Le Loup ou Bar Dicentrarchus labrax est une espèce euryhaline dont les femelles pondent généralement en eau de mer. Pendant son cycle de vie, des migrations vers les estuaires et les lagunes, peuvent exposer très tôt les jeunes stades à des variations de salinité. Les mécanismes de l'osmorégulation sont bien connus chez les prélarves, les larves et les adultes de D. labrax en eau de mer (EM, 38) et en eau de mer diluée (EMD, 5), cependant les possibilités d'osmorégulation et leurs mécanismes sont inconnus chez les embryons. Le but de cette étude a été d'évaluer la mise en place de la fonction osmorégulatrice chez les embryons de D. labrax.Tout d'abord le développement embryonnaire des différents sites osmorégulateurs a été décrit, en se focalisant sur le tube digestif, en incluant le pharynx et les premières fentes branchiales. La formation de ces structures débute au stade 12 somites (S) et a été décrite jusqu'à l'ouverture de la bouche, 5 jours après l'éclosion.En second lieu, le lieu et la cinétique d'apparition des premières cellules osmorégulatrices, les « ionocytes » ont été recherchés. Ces cellules ont été identifiées au stade 12S sur la membrane de la vésicule vitelline et au niveau des premières fentes branchiales et du tube digestif primitif au stade 14S. La fonctionnalité de ces cellules a été étudiée grâce à des immunomarquages des principales protéines transmembranaires impliqués dans l'osmorégulation [l'ATPase Na+/K+ (NKA), le cotransporteur Na+/K+/2Cl- (NKCC) et le canal à chlore (CFTR)], et avec une étude ultrastructurale. Des ionocytes potentiellement fonctionnels sont présents à partir du stade 25S au niveau de la membrane de la vésicule vitelline et du tube digestif primitif, mais les ionocytes des premières fentes branchiales ne sont pas totalement fonctionnels à l'éclosion. L'existence d'un phénomène de boisson passive qui permettrait la régulation hydrique chez D. labrax est envisagé.Finalement, l'osmorégulation embryonnaire existant en EM et en EMD a été étudiée. Des mesures nanoosmométriques des fluides embryonnaires indiquent une capacité à hyper- et hypo-osmoréguler. Cependant, en EMD, des analyses en qRT-PCR et des immunomarquages de NKA, NKCC et CFTR révèlent que les mécanismes de l'hyper-osmorégulation peuvent limiter les pertes ioniques mais ne sont pas suffisamment efficaces pour permettre une acclimatation totale à l'EMD à ce stade très précoce. / The European sea bass Dicentrarchus labrax is a euryhaline species which usually spawns in seawater. Due to its life cycle that includes migrations to lagoon and estuaries, young stages can be exposed early to salinity variations. Osmoregulatory patterns are well known in prelarvae, larvae and adults D. labrax in seawater (SW, 38) and in dilute seawater (DSW, 5), but the possibility and mechanisms of embryonic osmoregulation are still unknown. The goal of this study was to investigate the occurence of the omoregulatory function in the embryos of D. Labrax.First, the embryonic development of the different osmoregulatory sites was described, focusing on the digestive system including the pharynx and the first gill slits. The formation of these structures is initialized at stage 12 somites (S) and was described throughout the opening of the mouth five days after hatching.Secondarily, the time and the location of the occurrence of the first osmoregulatory cells, the ionocytes were followed. These cells were identified at stage 12S on the yolk sac membrane and at stage 14S in the first gill slits and in the posterior primitive gut. The functionality of these cells was studied, using immunostaining of the main ionic transporters involved in osmoregulation [the Na+/K+ ATPase (NKA), the Na+/K+/2Cl- cotransporter (NKCC) and the chloride channel (CFTR)], and through ultrastructural investigations. Potentially functional ionocytes are present from stage 25S in the yolk sac membrane and in the gut, but gill slits ionocytes are not fully functional at hatching. Passive drinking is suspected to regulate water balance in D. labrax.Finally, the embryonic osmoregulation in SW and DSW was investigated. Nanoosmometry measurements of the embryonic fluids demonstrated some capabilities of hyper- and hypo-osmoregulation. However, in DSW, qRT-PCR and imunostaining of NKA, NKCC and CFTR, reveal that hyper-osmoregulatory mechanisms can only limit ion loss but are not efficient enough to allow a full acclimation at this early life stage.

