Chez la paramécie, l'épiplasme se présente sous forme d'écailles indépendantes disposées autour de chaque appareil ciliaire et composées d'une multitude de protéines appelées épiplasmines. Dans une première partie, nous avons contribué à l'annotation du génome macronucléaire de Paramecium tetraurelia à partir de la séquence de 2 épiplasmines (EPI-1 et EPI-2) et identifié 39 gènes supplémentaires. L'analyse des séquences indique que la signature de cette nouvelle famille est un domaine de 79 acides aminés. L'expression de l'épiplasmine 1 couplée à la GFP confirme la localisation de cette protéine au niveau des écailles épiplasmiques. La deuxième partie porte sur l'analyse fonctionnelle d'épiplasmines à partir d'une approche ARN interférence. Nous avons obtenu un phénotype caractérisé par un blocage répété de la cytocinèse conduisant à des organimes monstrueux qui sont finalement lysés après 72 h d'induction. L'analyse en microscopie à fluorescence a révélé l'absence de sillon de division.

L'épiderme humain est un tissu en renouvellement constant où l'équilibre entre les cellules nouvellement formées et les cellules perdues par desquamation est maintenu par la division asymétrique des cellules souches produisant deux cellules filles différentes : l'une possédant la capacité de s'auto-renouveler et l'autre engagée dans la différenciation en plusieurs lignées cellulaires reconstituant l'épiderme et ses appendices. De récentes découvertes suggèrent que les cellules souches altérées, appelées cellules initiatrices de tumeur ou cellules souches cancéreuses, seraient à l'origine du développement tumoral. Par conséquent, l'éradication ciblée de ces cellules pourrait traiter les cancers. Nos études avaient pour but d'identifier et de caractériser les cellules souches cancéreuses dans des tumeurs de peau et d'évaluer l'implication de la voie de signalisation de l'Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) dans le contrôle de leur auto-renouvellement et leur potentiel de différenciation. Nous avons trouvé de rare kératinocytes mitotiques avec une distribution asymétrique de l'EGFR et nous avons déterminé que sa présence à la surface était liée au destin normal ou cancéreux des cellules. Bien qu'essentiel pour la prolifération, la différenciation et la survie des cellules épithéliales, EGFR n'était pas présent à la surface des cellules aux propriétés de cellules souches comme la quiescence, leur compétence à produire des cellules filles fonctionnellement différentes, leurs potentiels de prolifération et de clonogénicité élevés, leur capacité à former des sphères et l'expression de marqueurs de cellules souches. Au contraire, les kératinocytes exposant l'EGFR ont acquis un phénotype plus différencié, démontrant que l'EGFR contrôle un basculement du compartiment de cellules souches à celui de cellules d'amplification transitoire. Ce basculement était associé avec des changements dans le profil d'expression de protéines du cycle cellulaire ou contrôlant la survie et la mitochondrie qui variaient entre les cellules normales et cancéreuses. A partir de nos résultats, nous proposons un modèle dans lequel EGFR fonctionne comme un déterminant du destin des kératinocytes qui équilibre entre la quiescence et la prolifération/différenciation des cellules souches épidermiques durant la mitose. Cet équilibre semble clairement mal fonctionner dans le cancer. Nous avons précédemment montré que la différenciation des kératinocytes partage certains aspects de la signalisation apoptotique et est stimulée par les ROS, nous proposons donc que l'acquisition de l'EGFR à la surface cellulaire active la prolifération cellulaire et par conséquent, la production des ROS. De façon importante, notre étude suggère fortement que les cellules EGFR négatives peuvent constituer le compartiment reproductif de la tumeur responsable du maintien et du développement tumoral, donc fournir un aperçu mécanistique de l'inefficacité des thérapies actuelles anti-EGFR.

