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COUPLAGE DE PEPTIDES DE PENETRATION CELLULAIRE A UN AGENT ANTI-TUMORAL ET EVALUATION DE L'EFFICACITE DES COMPLEXESAroui, Sonia 23 January 2010 (has links) (PDF)
Le transport de substances dotées de propriétés pharmacologiques au travers de la membrane plasmique ainsi que leur accès aux divers compartiments intracellulaires, en particulier le compartiment cytoplasmique et nucléaire, demeure un obstacle pour la recherche biotechnologique et biomédicale et pour l'industrie pharmaceutique. Parmi les moyens actuellement connus pour introduire des substances dans les cellules, les peptides de translocation également dénommés CPPs (Cell- Penetrating-Peptides) qui représentent des vecteurs particulièrement intéressants. Dans le présent travail, nous avons utilisé trois CPPs, Tat, penétratine et un analogue de la maurocalcine (MCaAbu) pour la délivrance de la doxorubicine (Dox), une drogue utilisée en chimiothérapie anticancéreuse et dont son effet est limité par la résistance des cellules tumorales. Afin d'évaluer l'efficacité des trois complexes formés (Dox-CPPs), deux modèles cellulaires du cancer mammaire ont été utilisés; les cellules MDA-MB 231 et les cellules MCF7 qui présentent une sensibilité différente à la drogue seule. Notre étude nous a permis de monter en premier lieu que les trois CPPs utilisés représentent de puissants vecteurs pour l'entrée de la Dox à l'intérieur des cellules et que la conjugaison de la drogue a contourné la résistance des cellules MDA-MB 231 à la Dox. Nous avons également montré que la distribution de la Dox est plutôt nucléaire à l'état libre et cytoplasmique lorsqu'elle est couplée aux CPPs. Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons montré que la Dox ainsi que les Dox-CPPs induisent l'apoptose des cellules MDA-MB 231 et que cet effet est observé en traitant les cellules avec une dose cinq fois plus faible de Dox-CPPs par rapport à la Dox. Cette mort est dépendante des caspases et implique la voie mitochondriale. De plus, l'apoptose induite par la Dox est médiée par les radicaux oxygénés (ROS). Ceux-ci sont en partie impliqués lors de l'apoptose induite par les Dox-CPPs puisque l'utilisation d'un inhibiteur de ROS inhibe partiellement l'apoptose induite par ces composés. Nous avons montré également que la surexpression de Bcl-2 protège l'apoptose induite par la Dox et partiellement par les Dox-CPPs, ce qui suggère qu'une autre voie est impliquée dans l'apoptose induite par les Dox-CPPs et qui expliquerait la plus forte toxicité de ces composés. Concernant cette deuxième voie nous avons pu montré que les récepteurs de mort TRAIL sont bien impliqués dans l'apoptose induite par les Dox-CPPs via la clustérisation membranaire des récepteurs de mort DR4 et DR5. Cette clustérisation modifie le taux d'expression de ces récepteurs membranaires et à l'origine d'une sensibilisation des cellules MDA-MB 231 au TRAIL endogène au cours de l'apoptose induite par les Dox-CPPs. Une telle sensibilisation au TRAIL est à l'origine de la génération de céramide, qui constitue une autre voie d'induction d'apoptose par les Dox-CPPs en plus de la voie mitochondriale. L'ensemble de ces résultats devraient nous permettre à valoriser la stratégie de couplage des CPPs à des agents antitumoraux afin d'améliorer leur effet et de mieux comprendre les voies de signalisation de la mort induite suite au couplage. Ceci pourrait à terme conduire à la conception de nouveaux analogues d'index thérapeutique plus élevé. Mots clés : Cell- Penetrating-Peptides, Doxorubicine, résistance cellulaire, apoptose, ROS, récepteurs de mort, céramide.
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Ionic, cellular and molecular mechanisms underlying the QT prolongation and arrhythmias in diabetic cardiocomplicationsZhang, Yiqiang January 2005 (has links)
Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.
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Modulation de l'activité des CYP1A2 et CYP3A6 par des dérivés radicalaires de l'oxygèneBatonga, Joëlle January 2006 (has links)
Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.