Le loup Dicentrarchus labrax est un téléostéen euryhalin qui effectue des migrations saisonnières de la mer vers les lagunes et les estuaires où la salinité est très variable et peut changer rapidement. Les mécanismes d'osmorégulation sont bien connus chez les téléostéens, alors que le rôle de l'osmodétection dans leur mise en place reste actuellement largement méconnu. Le but de cette étude a été d'améliorer les connaissances sur l'osmodétection et sur la mise en place des mécanismes d'hyper-osmorégulation (à court et long terme).Tout d'abord, le canal calcique “Transient Receptor Potential Vanilloid 4” ou TRPV4, candidat osmodétecteur, a été étudié chez des loups adaptés à l'eau de mer (EM) ou exposés à l'eau douce (ED) durant des temps différents. Au niveau branchial, le TRPV4 ne semble pas impliqué dans l'osmodétection au niveau des ionocytes, mais plutôt dans l'absorption de Ca2+ par les chondrocytes, notamment en ED. Il pourrait avoir un rôle dans l'osmodétection systémique au niveau de l'hypophyse et dans l'absorption de Ca2+ dans le rein. Sa forte expression en EM dans les cellules rénales réabsorbant de l'eau suggère que le TRPV4 est impliqué dans la régulation de leur volume cellulaire.En second lieu, le canal à chlore ClC-3, candidat osmodétecteur et potentiellement impliqué dans les mécanismes de diminution régulatrice du volume cellulaire (RVD), a été étudié dans les mêmes conditions expérimentales que précédemment. Ce canal a été localisé dans la membrane basolatérale des ionocytes des branchies (EM et ED) et des tubes collecteurs du rein (en ED ; pas immunodétecté en EM). Il pourrait jouer un rôle dans la protection des cellules contre un choc hypotonique, et donc dans la RVD en EM dans ces deux organes. En ED, la localisation du ClC-3 suggère fortement sa participation dans l'hyper-osmorégulation au niveau des branchies et du rein.Enfin, un protocole d'isolement des ionocytes branchiaux a été mis au point ; il permettra de poursuivre et d'approfondir les travaux sur l'osmodétection cellulaire. L'évolution au cours du temps du volume cellulaire d'un ionocyte a pu être évaluée après un choc hypotonique. De futures expérimentations permettront d'évaluer le lien entre l'osmodétection, les osmodétecteurs et les effecteurs osmotiques. / The European sea bass Dicentrarchus labrax is a euryhaline teleost that migrates seasonally from the sea to lagoons and estuaries, where salinity is very variable and changes rapidly. Osmoregulatory mechanisms are well known in teleosts, while the role of osmosensing in their set-up is yet poorly understood. The objective of this study was to improve the understanding of osmosensing and of its relations with hyper-osmoregulatory mechanisms in sea bass over short- and long-term salinity exposures.First, the Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) Ca2+-channel, a potential osmosensor, has been studied in fish adapted to sea water (SW) or exposed to fresh water (FW) for various times. The TRPV4 did not seem to be involved in osmosensing in mitochondrion-rich cells (MRC) in gills. It may be involved in systemic osmosensing and in Ca2+ uptake by branchial chondrocytes and by renal collecting ducts in FW. This channel may also have a role in cell volume regulation of kidney cells allowing water reabsorption.Secondly, the ClC-3 chloride channel, another potential osmosensor and potentially involved in regulatory volume decrease (RVD) mechanisms, has been studied in fish under similar conditions. This channel has been localized in the basolateral membrane of ionocytes in gills (SW and FW) and kidney (FW – in SW, expressed but not immunodetected). It might be involved in cell protection against hypotonic shock and thus in RVD in both organs in SW. In FW, its localization strongly suggests a role in hyper-osmoregulation in gills and kidney.Finally, a protocol to isolate MRCs has been developed; it has been used to study cell osmosensing and it will be used on future studies. The changes in cell volume following a hypotonic shock have been evaluated. Future experiments will allow a better understanding of the relations between cell osmosensing, osmosensors and effectors.