L'influence d'un revêtement de type RGD sur du Ticp sur l'adhésion, l'étalement et la minéralisation des ostéoblastes a été étudié. Ce revêtement accélérait la vitesse de minéralisation et augmentait la surface des zones de minéralisation. Des CNTs fonctionnalisés ont été utilisés pour induire la calcification dans le but de mimer in vitro la minéralisation des fibres de collagène dans le tissu osseux. Après 14 jours d'incubation dans un liquide biosynthétique, les CNTs fonctionnalisés ont induit la formation de calcosphérites, similaires à ceux formés dans le woven bone. Ce modèle de calcification in vitro biomimétique, mis au point sur des polymères dans notre laboratoire, a permis d'étudier l'incorporation du Sr2+ dans le minéral osseux et sa désorption. Sr2+ a été incorporé dans le minéral lors de la calcification sans induire de changement des paramètres du cristal ou de la cristallinité quelque soit la concentration initiale en Sr2+. La désorption du Sr2+ a été rapide initialement avec libération de 20 à 25 % en 16 jours, puis plus lente pour atteindre 30 % après 61 jours. Enfin, les observations en cytodynamique ont permis de voir les premières étapes d'adhésion cellulaire et de colonisation du β-TCP. Les séquences vidéo réalisées sur 8 jours de culture, ont permis d'observer la prolifération des ostéoblastes (SaOs-2) qui sembla se produire en direction des particules de β-TCP pour venir en contact direct avec les particules. Les macrophages (J774-2 et macrophages péritonéaux de souris) ne proliféraient pas mais venaient au contact direct des particules pour les dégrader. Les observations MEB ont permis de constater que les cellules émettaient des prolongements cytoplasmiques et s'étiraient pour venir se fixer et ensuite s'étaler à la surface du biomatériau. Les données obtenues grâce aux observations faites avec la vidéomicroscopie sur long terme nous ont permis de confirmer la cytocompatibilité et la biodégradabilité du β-TCP.

La conception des protéines ou ‘protein design' a pour but de développer des protéines possédant de nouvelles caractéristiques structurales et/ou fonctionnelles. Le principe consiste à identifier parmi toutes les séquences compatibles avec le repliement d'intérêt, celles qui vont conférer à la protéine, la fonction désirée. La procédure générale est réalisée en deux étapes. La première consiste à calculer une matrice d'énergie contenant les énergies d'interactions entre toutes les paires de résidus de la protéine en autorisant successivement tous les types d'acides aminés dans toutes leurs conformations possibles. La seconde étape, ou ‘phase d'optimisation', consiste à explorer simultanément l'espace des séquences et des conformations afin de déterminer la combinaison optimale d'acides aminés étant donné le repliement de départ. Ensuite, différents filtres peuvent être appliqués pour sélectionner les séquences fonctionnelles (étant donné le repliement d'intérêt) des non fonctionnelles. La première étape a consisté au développement de la procédure de ‘protein design', en particulier, à la mise en place et à l'optimisation de la fonction d'énergie ainsi qu'à l'implémentation de l'algorithme d'optimisation. Nous avons montré que notre procédure est robuste puisqu'elle a fait ses preuves dans des applications très diverses telles que la prédiction de l'orientation des chaînes latérales, la prédiction des changements de stabilité ou d'affinité associés à des mutations ponctuelles, ou encore la production de séquences de type natif pour un jeu de protéines globulaires. Pour l'ensemble de ces applications, la qualité des résultats obtenus est comparable à celle observée chez d'autres groupes. Ensuite, nous avons appliqué notre procédure à des systèmes plus complexes tels que les systèmes protéine:ligand. Nous nous sommes intéressés à l'aspartyl-ARNt synthétase (AspRS) et l'asparaginyl-ARNt synthétase (AsnRS). Ces enzymes jouent un rôle crucial dans la traduction du code génétique. Les synthétases fixent leur acide aminé spécifique sur leur ARNt correspondant établissant ainsi l'intégrité du code génétique. Tout d'abord nous avons réalisé le ‘design' des sites actifs d'AspRS et d'AsnRS en présence de leur ligand natif et non natif afin d'évaluer les performances de notre procédure. La qualité des séquences prédites est comparable à celle observée pour les protéines globulaires entières. Par ailleurs, nous avons montré que notre procédure était sensible à la nature du ligand présent dans la poche. Enfin, nous avons réalisé le ‘design' d'un nombre limité de positions dans le site actif de l'AsnRS de façon à ce qu'elle lie préférentiellement l'aspartate au détriment de l'asparagine. Un jeu de mutants prometteurs fut retenu. Leur stabilité et affinité pour les ligands natifs et non natifs est actuellement analysé par des simulations de dynamique moléculaire.