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Conception, synthèse et évaluation de nouveaux inhibiteurs du transport de céramide : vers de nouveaux agents de sensibilisation des cellules cancéreuses chimiorésistantes / Conception, synthesis and evaluation of novel CERT mediated ceramide transport inhibitors, towards new sensitizing agents of chemoresistant cancer cellsSantos, Cécile 30 November 2015 (has links)
Au cours de leur métabolisme, les céramides, produits de novo au niveau du réticulum endoplasmique, sont transportés vers l'appareil de Golgi pour être convertis en sphingomyéline. Le mode principal de ce transport implique la protéine cytosolique CERT (CERamide Transfer). La surexpression de CERT, responsable d'un abaissement du taux intracellulaire en céramide pro-apoptotique, a été associée au phénomène de résistance aux agents chimiothérapeutiques de plusieurs lignées de cellules tumorales. L'inhibition de CERT permet de resensibiliser ces lignées cellulaires aux agents anti-cancéreux. Cependant, une seule famille d'inhibiteurs de CERT est connue à ce jour : les HPAs. A l'extrémité C-terminale de la protéine, le domaine START contient le site de liaison du céramide nécessaire à l'activité de transport de CERT. A partir de structures cristallographiques, une méthode d'identification de nouveaux ligands, combinant des outils in silico et in vitro, a été développée. La jaspine B, des analogues HPAs et des iminosucres ont été mis à jour en tant qu'antagonistes potentiels de CERT par cette méthode. Certains des composés identifiés ont été synthétisés et évalués in vitro. Des sondes fluorescentes de la jaspine B ont été conçues afin d'approfondir la compréhension de son mécanisme d'inhibition. En parallèle, un test de liaison in vitro HTR-FRET a été développé, permettant le criblage haut-débit de la Chimiothèque Nationale Essentielle. / During its metabolism, ceramides, produced de novo in the endoplasmic reticulum, are transported to the Golgi complex to be converted into sphingomyelin. The main way of this transport involves the cytosolic CERT protein (Ceramide Transfer). Overexpression of CERT, responsible for a diminution of intracellular level of proapoptotic ceramide, is associated with the phenomenon of resistance to chemotherapeutic agents in several tumor cell lines. The CERT inhibition allows to resensitize these cell lines to anticancer drugs. Yet, only a single family of inhibitors is known to date: HPAs. Located at the C-terminal region of the protein, the START domain contains the binding site of ceramide necessary for the transport activity of CERT. Based on crystallographic structures, a method for the identification of new CERT ligands, combining in silico and in vitro tools, was developed. Jaspine B, HPAs analogs and iminosugars were identified as potential antagonists using this method. Some of these compounds were synthesized and evaluated in vitro. Fluorescent probes of jaspine B were designed for a better understanding of it mechanism of action. In parallel, an in vitro HTR-FRET binding assay was developed, allowing the high-throughput screening of the National Essential Compound Library.
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Synthèse de nouveaux ligands du récepteur CD1d : applications à la vaccination anti-tumoraleEhret, Christophe 07 June 2012 (has links) (PDF)
L'objectif de cette thèse a été d'optimiser la réponse immunitaire anti-tumorale induite par les cellules dendritiques (DC) et les cellules iNKTs, en réponse à la prise en charge du KRN7000 (a-galactosyl-céramide) par la molécule CD1d située sur les DCs. Le premier axe de travail visait à synthétiser de nouveaux analogues du KRN7000, en fonctionnalisant la position C6 du sucre et en greffant un groupement phényl sur l'une des chaînes grasses. Les études in vitro ont montré que les modifications apportées par rapport au KRN7000 n'ont pas altéré la prise en charge des molécules obtenues par les DCs. Dans tous les cas, une sécrétion de cytokines a pu être observée. Des études complémentaires visant à décrire le profil cytokinique in vivo sont en cours. Le second axe a consisté en la mise au point d'une stratégie de vectorisation du KRN7000 afin de favoriser sa présentation aux DCs, en l'associant à des molécules d'intérêt comme un peptide spécifique d'une tumeur, une molécule de ciblage des DCs ou des ligands des TLRs. Dans les conditions utilisées, le phénomène d'anergie induit classiquement par l'administration répétée du KRN7000 n'a pas pu être levé. Cependant, nous avons montré d'une part que le KRN7000 vectorisé dans les liposomes est toujours pris en charge par les cellules dendritiques, et d'autre part qu'une réponse immunitaire se traduisant par la production de cytokines par les cellules iNKTs est induite.