Les mangroves sont de plus en plus mentionnées comme outil de bioremédiation potentiel dans le traitement des eaux usées (EU). Actuellement, les effets des rejets d’EU sur la macrofaune, et plus particulièrement sur les crabes de mangrove, ne sont pas clairs. Ces espèces sont dites ingénieurs de cet écosystème, notamment grâce à leur activité de bioturbation qui permet, entre autres, l’infiltration des EU dans le sédiment via leurs terriers. L’objectif ont donc été d’étudier l’impact du rejet d’EU domestiques sur la physiologie (osmorégulation, métabolisme et balance oxydative) de 3 espèces de crabe (2 Sesarmidae et 1 Ocypodidae) par une approche combinant expérimentations en laboratoire et sur le terrain en utilisant un site pilote expérimental sur l’île de Mayotte. Ces crabes qui vivent dans la zone intertidale ont un mode de vie bimodal et font fréquemment face à des salinités variables. Ils sont de bons hyper-hypo-osmorégulateurs et sont adaptés à cette vie à l’interface entre terre et eau aussi bien au niveau de la régulation ionique que de la respiration. Les résultats indiquent que la densité des terriers diminue dans les zones d’écoulement des EU et que la communauté des espèces est modifiée avec la dominance de Parasesarma guttatum (PG) qui n’est pas une espèce bioturbatrice. Les EU induisent donc une modification potentielle du fonctionnement de l’écosystème. PG diminue son métabolisme alors que les deux autres espèces étudiées l’augmentent significativement. Immergées dans les EU, les trois espèces étudiées présentent des atteintes de la fonction osmorégulatrice (activité de la Na+/K+-ATPase et épaisseur d’épithélium branchiale) et de la balance oxydative (formation d’espèces réactives de l’oxygène dans l’hémolymphe et enzymes antioxydantes des branchies) en laboratoire mais des effets moins marqués sont observés chez les crabes maintenus in situ dans des terriers artificiels. Les biomarqueurs étudiés peuvent ainsi être utilisés pour mesurer l’état physiologique des crabes soumis à des rejets d’EU domestiques. Ces atteintes qui entraînent des coûts métaboliques supplémentaires peuvent mener à la réduction de leur fitness, contribuant à expliquer les observations écologiques. De plus, les résultats montrent que les crabes violonistes sont les plus sensibles, suivis des deux Sesarmidae alors que PG semble mieux adapté pour éviter les EU. Si aucun dysfonctionnement majeur n’a été observé à l’échelle de l’écosystème jusqu’à présent, il convient de maintenir un suivi régulier de ces espèces, en tenant compte de leur spécificité en termes d’activité bioturbatrice et de santé physiologique. / Mangroves are increasingly proposed as a bioremediation tool for wastewater (WW) treatment. However, this practice can impact mangrove crabs which are key engineer species of the ecosystem through their bioturbation activities. Their burrows are directly involved in the bioremediation process allowing WW infiltration in the sediment. This study aimed to determine the effects of WW on the physiology (osmoregulation, bioenergetics, oxidative balance) of 3 species of crabs (2 Sesarmidae and 1 Ocypodidae) with laboratory and in situ experiments (burrow density and caging experiment in an experimental area with controlled WW releases on a mangrove located on the island of Mayotte). These crabs inhabit the intertidal area of variable salinity with a bimodal life (aquatic and terrestrial). They are good hyper-hypo-osmoregulators and well adapted to terrestrial life both in terms of osmotic and aerial breathing capacities. Burrow density decreases in flat areas where WW flows and crab community is altered with a marked dominance of Parasesarma guttatum (PG) (a species with no bioturbation activity). This change may induce drastic alterations of the ecosystem functioning. The bioenergetic response of PG is totally different from the other studied species. PG decreases its metabolic rate in WW but the other species have increased metabolic activity. Moreover, after laboratory exposure the 3 species show impairments in their osmoregulatory capacity (Na+/K+-ATPase activity and epithelium gill thickness) and oxidative balance (reactive oxygen species formation in haemolymph and antioxidant enzyme activity in gills) due to WW exposure in laboratory conditions. In situ, encaged crabs showed a similar but reduced pattern. These effects could decrease their fitness and may also explain the observed ecological changes. The biomarkers used in this study may be a useful tool to monitor crab populations. Moreover, our results show that fiddler crabs are the most sensitive to WW followed by other Sesarmidae. PG seems better adapted to avoid WW exposure. Even if no major dysfunction is observed at the ecosystem level yet, WW release should be carefully monitored nevertheless with an emphasis on crab bioturbation activity and their physiological health according to species sensitivity.