Les leucémies aigües myéloblastiques (LAM) sont des proliférations malignes de blastes myéloïdes bloqués dans la différenciation. Jusqu'à ce jour, la leucémie aigüe promyélocytaire est le seul soustype de LAM à bénéficier d'un traitement rétablissant la différenciation qui repose sur la combinaison d'acide tout-trans rétinoïque ou de trioxyde d'arsenic à la chimiothérapie. Ce travail démontre que le ciblage de l'homéostasie du fer constitue une nouvelle approche thérapeutique différenciante pour tous les autres sous-types de LAM. En effet, la privation en fer provoque la différenciation des blastes myéloïdes et des progéniteurs CD34+ de sang de cordon vers le lignage monocytaire par la production d'espèces réactives de l'oxygène et l'activation de la voie des MAPkinases. L'analyse du transcriptome de la lignée leucémique HL60 a révélé que 30% des gènes modulés par la privation en fer sont communs avec ceux modulés par la vitamine D (VD). La privation en fer agit en synergie avec la VD via l'activation des MAPkinases et l'augmentation d'expression du récepteur de la VD (VDR). Ce mécanisme a été vérifié in vitro sur plusieurs lignées leucémiques et son efficacité démontrée in vivo dans un modèle de xénogreffe de souris immunodéficientes. Enfin, l'administration d'un chélateur de fer associé à la VD chez un patient leucémique a permis de corriger les cytopénies et d'induire la différenciation des blastes. L'association d'un chélateur de fer à la VD constitue donc une nouvelle approche thérapeutique différenciante pour les LAM et son efficacité en association à la chimiothérapie doit être évaluée par une étude clinique à grande échelle.

Le rôle du mélanocyte dans la pigmentation de la peau n'est plus a démontré, par contre son rôle photoprotectif est controversé. Le rôle du mélanocyte a été étudié en comparant des épidermes reconstruits avec 100 % de kératinocytes et des épidermes reconstruits avec 95 % de kératinocytes et 5 % de mélanocytes. Dans un premier temps, l'effet d'une irradiation UVB aiguë a été étudié sur ces deux types de reconstructions, puis l'étude a été élargie aux effets des UVA et des UVA+B. Ces études ont permis de montrer, qu'après irradiation, la présence de mélanocytes au sein de l'épiderme reconstruit prévient l'apoptose sans pour autant protéger de façon significative de la formation des lésions directes de l'ADN (CPD et 6-4PP) et permet le maintien du rapport SOD/Catalase (principales enzymes antioxydantes). Par contre, la présence de mélanocytes au sein de l'épiderme amplifie les oxydations lipidiques et protéiques UV-induites mais semble prévenir l'oxydation de l'ADN. Les mélanocytes possèdent en plus de la mélanine, une plus grande concentration en acides gras polyinsaturés membranaires que les kératinocytes. Afin d'estimer quelle est la part de la mélanine et quelle est celle des acides gras polyinsaturés mélanocytaires dans les réponses UV-induites, des épidermes reconstruits avec des kératinocytes ont été suppléméntés avec des acides gras polyinsaturés. Cette étude a permis de mettre en évidence que ce sont les acides gras qui induisent l'amplification des oxydations lipidiques et protéiques alors que la mélanine protège l'ADN de l'oxydation induite par la lipoperoxydation. Ces différentes études ont également permis de montrer que face aux UV, l'épiderme reconstruit se comporte de façon similaire à l'épiderme normal in-vivo. Dans un dernier temps, des crèmes solaires et des antioxydants systémiques ont été testés et ont permis de confirmer que le modèle d'épiderme reconstruit est tout à fait adapté au test de molécules photoprotectrices.

Les glycosyltransférases et les lectines sont deux familles de protéines impliquées respectivement dans la biosynthèse et la reconnaissance spécifique des glucides. Une partie de ces travaux a été consacrée à la mise à jour de la base de données des structures cristallographiques de glycosyltransférases. La modélisation par homologie de certaines glycosyltransférases d'intérêt biologique dont les structures cristallographiques n'ont pas encore été résolues a été effectuée. Des simulations de dynamique moléculaire de la glycosyltransférase LgtC, qui participe à la biosynthèse des lipooligosaccharides (LOS) chez la bactérie Neisseria meningitidis, ont permis de suggérer un mécanisme de réaction.<br />La lectine PA-IIL de Pseudomonas aeruginosa présente une affinité inhabituellement forte pour le fucose. Les calculs quantiques sur un modèle incluant le site de liaison de la lectine en complexe avec le fucose ont montré que la l'interaction forte entre la protéine et le ligand pourrait partiellement être causée par une délocalisation importante des charges électrostatiques.