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N-méthylation de la Phosphatidyléthanolamine, une voie métabolique aux fonctions énigmatiques : caractérisation de la voie dans la moule Mytilus galloprovincialis et rôle physiologique au cours de l’osmorégulation chez les crustacés marins / N-methylation of Phosphatidylethanolamine, a metabolic pathway with enigmatic functions : characterization of the pathway in the mussel Mytilus galloprovincialis and physiological roles during osmoregulation in marine crustaceanAthamena, Ahmed 27 June 2011 (has links)
Les fonctions physiologiques spécifiques de la voie de N-méthylation de la phosphatidyléthanolamine (PE), une des deux voies de biosynthèse de la phosphatidylcholine (PC), restent relativement énigmatiques. Il a été démontré chez les poissons euryhalins qu’un stress hyperosmotique induisait une activation de cette voie métabolique au niveau hépatique. L’objectif de notre travail était de vérifier si ce phénomène se produit aussi chez d’autres animaux euryhalins. Les études réalisées in vivo sur deux espèces de crâbes, Eriocheir sinensis et Carcinus maenas, nous ont permis de montrer que l’acclimatation en eau de mer de ces animaux active la synthèse de PC par N-méthylation de la PE dans l’hépatopancréas. Les marquages radioisotopiques montrent aussi que cette PC est échangée avec le plasma et que ce phénomène est amplifié chez les animaux en eau de mer. Ce pool de PC est utilisé comme précurseur de la bétaïne, un osmoeffecteur organique important chez ces animaux. Nous avons ensuite caractérisé la voie de N-méthylation de la PE chez un animal osmoconformeur, la moule Mytilus galloprovincialis. Les résultats, obtenus in vivo et in vitro sur les tissus isolés, démontrent qu’une activité de N-méthylation de la PE en PC est exprimée dans la glande digestive et les hémocytes circulant de M. galloprovincialis. La PC ainsi synthétisée dans ces tissus est échangée avec l’hémolymphe de l’animal. De l’ensemble de ces observations, nous pouvons conclure que la synthèse de PC par N-méthylation est largement exprimée chez les animaux marins euryhalins et qu’une des fonctions physiologiques de cette voie métabolique est de synthétisée des osmolytes organiques comme la bétaïne / The specific physiological functions of the N-methylation of phosphatidylethanolamine (PE), one of the two biosynthetic pathways of phosphatidylcholine (PC), remain relatively mysterious. It has been demonstrated in euryhaline fish that hyperosmotic stress induced activation of this pathway in the liver. The aim of our work was to verify whether this phenomenon also occurs in other euryhaline animals. In vivo studies on two species of crabs, Eriocheir sinensis and Carcinus maenas, showed that seawater acclimation activates PC synthesis by N-methylation of PE in the hepatopancreas. Radioisotopic labelling also showed that PC is exchanged with the plasma and that this phenomenon is amplified in animals in seawater. This pool of PC is used as a precursor of betaine, an important organic osmoeffector in these animals. We then characterized the process of PE N-methylation in an osmoconforming animal, the mussel Mytilus galloprovincialis. The results, obtained in vivo and in vitro on isolated tissues, show that N-methylation of PE to PC is expressed in the digestive gland and circulating haemocytes in M. galloprovincialis. The PC synthesized in these tissues is exchanged with hemolymph of the animal. From all these observations, we conclude that the synthesis of PC by N-methylation is widely expressed in marine euryhaline animals and that a physiological function of this pathway is to provide organic osmolytes such as betaine
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Études des interactions lipide/lipide du stratum corneum par spectroscopie infrarouge par transformée de FourierBonenfant, Danielle 02 1900 (has links)
Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Une étude a été entreprise dans le but de déterminer les
interactions pouvant survenir entre certains lipides impliqués
dans les fonctions de barrière de perméabilité et de
desquamation du stratum corneum. Cette étude a consisté à
étudier le thermotropisme de diverses dispersions composées de
sphingomyéline, céramide 3, acide palmitique perdeutéré,
cholestérol et sulfate de cholestérol en proportions variées,
par spectroscopie infrarouge par transformée de Fourier. Cette
étude a été également effectuée aux pH 5.2 et 7.4 afin
d'estimer l'influence de l'environnement ionique sur
1'interaction de ces lipides. Le thermotropisme des dispersions
de céramide 3 et de sphingomyéline a indiqué que le céramide 3
adopte un empilement plus serré que la sphingomyéline aux deux
pH. Les résultats ont également indiqué que l'acide palmitique
rigidifie la bicouche de sphingomyéline et fluidifie la
dispersion de céramide 3, et que la miscibilité de cet acide
gras est plus élevée avec la sphingomyéline qu'avec le céramide
3. Toutefois, la miscibilité de l'acide palmitique et du
céramide 3 est augmentée par le cholestérol et le sulfate de
cholestérol à pH 5.2, ce qui semble affecter leur
thermotropisme en induisant la formation d'une phase très
ordonnée à 37 °C. Par contre, le cholestérol et le sulfate de
cholestérol semblent accentuer la déprotonation de l'acide
palmitique en présence du céramide 3 à pH 7.4, ce qui semble
provoquer une séparation de phase de l'acide gras et du
céramide 3. Le cholestérol induit également la formation de la
phase liquide ordonnée au sein de la bicouche de sphingomyéline
en présence de l' acide palmitique aux pH 5.2 et 7.4. Toutefois,
le sulfate de cholestérol semble être moins efficace que le
cholestérol à abolir la transition de phase de la
sphingomyéline et de l 'acide palmitique.