Parmi les différentes fonctions du système hypothalamo-neurohypophysaire, il est notamment mis en jeu dans les voies de contrôle de l'osmolalité plasmatique et il est en particulier stimulé lors d'une déshydratation de l'organisme. Ce système reçoit des afférences provenant de la périphérie, telles que celles issues du sinus carotidien, mais aussi des informations intrinsèques au système nerveux central (SNC) en provenance de certains organes circumventriculaires. Le système de contrôle de l'osmorégulation passe par ces structures et des informations telles que l'osmolalité plasmatique peuvent être rapidement intégrées pour adapter le niveau de libération de l'arginine-vasopressine (AVP), hormone anti-diurétique qui contrôle la réabsorption de l'eau au niveau du néphron. Le noyau supraoptique (NSO), où siègent les neurones magnocellulaires synthétisant l'AVP, reçoit donc de nombreuses afférences qui modulent son activité, telles que des afférences impliquant la noradrénaline (NA), majoritaires, ainsi que des afférences aminoacidergiques qui libèrent le glutamate, l'aspartate et le GABA. Notre équipe s'intéresse aux mécanismes de régulation de l'expression et de libération d'AVP par les afférences noradrénergiques. L'effet de la noradrénaline passe par une voie nitrergique (NO) pour le contrôle de l'expression de l'AVP (Grange-Messent et al, 2004). Par ailleurs, les travaux de S. Mélik-Parsadaniantz et de son équipe ont démontré que l'expression des chimiokines, notamment la chimiokine SDF1 ainsi que son récepteur CXCR4, augmentait au cours de la déshydratation (Callewaere et al., 2006). La démonstration de la présence de chimiokines dans les neurones magnocellulaires et de leur implication au cours de la déshydratation ainsi que les résultats que nous avons obtenus sur le NO suggèrent que les médiateurs inflammatoires sont des molécules de signalisation endogènes qui participent à la chaîne de signalisation mise en jeu lors de l'osmorégulation. L'objectif de la thèse est de s'intéresser au métabolisme oxydatif dans les noyaux magnocellulaires puisque, dans les processus de plasticité post-lésionnels, les modifications de l'expression des médiateurs inflammatoires sont accompagnées de modifications de ce métabolisme et de la production de radicaux libres qualifiés d'espèces réactives de l'oxygène (EROs). Notre modèle d'étude est la souris C3H/HeJ adulte soumise à une hyperosmolarité plasmatique. Ce paradigme est connu pour stimuler l'axe osmorégulateur et pour causer une augmentation de l'AVP sans provoquer de stress. Dans le cas d'une stimulation hyperosmolaire chronique, les résultats obtenus montrent que lors de l'activation de l'axe osmorégulateur, démontrée par l'expression de la protéine c-fos, la synthèse d'AVP est accompagnée d'une production d'EROs, prise en charge par la superoxyde dismutase de type 2 (SOD 2) et la catalase. Les mesures de l'osmolalité plasmatique montrent que la réponse osmorégulatrice exercée par l'AVP se met en place progressivement et qu'après 8 jours de stimulation osmotique, le système retourne au niveau contrôle montrant un nouvel équilibre allostatique. Dans le cas d'une stimulation hyperosmolaire aiguë, les EROs sont produits dès la phase précoce de l'hyperosmolarité démontrée par l'expression de c-fos, et sont pris en charge par la SOD 2 et la catalase. De plus, cette production d'EROs est indispensable à l'augmentation de synthèse d'AVP en réponse à une hyperosmolarité plasmatique, puisqu'en présence d'un antioxydant, l'acide -lipoïque (AAL) administré avant la stimulation osmotique, il y a une inhibition de la synthèse de novo d'AVP. La deuxième partie de ma thèse cherche à déterminer la place des EROs dans le contrôle exercé par les afférences noradrénergiques via le monoxyde d'azote (NO). Les résultats obtenus montrent que les souris transgéniques Tg8, qui présentent des taux élevés en NA dans le SNC, ont des niveaux de production d'EROs dans le NSO plus élevés que leurs contrôles non transgéniques, les souris C3H/HeJ, donnant une indication que la voie noradrénergique est impliquée in vivo. Afin de confirmer la place des EROs dans la voie de signalisation noradrénergique, nous avons analysé ex vivo l'effet de la NA sur des tranches d'hypothalamus maintenues en survie. Ceci nous a permis également de préciser plus avant les contributions respectives du NO et des EROs dans la voie de régulation noradrénergique de l'expression de l'AVP. Ces résultats démontrent pour la première fois l'importance des EROs comme signaux endogènes dans la voie de régulation osmotique. Il permet de faire émerger un rôle nouveau et original des EROs en tant que médiateurs physiologiques des voies de signalisation intracellulaires.