L'apparition au sein d'une peau homogène, composée d'un épiderme et d'un derme dense sous-jacent, des structures primaires des annexes cutanées (placode épidermique et condensation dermique) est un événement complexe tant au niveau des modifications morphologiques que du nombre de molécules impliquées. Tout au long de mes travaux de thèse, j'ai étudié les facteurs moléculaires gouvernant l'organisation cellulaire du derme avant et pendant la mise en place des condensations dermiques.<br />De part l'utilisation de techniques originales in vitro, j'ai identifié les mécanismes moléculaires régissant : l'arrêt de la prolifération cellulaire, événement précédant la formation de la condensation et gouverné par la protéine p21WAF1/CIP1 ; la migration cellulaire, indispensable à la mise en place de la condensation et nécessitant l'engagement des Intégrines sur des molécules de Fibronectine contenant l'exon EIIIA ; ainsi que la chémo-attraction médiée par BMP-7 et arrêtée par BMP-2. Enfin, j'ai montré que les facteurs nécessaires à la stabilisation de cette structure, impliquent à la fois les Intégrines et la signalisation Notch.<br />Grâce à une collaboration avec un mathématicien, nous proposons un modèle mathématique in silico intégrant l'ensemble de ces paramètres. Ce modèle rend compte, en reproduisant l'apparition et la distribution des primordia plumaires observées in vivo, non seulement de mes propres résultats biologiques, mais explique aussi les résultats ayant conduit depuis 1998 à classer la signalisation BMP comme inhibitrice de la formation plumaire.

Le travail présenté étudie les dénominateurs communs et les différences entre la maladie d'Alzheimer et les pathologies à prion.

L'identification et la neutralisation des cibles moléculaires impliquées dans les mécanismes de radiorésistance des glioblastomes, approche développée au laboratoire, vise à diminuer le risque de récidive à l'intérieur du volume irradié et donc à allonger la survie des patients. Les travaux antérieurs du laboratoire ont démontré le rôle potentiel de l'interleukine-6 (IL-6) dans les mécanismes anti-apoptotiques impliqués dans la radiorésistance. Nous avons tout d'abord contribué à la validation de l'Interleukine-6 en tant que cible potentielle en rapportant l'association entre une amplification avec surexpression du gène IL-6 et un mauvais pronostic dans une série de 36 glioblastomes. La médiane de survie chute de 22 à 6 mois entre le groupe IL-6 non amplifié et amplifié. Bien que nous n'ayons pas établi de corrélation entre la radiorésistance intrinsèque et le niveau d'expression et de production d'IL-6 in vitro, les données de la littérature nous ont incité à explorer le potentiel thérapeutique d'un blocage des voies PI3K/Akt et JAK/STAT3 situées en aval de l'IL-6. L'inhibition de la voie Akt, dont l'activation a été corrélée à la radiorésistance intrinsèque, permet de radiosensibiliser les glioblastomes in vitro alors que celle de la voie STAT3 s'est révélée sans impact sur la sensibilité à l'irradiation. En accord avec ces résultats, la 2ème approche, consistant en l'utilisation d'anticorps dirigés contre l'IL-6 ou les sous unités qui composent son récepteur conduit à une inactivation de la voie STAT3 sans impact sur la radiorésistance. Au vu des données apportées par ce travail il semble que l'IL-6, malgré son statut de facteur de pronostique, et la voie STAT3 ne soient pas impliqués dans la radiorésistance intrinsèque. Notre hypothèse, en accord avec la littérature, est que l'activation aberrante de la voie STAT3 dans les gliomes, via la production d'IL-6, serait impliquée dans les modifications du micro-environnement telles que l'immunosuppression et l'angiogénèse. Pour tenter d'expliquer la différence de survie entre les deux groupes de patients de la série de 31 glioblastomes, une analyse comparative est en cours d'une part sur les profils génomiques et transcriptomiques par micro-arrays, et d'autre part sur l'état d'activation des voies de signalisation anti-apoptotiques Akt et STAT3 par immunohostochimie. Les données obtenues seront interprétées conjointement avec le niveau d'amplification/expression de l'IL-6 et la survie des patients. Les résultats présentés ici constituent un argumentaire pour l'utilisation d'inhibiteurs d'Akt en combinaison avec l'irradiation dans de futurs essais cliniques.