L'analyse des résultats nous a permis de déterminer que
l'acide palmitique, le cholestérol et le sulfate de cholestérol
interagissent avec la sphingomyéline et le céramide 3 par
l'intermédiaire d' interactions hydrophobes et de van der Waals
impliquant leurs portions hydrophobes, et de liaisons hydrogène
qui impliquent leurs groupements d'interface et de tête
iv
polaire. Il ressort également que les implications de ces
lipides et du pH dans les fonctions de barrière de perméabilité
et de desquamation pourraient être purement structurales. En
fait, la structure de la tête polaire du céramide 3 permet
l'empilement serré des lipides ainsi que l'imperméabilité des
membranes, le cholestérol et le sulfate de cholestérol
augmentent la miscibilité de l'acide palmitique et du céramide
3 à pH 5.2, et l'environnement à pH 5.2 semble être nécessaire
au maintien de l'intégrité du stratum corneum.
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Mécanismes d'activation de la voie lysosomale durant l'apoptose chimio-induiteParent, Nicolas 08 1900 (has links)
L’apoptose est une forme de mort cellulaire essentielle au développement et au
maintien de l’homéostase chez les animaux multicellulaires. La machinerie apoptotiq ue
requiert la participation des caspases, des protéases conservées dans l’évolution et celle des
organelles cytoplasmiques. Les lysosomes subissent des ruptures partielles, labilisation de
la membrane lysosomale (LML), qui entraînent l’activation des cathepsines dans le
cytoplasme de cellules cancéreuses humaines en apoptose induite par la camptothecin
(CPT), incluant les histiocytes humains U-937. Ces modifications lysosomales se
manifestent tôt durant l’activation de l’apoptose, concomitamment avec la perméabilisation
de la mitochondrie et l’activation des caspases.
Une étude protéomique quantitative et comparative a permis d’identifier des
changements précoces dans l’expression/localisation de protéines lysosomales de cellules
U-937 en apoptose. Lors de deux expériences indépendantes, sur plus de 538 protéines
lysosomales identifiées et quantifiées grâce au marquage isobarique iTRAQ et LC-ESIMS/
MS, 18 protéines augmentent et 9 diminuent dans les lysosomes purifiés de cellules en
cours d’apoptose comparativement aux cellules contrôles. Les candidats validés par
immuno-buvardage et microscopie confocale incluent le stérol-4-alpha-carboxylate 3-
déhydrogénase, le prosaposin et la protéine kinase C delta (PKC-d). Des expériences
fonctionnelles ont démontrées que la translocation de PKC-d aux lysosomes est requise
pour la LML puisque la réduction de son expression par ARN interférents ou l’inhibition de
son activité à l’aide du rottlerin empêche la LML lors de l’apoptose induite par la CPT. La
translocation de PKC-d aux lysosomes conduit à la phosphorylation et l’activation de la
sphingomyelinase acide lysosomale (ASM), et à l’accroissement subséquent du contenu en
céramide (CER) à la membrane lysosomale. Cette accumulation de CER endogène aux
lysosomes est un évènement critique pour la LML induite par la CPT car l’inhibition de
l’activité de PKC-d ou de ASM diminue la formation de CER et la LML.Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme par lequel la PKC-d active
l’ASM qui conduit à son tour à l’accumulation de CER à la membrane lysosomale et
déclenche la LML et l’activation de la voie lysosomale de l’apoptose induite par la CPT. En somme, ce mécanisme confirme l’importance du métabolisme des sphingolipides dans
l’activation de la voie lysosomale de l’apoptose. / Apoptosis is a distinct form of regulated cell death which is essential for the
development and homeostasis maintenance of multicellular animals. Apoptosis is an
evolutionary conserved process involving a specific molecular pathway, known as the
caspase cascade, and the different cytoplasmic organelles. A lysosomal pathway,
characterized by partial rupture, labilization of lysosomal membranes (LML), and cathepsin
activation in the cytoplasm, is evoked during camptothecin-induced apoptosis in human
cancer cells, including human histiocytic lymphoma U-937 cells. These lysosomal events
begin rapidly and simultaneously with mitochondrial permeabilization and caspase
activation within 3 h after drug treatment.