Afin de repeupler la mer Caspienne, la propagation artificielle de l’esturgeon Acipenser persicus est maintenant une pratique courante avec rejets annuels de juvéniles directement en mer. Cependant, une forte mortalité est régulièrement observée suite à la libération directe en mer de juvéniles pesant 2-3 g. L'objectif a donc été d'analyser les capacités d’acclimatation de juvéniles de l’eau douce à l’eau saumâtre et d'identifier un moyen possible d’améliorer les taux de survie d’esturgeons de moins de 3 g.Dans une première partie, l'effet de transferts abruptes ou progressifs sur 5 jours de l'eau douce (ED) à une salinité de 11‰ (salinité de la mer Caspienne, CSW) a été étudié chez des juvéniles de 1 à 2 g, 2 à 3 g et de 3 à 5 g. Ont été mesurés les taux de mortalité, l'osmolalité plasmatique, l’expression et la localisation (branchies, reins, valvule spiralée, caecum pylorique) des principales protéines de transport : la Na+, K+-ATPase (NKA), la H+-ATPase vacuolaire (VHA), le Na+, K+, 2Cl- (NKCC) et la ‘Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator’ (CFTR). Une étude des changements d'expression génique et protéique de la NKA au niveau des branchies a également été effectuée. Enfin, une étude ultrastructurale (TEM et SEM) des cellules à chlorure branchiales a été effectuée.Dans une deuxième partie, un traitement hormonal avec le cortisol a été effectué afin d’améliorer la capacité d'acclimatation. Des juvéniles de moins de 2g ont été traités pendant 24h en ED avec des bains de cortisol à 3 concentrations différentes : 3, 5 et 7 mg.l-1. Les poissons ont été ensuite directement transférés de l'eau douce à la CSW et échantillonnés après 1, 4 et 9 jours après transfert en CSW. Les taux de mortalité, l'osmolalité plasmatique, le nombre et l’aire des cellules à chlorure des branchies ont été évalués.Ainsi, les poissons de plus de 3 g sont capables de survivre et s’acclimatent à la CSW. Malgré une augmentation initiale de l'osmolalité plasmatique après transfert de salinité, les juvéniles réduisent ensuite leur osmolalité plasmatique jusqu'à la pression osmotique de la mer Caspienne. Cependant, beaucoup de poissons de moins de 3 g ne peuvent survivre à l’augmentation brutale de salinité et la pression osmotique du sang des poissons survivants reste élevée. L’expression de la NKA et du NKCC, la taille et le nombre des cellules à chlorure des branchies sont également plus élevés. Les juvéniles pesants plus de 2 g augmentent aussi fortement leur activité de NKA branchiale après transfert de salinité. L'étude ultrastucturale a révélé des surfaces apicales similaires pour les cellules à chlorure branchiales des poissons en ED et acclimatés à la CSW. Le cytoplasme de ces cellules dans les poissons pesant plus de 2 g apparait plus dense et gonflé par rapport aux poissons pesant moins de 2 g. Cela pourrait être dû à l'allongement des replis de la membrane basale (réseau tubulo-vésiculaire) et/ou à une densité plus élevée des mitochondries. L’expression branchiale du gène NKA des poissons acclimatés à la CSW est apparue d'abord sur- puis sous-exprimée 4 jours après le transfert de salinité pour atteindre le niveau des poissons en ED. Au niveau intestinal et des reins, aucune différence n'a pu être détectée entre les différents groupes de poids suite au transfert de salinité. Malgré une osmolarité plasmatique réduite, le nombre et la taille des cellules à chlorure des poissons traités avec le cortisol montrent 9 jours après transfert, les mêmes tendances que celles observées pour les poissons non traités.Ainsi, cette étude a révélé que seuls les esturgeons juvéniles de plus de 3 g peuvent être directement rejetés en mer Caspienne. Pour les poissons de 2-3 g, un protocole spécial pendant le transfert de salinité doit être considéré alors que les poissons pesant moins de 2 g ne peuvent tolérer une augmentation de salinité même après un traitement au cortisol. / For restocking purposes, artificial