Les sphingolipides (SLs) sont des composants essentiels de la membrane plasmique et des molécules bioactives impliquées dans la régulation de l'apoptose et de la motilité cellulaire induite par les récepteurs de mort (DR). Les altérations du métabolisme sphingolipidique sont fréquentes dans le cancer, incluant le mélanome et le cancer du sein, et semblent contribuer à la progression tumorale. Dans les cellules non cancéreuses, le céramide synthétisé de novo est principalement converti en sphingomyéline (SM) et, dans une moindre mesure, en glucosylcéramide (GlcCer). Notre étude indique que les SM synthases (SMS1 et SMS2) sont peu exprimées dans les biopsies de mélanome humain et une faible expression de SMS1 est associée à un mauvais pronostic chez les patients atteints de mélanome métastatique. En conséquence, les cellules de mélanome humain ont une faible activité SMS et un contenu plus élevé de GlcCer que de SM. De plus, la restauration de l'homéostasie SM-GlcCer dans les lignées cellulaires de mélanome humain, en exprimant la SMS1 ou en inhibant la GCS, lève la résistance aux ligands pro-apoptotiques des DRs comme CD95L ou TRAIL. Une littérature récente indique que le CD95L pro-apoptotique transmembranaire peut être clivé en un ligand pro-migratoire soluble, le cl-CD95L. La signalisation de motilité des cellules cancéreuses induite par le cl-CD95L reste mal définie. Nous avons identifié la voie de la sphingosine-1-phosphate (S1P) comme une voie sphingolipidique régulée par cl-CD95L. Ainsi, dans les cellules de cancer du sein triple négatif (TNBC), le cl-CD95L induit une augmentation du taux de S1P associée à une augmentation de l'activité de la sphingosine kinase 1 (SK1) et à une diminution de l'activité de la sphingosine-1- phosphate lyase (SPL). L'ensemble de nos résultats souligne le rôle potentiel des SLs dans la régulation des voies de signalisation apoptotique et non-apoptotique activées par les DRs. La reprogrammation du métabolisme des SL pourrait sensibiliser les cellules cancéreuses à CD95L ou TRAIL et/ou inhiber la migration des cellules cancéreuses induite par cl-CD95L. Ces observations expérimentales pourraient permettre le développement de nouvelles approches pour le traitement du mélanome ou du cancer du sein. / Sphingolipids (SLs) are essential plasma membrane components and bioactive molecules implicated in the regulation of death receptor (DR)-mediated apoptosis and cell motility. SL metabolism alterations are frequent in cancer, including melanoma and breast cancer, and likely to contribute to cancer progression. In non-cancer cells, de novo synthesized ceramide is mainly converted to sphingomyelin (SM) and, to a lesser extent, glucosylceramide (GlcCer). Herein, we provide evidence that both SM synthases 1 (SMS1) and 2 (SMS2) were expressed at low levels in human melanoma biopsies and low SMS1 expression was associated with a worse prognosis for metastatic melanoma patients. Accordingly, human melanoma cell lines exhibited low SMS activity and expressed higher content of GlcCer than SM. Importantly, restoring the SM-GlcCer homeostasis in human melanoma cell lines, either by expressing SMS1 or by inhibiting GCS, overcame melanoma resistance to pro-apoptotic DR ligands such as CD95L or TRAIL. A growing body of evidence indicates that the transmembrane pro-apoptotic CD95L can be cleaved to release a pro-migratory soluble ligand, cl-CD95L. The motility signaling pathway elicited in cancer cells by cl-CD95L remains poorly defined. Here, we identified the S1P pathway as a SL pathway regulated by cl-CD95L. In Triple negative breast cancer (TNBC) cells, cl-CD95L induced an augmentation of S1P level associated with increased sphingosine kinase 1 (SK1) activity and decreased sphingosine-1-phosphate lyase (SPL) activity. Collectively, our results underscore the putative role of SLs in the regulation of DR-mediated apoptotic and nonapoptotic signaling pathways. Reprogramming SL metabolism in cancer can sensitize cancer cells to pro-apoptotic CD95L or TRAIL and/or impair cancer cell migration in response to the pro-migratory cl-CD95L. These findings could enable the development of new approaches for the treatment of melanoma and breast cancer.