Comparative and quantitative proteome analyses were performed to identify early
changes in lysosomal protein expression/localization from U-937 cells undergoing
apoptosis. In two independent experiments, among a total of more than 538 proteins
putatively identified and quantitated by iTRAQ isobaric labelling and LC-ESI-MS/MS, 18
proteins were found to be upregulated and 9 downregulated in lysosomes purified from
early apoptotic compared to control cells. Protein expression was validated by Western
blotting on enriched lysosome fractions, and protein localization confirmed by fluorescence
confocal microscopy of representative protein candidates, whose functions are associated
with lysosomal membrane fluidity and dynamics. These include sterol-4-alpha-carboxylate
3-dehydrogenase (NSDHL), prosaposin (PSAP) and protein kinase C delta (PKC-d).
Functional experiments demonstrate that PKC-d translocation to lysosomes is required for
LML, as silencing its expression with RNA interference or suppressing its activity with the
inhibitor rottlerin prevents CPT-induced LLM. PKC-d translocation to lysosomes is
associated with lysosomal acidic sphingomyelinase (ASM) phosphorylation and activation,
which in turn leads to an increase of ceramide (CER) content at lysosomes. The
accumulation of endogenous CER at lysosomes is a critical event for CPT-induced LLM as
suppressing PKC-d or ASM activity reduces both CPT-mediated CER generation at
lysosomes and CPT-induced LLM.These findings reveal a novel mechanism by which PKC-d mediates ASM
phosphorylation/activation and CER accumulation at lysosomes in CPT-induced LLM,
rapidly activating the lysosomal pathway of apoptosis after CPT treatment. Taken together,
these results confirm the importance of sphingolipid metabolism in the activation of the
lysosomal pathway of apoptosis.
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Etude de l'acylation sélective de composés multifonctionnels par voie enzymatique : Application à la synthèse de pseudo-céramidesLe Joubioux, Florian 20 April 2012 (has links) (PDF)
Les céramides sont des lipides de la classe des sphingolipides issus de la N-acylation d'une base sphingoide par un acide gras. Ces lipides et leurs analogues suscitent un grand intérêt comme composants actifs dans les industries pharmaceutique et cosmétique. Parmi les biocatalyseurs capables de réaliser la synthèse de ce type de lipide, la lipase B de Candida antarctica semble être l'enzyme la plus adaptée à la production de " pseudo-céramides " à partir d'amino-polyols. Dans ce contexte, nous avons abordé l'étude de l'acylation de composés de type " amino-alcool "catalysée par la lipase B de Candida antarctica, en gardant à l'esprit une approche fondamentale afin d'élargir les connaissances actuelles sur ce sujet. La première partie de notre travail a ainsi traité de l'étude cinétique de l'acylation de composés monofonctionnels afin de déterminer les mécanismes réactionnels et l'énantio sélectivité de la lipase B de Candida antarctica pour les réactions de N-acylation et de O-acylation. Les parties suivantes de notre travail ont porté sur une étude structure-réactivité du substrat accepteur d'acyle et sur l'étude de l'influence du solvant utilisé (solvant organique ou liquide ionique) afin de déterminer les facteurs clés influençant la chimio sélectivité et la régio sélectivité de la lipase B de Candida antarctica lors de l'acylation de composés multifonctionnels de type " amino-alcool ". Finalement, à partir des connaissances acquises dans les différentes parties, nous avons développé et optimisé un procédé de synthèse enzymatique de " pseudo-céramides " (O,N-diacyl aminopropanediols) mis en oeuvre en réacteur continu à " lit fixe ".
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Mécanismes d'activation de la voie lysosomale durant l'apoptose chimio-induiteParent, Nicolas 08 1900 (has links)
L’apoptose est une forme de mort cellulaire essentielle au développement et au
maintien de l’homéostase chez les animaux multicellulaires. La machinerie apoptotiq ue
requiert la participation des caspases, des protéases conservées dans l’évolution et celle des
organelles cytoplasmiques. Les lysosomes subissent des ruptures partielles, labilisation de
la membrane lysosomale (LML), qui entraînent l’activation des cathepsines dans le
cytoplasme de cellules cancéreuses humaines en apoptose induite par la camptothecin
(CPT), incluant les histiocytes humains U-937. Ces modifications lysosomales se
manifestent tôt durant l’activation de l’apoptose, concomitamment avec la perméabilisation
de la mitochondrie et l’activation des caspases.