propagation of Persian sturgeon (Acipenser persicus) and annual releases into the Caspian Sea are now common practice. However, high mortality is regularly observed following the direct release of 2-3 g juveniles into the Caspian Sea. Therefore, the aim of the study was to analyse the acclamatory capacities of juvenile Persian sturgeons to elevated salinity and to identify a possible way to improve survival rates of juveniles weighting less than 3 grams.In the first part of this study, the effect of abrupt and 5-day gradual salinity transfers from freshwater (FW) to 11‰ Caspian Sea water (CSW) were investigated in juvenile Persian sturgeons with three different weight groups: 1-2 g (1.62 ± 0.27 g), 2-3 g (2.55 ± 0.41 g) and 3-5 g (4.28 ± 0.76 g). Daily mortality rates, plasma osmolality, immunofluorescence localization of the main ion transporter proteins such as Na+, K+-ATPase (NKA), Vacuolar H+-ATPase (VHA), Na+,K+,2Cl–(NKCC) and Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) at the gill, kidney, pyloric caecum and intestinal spiral valve levels, ultrastructural studies (TEM and SEM) of the gills for chloride cell changes and changes of branchial NKA gene and protein expression were measured 4 and 10 days after abrupt transfer to CSW and 9 and 15 days after the initial gradual transfer (i.e. 4 and 10 days after reaching CSW), respectively.In the second part of study, hormonal treatment with cortisol was used to enhance the acclimation capability of fish weighing less than 2g. Fish were treated with a cortisol bathing method using three different concentrations; 3, 5 and 7 mg.l-1 for 24 hours in FW. Fish were then directly transferred from FW to CSW (11‰) and sampled after 1, 4 and 9 days post-transfer to CSW. Daily mortality rate, plasma osmolality and branchial chloride cell number and area were evaluated.The obtained results showed that fish weighing more than 3g are able to survive and could successfully acclimate to CSW. Despite initial plasma osmolality increase after salinity transfer, juveniles could reduce their plasma osmolality down to the CSW osmotic pressure after 15 days of acclimation in CSW. However, fish under 3 g could not survive abrupt salinity increase, and blood osmotic pressure of the remaining surviving fish increased and remained elevated during the whole experimental period. At the gill level, higher chloride cell size and number, with also higher NKA and NKCC content were observed allowing juveniles weighing more than 2 g to sharply increase their NKA activity after salinity transfer. The electron microscopic study revealed similar apical surfaces for branchial chloride cells in FW and CSW-acclimated fish. It also indicated that the cytoplasm of these cells in fish weighing more than 2 g were denser and inflated compared to fish weighing less than 2 g. This could be due to the elongation of the basal membrane infoldings (tubulo-vesicular network) and/or a higher density of mitochondria. Because sequences of NKA and NKCC1 genes were not reported for sturgeon fish, two partial sequences of NKA (632 bp) and NKCC1 (538 bp) were obtained from this present study and were registered in Genbank. Branchial NKA gene of CSW-acclimated fish was firstly upregulated and then downregulated to the level for FW fish after 4 days following salinity transfer. At the kidney and intestinal level, no difference could be detected between the different weight groups during salinity transfer. Despite lower plasma osmolality, number and size of the chloride cells in treated fish with cortisol show the same trends as the untreated control fish after 9-days post transfer. Consequently, this study revealed that only Persian sturgeon juveniles weighing more than 3 g can directly be released into the Caspian Sea. Fish weighting 2-3 g need special care during salinity transfer and fish weighing less than 2 g cannot tolerate Caspian Sea salinity even after cortisol treatment.