Le transport de substances dotées de propriétés pharmacologiques au travers de la membrane plasmique ainsi que leur accès aux divers compartiments intracellulaires, en particulier le compartiment cytoplasmique et nucléaire, demeure un obstacle pour la recherche biotechnologique et biomédicale et pour l'industrie pharmaceutique. Parmi les moyens actuellement connus pour introduire des substances dans les cellules, les peptides de translocation également dénommés CPPs (Cell- Penetrating-Peptides) qui représentent des vecteurs particulièrement intéressants. Dans le présent travail, nous avons utilisé trois CPPs, Tat, penétratine et un analogue de la maurocalcine (MCaAbu) pour la délivrance de la doxorubicine (Dox), une drogue utilisée en chimiothérapie anticancéreuse et dont son effet est limité par la résistance des cellules tumorales. Afin d'évaluer l'efficacité des trois complexes formés (Dox-CPPs), deux modèles cellulaires du cancer mammaire ont été utilisés; les cellules MDA-MB 231 et les cellules MCF7 qui présentent une sensibilité différente à la drogue seule. Notre étude nous a permis de monter en premier lieu que les trois CPPs utilisés représentent de puissants vecteurs pour l'entrée de la Dox à l'intérieur des cellules et que la conjugaison de la drogue a contourné la résistance des cellules MDA-MB 231 à la Dox. Nous avons également montré que la distribution de la Dox est plutôt nucléaire à l'état libre et cytoplasmique lorsqu'elle est couplée aux CPPs. Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons montré que la Dox ainsi que les Dox-CPPs induisent l'apoptose des cellules MDA-MB 231 et que cet effet est observé en traitant les cellules avec une dose cinq fois plus faible de Dox-CPPs par rapport à la Dox. Cette mort est dépendante des caspases et implique la voie mitochondriale. De plus, l'apoptose induite par la Dox est médiée par les radicaux oxygénés (ROS). Ceux-ci sont en partie impliqués lors de l'apoptose induite par les Dox-CPPs puisque l'utilisation d'un inhibiteur de ROS inhibe partiellement l'apoptose induite par ces composés. Nous avons montré également que la surexpression de Bcl-2 protège l'apoptose induite par la Dox et partiellement par les Dox-CPPs, ce qui suggère qu'une autre voie est impliquée dans l'apoptose induite par les Dox-CPPs et qui expliquerait la plus forte toxicité de ces composés. Concernant cette deuxième voie nous avons pu montré que les récepteurs de mort TRAIL sont bien impliqués dans l'apoptose induite par les Dox-CPPs via la clustérisation membranaire des récepteurs de mort DR4 et DR5. Cette clustérisation modifie le taux d'expression de ces récepteurs membranaires et à l'origine d'une sensibilisation des cellules MDA-MB 231 au TRAIL endogène au cours de l'apoptose induite par les Dox-CPPs. Une telle sensibilisation au TRAIL est à l'origine de la génération de céramide, qui constitue une autre voie d'induction d'apoptose par les Dox-CPPs en plus de la voie mitochondriale. L'ensemble de ces résultats devraient nous permettre à valoriser la stratégie de couplage des CPPs à des agents antitumoraux afin d'améliorer leur effet et de mieux comprendre les voies de signalisation de la mort induite suite au couplage. Ceci pourrait à terme conduire à la conception de nouveaux analogues d'index thérapeutique plus élevé. Mots clés : Cell- Penetrating-Peptides, Doxorubicine, résistance cellulaire, apoptose, ROS, récepteurs de mort, céramide.

