournesol, en raison de la possibilité de moduler son développement en fonction des conditions de culture.<br />Nous avons étudié l'expression des gènes LIM précédemment décrits chez le tournesol dans les protoplastes par RT-PCR. Nous avons détecté un transcrit pour le gène HaWLIM-1, mais pas pour les deux autres gènes HaPLIM-1 et HaPLIM-2. Des anticorps polyclonaux spécifiques de la protéine HaWLIM-1 reconnaissent en immunoblot deux polypeptides distincts, dont les masses moléculaires sont respectivement de 52 kDa et 78 kDa. Ces masses moléculaires sont nettement supérieures à la taille attendue pour la protéine HaWLIM-1. Ces résultats indiquent que la protéine n'est pas présente sous forme de monomères dans les protoplastes, mais qu'elle participe à la formation de complexes protéiques stables.<br />L'étude par immunocytologie de la localisation intracellulaire de la protéine HaWLIM-1 révèle que cette protéine est présente simultanément dans deux compartiments distincts : le noyau et le cytoplasme. Dans le noyau, elle s'accumule préférentiellement dans le nucléole, et pourrait jouer un rôle dans la régulation de la transcription des gènes des ARNr, ou dans l'assemblage des ribosomes. Dans le cytoplasme, différentes approches, incluant des expériences de double-marquage et de déstructuration de composants du cytosquelette, ont permis de mettre en évidence une très forte colocalisation de la protéine HaWLIM-1 avec les microtubules, ce qui suggère un rôle pour cette protéine dans l'organisation du cytosquelette.<br />Lors de la culture des protoplastes, le gène HaWLIM-1 s'exprime constamment, avec cependant des variations dans le niveau d'expression. Des expériences d'immunoblot utilisant les anticorps spécifiques de la protéine HaWLIM-1 indiquent que de nouveaux polypeptides, de masses moléculaires égales à 35 kDa, 42 kDa et 64 kDa, apparaissent au cours de la culture. Cette observation suggère que la protéine HaWLIM-1 possède la capacité de s'associer et de se dissocier avec de nouveaux complexes protéiques au cours du développement. La protéine HaWLIM-1 est associée aux microtubules pendant tous les stades de la division : elle est présente au niveau de la bande préprophasique à la fin de l'interphase, au niveau du fuseau mitotique pendant la mitose, et au niveau du phragmoplaste pendant la cytokinèse. Ces observations semblent indiquer que la protéine HaWLIM-1 occupe une fonction importante au niveau des microtubules.