Les probiotiques sont des microorganismes vivants qui, ingérés en quantité suffisante, exercent des effets positifs sur la santé. La lyophilisation est aujourd’hui questionnée quant à sa consommation d’énergie et son caractère discontinu. S’il offre une alternative pour produire massivement des poudres probiotiques à faible coût, le séchage par atomisation induit quant à lui des stress thermiques et oxydatifs conduisant à des pertes de viabilité rédhibitoires.Dans ce travail, un procédé innovant de séchage par atomisation est proposé. Du lactosérum doux concentré (jusqu’à 30% p/p) est utilisé à la fois comme support de culture et de séchage de P. freudenreichii et L. casei. Ce procédé élimine les étapes intermédiaires à risque de contamination élevé, accroît la biomasse et améliore la viabilité des bactériesLes mécanismes sous-jacents ont été explorés au plan de la résistance bactérienne et des conditions de séchage. Le milieu concentré induit une osmoadaptation des bactéries par expression de protéines de stress et accumulation de solutés compatibles, conduisant à une tolérance accrue des probiotiques à différents stress. La présence d’agrégats et la concentration en Mg2+ du milieu concentré pourraient également être impliquées.Le scale-up du procédé a été étudié : un schéma technologique semi-industriel impliquant séchage par atomisation, sur bande et en lit fluidisé a permis d’atteindre une viabilité de 100% (> 109 CFU g-1). Par ailleurs, la fonctionnalité des poudres probiotiques a été évaluée in vitro and in vivo sur modèle porcelet. Ce travail ouvre de nouvell / Probiotics are live microorganisms that, when administered in adequate amounts, confer a health benefit on the host. Freeze drying, the reference drying method, is currently challenged because of its low energy-efficiency and productivity. Therefore, spray drying is expected to be an alternative and sustainable method for producing probiotic powders. The issue remains in the considerable inactivation of probiotics caused by high temperature and dehydration during the process. In this work, a novel spray-drying process for continuous production of probiotics was challenged. Concentrated sweet whey (up to 30% w/w dry matter) was used to both culture and spray dry P. freudenreichii ITG P20 and L. casei BL23. This process cut down the steps between culturing and drying (e.g. harvesting, washing), increases the cell population after growth and improves spray drying productivity and probiotic viability. The mechanisms were explored from bacterial physiology and drying process conditions. The hypertonic stress led to overexpression of key stress proteins and accumulation of intracellular compatible solutes, which enhanced multistress tolerance. The presence of protein aggregates and optimal concentration of Mg2+ in matrix may also be involved.The feasibility of scaling up this process was validated. A multi-stage semi industrial drying process, coupling spray-drying with belt drying and fluid-bed drying, was applied to further improve the probiotic viability to 100% (> 109 CFU g-1). Moreover, the functionality of these probiotic powders was investigated in vitro and in viv

Les crevettes Palaemonidae sont issues d'un clade ancestral marin, qui a montré une tendance évolutive remarquable à s'adapter à des conditions non-marines, envahissant avec succès les milieux estuariens et limniques. Adulte, Macrobrachium amazonicum (A) est une espèce d'eau douce (ED) avec une stratégie d'exportation vers les estuaires des larves qui ont besoin d'eau salée pour se développer. Des populations se sont trouvées au cours du temps isolées en ED ; elles ont récemment été décrites comme une nouvelle espèce, M. pantanalense (P), qui a acquis au cours de son évolution la capacité d'effectuer tout son cycle en ED, grâce à l'acquisition de l'hyper-osmorégulation en ED dès l'éclosion, et en perdant l'hypo-osmorégulation en eau salée. Ces deux espèces représentent un bon modèle pour la reconstruction des transitions évolutives des crevettes de l'eau salée à l'ED. L'objectif de ce travail est de comprendre les différences liées à l'adaptation physiologique et moléculaire à