Les antidépresseurs de type Inhibiteur Sélectif de la Recapture de la Sérotonine (SSRI pour Selective Serotonin Reuptake Inhibitor), dont fait partie la fluoxétine (Prozac), ont été décrits comme capables de déclencher l'apoptose de cellules tumorales in vitro et in vivo, suggérant une potentielle utilisation de ces molécules pour le traitement des cancers. Cependant, leur mécanisme apoptotique n’a pas été élucidé à ce jour. Nous avons donc entrepris de déterminer les étapes de l'apoptose induite par la fluoxétine et les SSRI, en choisissant comme modèle d'étude des lignées cellulaires de lymphomes non-Hodgkiniens agressifs. Nous avons identifié plusieurs étapes de la signalisation apoptotique de la fluoxétine et des SSRI. Ainsi, via une inhibition de la chaîne respiratoire, la fluoxétine induit la production d'espèces réactives de l'oxygène conduisant à la surexpression des récepteurs de mort DR4 et DR5 ; la fluoxétine induit également l'activation de la caspase-8. DR4 et DR5 sont très probablement la cause de l'apoptose induite par la fluoxétine, de façon indépendante de leur ligand, TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand). Partant du constat que l'utilisation de TRAIL comme antitumoral pour le traitement des lymphomes présente des résultats prometteurs mais encore insuffisants, nous avons envisagé que la fluoxétine puisse augmenter l’apoptose induite par TRAIL dans ce type de tumeurs. Nous montrons en effet qu'une association de la fluoxétine avec TRAIL conduit à une augmentation de l'action apoptotique de TRAIL dans les lignées de lymphomes non-Hodgkiniens agressifs. De plus, nos résultats montrent que la fluoxétine induit la mort cellulaire d'une façon indépendante de la caspase-8. Cet effet semble trouver son origine dans une surcharge en calcium de la mitochondrie, alimentée par une stimulation maintenue de l'entrée de calcium par les canaux CRAC (Calcium Release Activated Calcium). En conclusion, les éléments de la signalisation calcique et apoptotique de la fluoxétine et des SSRI que nous avons identifiés encouragent leur utilisation en thérapie, et notamment dans le cadre d'associations avec TRAIL et d'autres molécules pour permettre une augmentation de l'apoptose des cellules tumorales, voire des cellules résistantes à l'apoptose induite par TRAIL. / Selective Serotonin Reuptake Inhibitor (SSRI) antidepressants, such as fluoxetine (Prozac), have been shown to induce apoptosis in cancer cells in vitro and in vivo, suggesting a potential use for cancer treatment. However, their apoptotic mechanism has remained undetermined until now. Therefore, we have undertaken the determination of fluoxetine- and SSRIs-induced apoptotic signalling, our study model being aggressive Non-Hodgkin's Lymphoma (NHL) cell lines. We have identified several steps of the apoptotic signalling of fluoxetine and the SSRIs. Thus, via an inhibition of the respiratory chain, fluoxetine induces a reactive oxygen species production leading to the overexpression of the death receptors DR4 and DR5; fluoxetine also induces caspase-8 activation. DR4 and DR5 are probably the cause of fluoxetine-induced apoptosis, independently of their ligand TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand). Knowing that TRAIL as an antitumoral agent for lymphoma treatment has shown promising but insufficient results, we have hypothesized that fluoxetine could increase TRAIL-induced apoptosis in these tumors. Indeed, we show that fluoxetine in association with TRAIL leads to an increase in TRAIL-induced apoptosis in aggressive NHL cell lines. Furthermore, our results show that fluoxetine induces cell death in a caspase-8–independent manner. This effect seems to originate from a mitochondrial calcium overload fueled by a sustained calcium entry from the CRAC (Calcium Release Activated Calcium) channels. In conclusion, the calcium pathway and the apoptotic steps of the fluoxetine's and the SSRIs' signalling that we have delineated encourage their use in therapy, especially in association with TRAIL and other molecules in order to enable an increase in cancer cells' apoptosis, or even in cancer cells which are resistant to TRAIL-induced apoptosis.

L'hormonothérapie permet une régression du cancer de la prostate métastatique par apoptose des cellules tumorales. L'évolution inéluctable de la maladie vers un stade hormono-indépendant et apoptose-résistant souligne l'importance de l'étude des gènes androgéno-sensibles impliqués dans l'apoptose de la prostate normale et pathologique, tels que le ligand TRAIL et ses récepteurs DR4 et DR5 pro et, DcR1 et DcR2 anti-apoptotiques.<br />Nous rapportons une corrélation entre la régulation du récepteur DcR2, le statut hormonal et l'apoptose dans la prostate de rat et dans la lignée humaine hormonosensible de cancer prostatique, LNCaP. Nous montrons que l'expression de DcR2 joue un rôle régulateur de l'apoptose TRAIL-induite dans la cellule LNCaP. Enfin, dans un modèle de cancer prostatique humain hormonosensible greffé chez la souris nude traitée par un anti-androgène nous montrons l'expression des récepteurs au TRAIL, et de certains gènes renseignant sur la relation entre croissance tumorale et statut hormonal.

TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) est une protéine du système immunitaire appartenant à la famille du TNF (Tumor necrosis factor). L'intérêt de TRAIL en thérapie anti-cancéreuse réside dans sa capacité à induire la mort par apoptose des cellules tumorales, sans exercer de toxicité envers les cellules saines. Le principal frein à l'utilisation de TRAIL est la survenue de mécanismes de résistance à TRAIL dans certaines tumeurs. Mon travail de thèse a consisté à étudier ces mécanismes de résistance à TRAIL et à élaborer des stratégies visant à les contourner. Dans un premier temps, mon intérêt s'est porté sur le récepteur antagoniste TRAIL-R4, qui est capable de fixer TRAIL sans engager de signal de mort. Nous avons montré pour la première fois que TRAIL-R4 est à l'origine de l'induction de voies de signalisation intracellulaires de survie et de prolifération dans le modèle HeLa de carcinome du col de l'utérus. Ces cellules résistantes peuvent néanmoins être sensibilisées à l'action de TRAIL par un pré-traitement chimiothérapeutique conventionnel (cisplatine, étoposide ou 5-FU). Cette sensibilisation ne fait pas intervenir la voie mitochondriale de l'apoptose, mais passe par une augmentation du recrutement et de l'activation de la caspase-8 au sein du complexe initiateur de mort (DISC). Dans un deuxième temps, mon travail s'est focalisé sur des lymphomes B non-Hodgkiniens particulièrement agressifs, les lignées VAL et RL. La résistance à TRAIL de ces lymphomes est due à un blocage de la voie mitochondriale de l'apoptose, notamment en raison de l'expression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2, Mcl-1 et survivine. Mon objectif a été d'élaborer une stratégie thérapeutique visant à contourner cette résistance. Dans ce contexte, nous avons évalué l'efficacité d'un composé polyphénolique issu des plantes, la quercétine. Nos résultats montrent que la combinaison de la quercétine et de TRAIL permet de tuer de façon synergique les lymphomes VAL et RL. Le mécanisme moléculaire de cette synergie comprend l'activation de la voie mitochondriale de l'apoptose, ainsi que l'inhibition de Mcl-1 et de la survivine. L'ensemble de ce travail est rassurant quant à l'utilisation de la cytokine TRAIL en thérapie anti-tumorale, dans le cadre d'une thérapie combinée.

TRAIL (Tumor necrosis factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand) induit l’apoptose des cellules cancéreuses de manière sélective, tout en épargnant les cellules saines. TRAIL peut aussi activer des voies de signalisation de survie cellulaire dans des cellules cancéreuses résistantes à l’induction de la mort programmée après traitement. Les cellules cancéreuses que nous avons étudiées sont caractérisées par un phénotype de mort cellulaire fractionnée en réponse à TRAIL, c’est-à-dire que seule une fraction de la population meurt en présence de TRAIL, alors que l’autre fraction active la survie cellulaire. Lors de notre étude nous avons montré que les récepteurs de TRAIL jouent un rôle particulièrement important dans l’engagement de ces cellules vers l’une ou l’autre de ces voies. De telles recherches permettront de mieux appréhender la complexité de la signalisation TRAIL-dépendante, et de proposer des thérapies combinées qui réduiront la progression tumorale induite par TRAIL. / Tumor necrosis factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand (TRAIL) gives a promise for cancer selective therapy as it exclusively induces apoptosis in tumor cells while sparing normal tissues. TRAIL also activates pro-survival pathways in cancer cells resistant to TRAIL-induced cell death. In this study we used clonal populations of cancer cells that respond in fractional killing upon TRAIL treatment: only a fraction of a clonal cancer cell population dies while another survives, activates non-apoptotic cascades and proliferates. We found that TRAIL receptors play an important role in the bifurcation of TRAIL signaling in populations of cancer cells that respond in fractional killing upon TRAIL challenge. These results will provide insights for evaluating whether combined therapies targeting components promoting the activation of pro-survival signaling would allow the use of rhTRAIL/DR5 agonistic antibodies to activate TRAIL-mediated killing while avoiding TRAIL-induced tumor progression.

TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) est une protéine du système immunitaire appartenant à la famille du TNF (Tumor necrosis factor). L'intérêt de TRAIL en thérapie anti-cancéreuse réside dans sa capacité à induire la mort par apoptose des cellules tumorales, sans exercer de toxicité envers les cellules saines. Le principal frein à l’utilisation de TRAIL est la survenue de mécanismes de résistance à TRAIL dans certaines tumeurs. Mon travail de thèse a consisté à étudier ces mécanismes de résistance à TRAIL et à élaborer des stratégies visant à les contourner. Dans un premier temps, mon intérêt s'est porté sur le récepteur antagoniste TRAIL-R4, qui est capable de fixer TRAIL sans engager de signal de mort. Nous avons montré pour la première fois que TRAIL-R4 est à l'origine de l'induction de voies de signalisation intracellulaires de survie et de prolifération dans le modèle HeLa de carcinome du col de l'utérus. Ces cellules résistantes peuvent néanmoins être sensibilisées à l'action de TRAIL par un pré-traitement chimiothérapeutique conventionnel (cisplatine, étoposide ou 5-FU). Cette sensibilisation ne fait pas intervenir la voie mitochondriale de l'apoptose, mais passe par une augmentation du recrutement et de l'activation de la caspase-8 au sein du complexe initiateur de mort (DISC). Dans un deuxième temps, mon travail s'est focalisé sur des lymphomes B non-Hodgkiniens particulièrement agressifs, les lignées VAL et RL. La résistance à TRAIL de ces lymphomes est due à un blocage de la voie mitochondriale de l'apoptose, notamment en raison de l'expression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2, Mcl-1 et survivine. Mon objectif a été d’élaborer une stratégie thérapeutique visant à contourner cette résistance. Dans ce contexte, nous avons évalué l’efficacité d'un composé polyphénolique issu des plantes, la quercétine. Nos résultats montrent que la combinaison de la quercétine et de TRAIL permet de tuer de façon synergique les lymphomes VAL et RL. Le mécanisme moléculaire de cette synergie comprend l'activation de la voie mitochondriale de l’apoptose, ainsi que l'inhibition de Mcl-1 et de la survivine. L'ensemble de ce travail est rassurant quant à l'utilisation de la cytokine TRAIL en thérapie anti-tumorale, dans le cadre d'une thérapie combinée. / The TNF-family member TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) is a cytokine involved in immune anti-tumour surveillance. TRAIL is one of the most promising agents currently under investigation, as it exhibits efficient anti-cancer cytotoxicity with limited side effects on healthy cells. The problem in current cancer therapy is that some cancer cells are already resistant, or can become resistant to TRAIL-induced cell death. The aim of my thesis was to study the mechanisms of resistance to TRAIL, and to find a way to bypass it. First, we were interested in the TRAIL-R4 antagonistic receptor, which is known to bind TRAIL without inducing a death signal. We have demonstrated for the first time that TRAIL-R4 is able to induce intracellular signalling that mediates cell survival and proliferation in the cervical carcinoma HeLa cell line. However, these resistant cells could be sensitized to TRAIL by a pretreatment with standard chemotherapy (cisplatinum, etoposide or 5-FU). This chemo-sensitization does not require the mitochondrial loop of apoptosis, but is accompanied by an enhancement of caspase-8 recruitment and activation within the death-inducing signalling complex (DISC). Next, our interest focused on aggressive non Hodgkin B-lymphomas. These lymphomas are highly resistant to TRAIL because of a defect in the mitochondrial pathway of apoptosis, and through the expression of Bcl-2, Mcl-1 and survivin antiapoptotic proteins. My objective was to elucidate a strategy to restore TRAIL-sensitivity in these lymphomas. In this context, we assessed the use of quercetin, a polyphenolic compound derived from plants. Our results showed that the combination of TRAIL with quercetin efficiently killed these lymphomas in a synergistic fashion. The molecular mechanisms of the synergy include the activation of the mitochondrial pathway, and the inhibition of Mcl-1 and survivin. Taken together, these results are promising for the future use of TRAIL as a combined therapy against cancer.