Une étude protéomique quantitative et comparative a permis d’identifier des
changements précoces dans l’expression/localisation de protéines lysosomales de cellules
U-937 en apoptose. Lors de deux expériences indépendantes, sur plus de 538 protéines
lysosomales identifiées et quantifiées grâce au marquage isobarique iTRAQ et LC-ESIMS/
MS, 18 protéines augmentent et 9 diminuent dans les lysosomes purifiés de cellules en
cours d’apoptose comparativement aux cellules contrôles. Les candidats validés par
immuno-buvardage et microscopie confocale incluent le stérol-4-alpha-carboxylate 3-
déhydrogénase, le prosaposin et la protéine kinase C delta (PKC-d). Des expériences
fonctionnelles ont démontrées que la translocation de PKC-d aux lysosomes est requise
pour la LML puisque la réduction de son expression par ARN interférents ou l’inhibition de
son activité à l’aide du rottlerin empêche la LML lors de l’apoptose induite par la CPT. La
translocation de PKC-d aux lysosomes conduit à la phosphorylation et l’activation de la
sphingomyelinase acide lysosomale (ASM), et à l’accroissement subséquent du contenu en
céramide (CER) à la membrane lysosomale. Cette accumulation de CER endogène aux
lysosomes est un évènement critique pour la LML induite par la CPT car l’inhibition de
l’activité de PKC-d ou de ASM diminue la formation de CER et la LML.Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme par lequel la PKC-d active
l’ASM qui conduit à son tour à l’accumulation de CER à la membrane lysosomale et
déclenche la LML et l’activation de la voie lysosomale de l’apoptose induite par la CPT. En somme, ce mécanisme confirme l’importance du métabolisme des sphingolipides dans
l’activation de la voie lysosomale de l’apoptose. / Apoptosis is a distinct form of regulated cell death which is essential for the
development and homeostasis maintenance of multicellular animals. Apoptosis is an
evolutionary conserved process involving a specific molecular pathway, known as the
caspase cascade, and the different cytoplasmic organelles. A lysosomal pathway,
characterized by partial rupture, labilization of lysosomal membranes (LML), and cathepsin
activation in the cytoplasm, is evoked during camptothecin-induced apoptosis in human
cancer cells, including human histiocytic lymphoma U-937 cells. These lysosomal events
begin rapidly and simultaneously with mitochondrial permeabilization and caspase
activation within 3 h after drug treatment.
Comparative and quantitative proteome analyses were performed to identify early
changes in lysosomal protein expression/localization from U-937 cells undergoing
apoptosis. In two independent experiments, among a total of more than 538 proteins
putatively identified and quantitated by iTRAQ isobaric labelling and LC-ESI-MS/MS, 18
proteins were found to be upregulated and 9 downregulated in lysosomes purified from
early apoptotic compared to control cells. Protein expression was validated by Western
blotting on enriched lysosome fractions, and protein localization confirmed by fluorescence
confocal microscopy of representative protein candidates, whose functions are associated
with lysosomal membrane fluidity and dynamics. These include sterol-4-alpha-carboxylate
3-dehydrogenase (NSDHL), prosaposin (PSAP) and protein kinase C delta (PKC-d).
Functional experiments demonstrate that PKC-d translocation to lysosomes is required for
LML, as silencing its expression with RNA interference or suppressing its activity with the
inhibitor rottlerin prevents CPT-induced LLM. PKC-d translocation to lysosomes is
associated with lysosomal acidic sphingomyelinase (ASM) phosphorylation and activation,
which in turn leads to an increase of ceramide (CER) content at lysosomes. The
accumulation of endogenous CER at lysosomes is a critical event for CPT-induced LLM as
suppressing PKC-d or ASM activity reduces both CPT-mediated CER generation at
lysosomes and CPT-induced LLM.These findings reveal a novel mechanism by which PKC-d mediates ASM
phosphorylation/activation and CER accumulation at lysosomes in CPT-induced LLM,
rapidly activating the lysosomal pathway of apoptosis after CPT treatment. Taken together,
these results confirm the importance of sphingolipid metabolism in the activation of the
lysosomal pathway of apoptosis.
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