l'ED et donc à l'osmorégulation entre les deux espèces au cours de l'ontogénèse. Pour cela nous avons étudié l'ontogenèse comparative des organes osmorégulateurs, en particulier de la cavité branchiale, et la localisation et expression de différents transporteurs ioniques. Au niveau structural, aux stades larvaires, P a un développement branchial plus précoce que A. La Na+/K+ ATPase (NKA) a été essentiellement immunolocalisée au niveau des branchies chez P et au niveau des branchiostégites chez A aux mêmes stades larvaires. Ceci suggère que la forte capacité d'hypo-osmorégulation durant l'ontogenèse de A est liée aux transports ioniques dans les branchiostegites, alors que les lamelles branchiales ne sont pas complètement développées. Sur le plan ultrastructural, les lamelles branchiales des deux espèces comportent deux types de cellules associées, les cellules septales et les cellules piliers qui toutes deux présentent des caractéristiques d'ionocytes. Une différentiation ultrastructurale a été observée au niveau des cellules piliers et de l'épithélium interne des branchiostégites suite à une acclimatation en ED. Ces cellules présentent des microvillosités apicales, profondes et nombreuses, ce qui semble être une adaptation aux faibles salinités permettant une absorption efficace d'ions. Les transporteurs ioniques impliqués dans l'osmorégulation ont été étudiés. La V-H+ ATPase (VHA) a été détectée au niveau des cellules piliers et de l'épithélium interne des branchiostégites. La NKA et l'échangeur Na+/H+ (NHE-3) ont été localisés au niveau des cellules septales. Des différences d'expressions géniques de la VHA, du NHE-3 et de la NKA ont été mesurées en comparant les 2 espèces à certains stades de développement. La distribution différentielle de ces transporteurs entre les cellules piliers et septales suggère que ces deux cellules pourraient fonctionner comme un complexe cellulaire pour absorber ou sécréter des ions. Chez P, la capacité de tous les stades à hyper-réguler en ED peut provenir du développement précoce des branchies fonctionnelles, et la perte de l'hypo-régulation peut être liée au manque de transports ioniques au niveau des branchiostégites. Enfin, les glandes excrétrices antennaires produisent de l'urine hypotonique chez les juvéniles et adultes des deux espèces en ED, ce qui diminue les pertes ioniques. Ces résultats illustrent des adaptations évolutives (perte et gain de fonctions) qui ont permis l'invasion des habitats d'ED. / Palaemonid shrimps originate from an ancestral marine clade showing a remarkable evolutionary ability to adapt to non-marine conditions, successfully invading estuarine and limnic habitats. Macrobrachium amazonicum (A) is a freshwater (FW) species as an adult with an export strategy toward estuaries of larvae requiring salt water for their development. Over time, some populations ended up isolated in FW; recently, they have been described as a new species, M. pantanalense (P), which during its evolution has become able to complete its entire life cycle in FW, thanks to the acquisition of hyper-osmoregulation in FW from hatching, while loosing hypo-osmoregulation in salt water. The two species offer a valuable model to reconstruct the evolutionary transitions of shrimps from salt water to FW. The objective of this study was to decipher the differences in physiological and molecular adaptations to FW, thus in osmoregulation, between both species during ontogeny. We studied the comparative ontogeny of osmoregulatory organs, particularly the branchial chamber, and the localization and expression of ion transporters. During the larval phase, we found that the gill development starts earlier in P than in A. Na+/K+ ATPase (NKA) was mainly localized in gills of P and in branchiostegites of A at the same larval stages. This suggests that the high capacity to hypo-osmoregulate during the ontogeny of A originates from ionic transports in branchiostegites, while gill lamellae are not fully developed. In both species, the gill lamellae contain two associated cells types, septal and pillar cells, displaying features of ionocytes. After FW acclimation, ultrastructural differences were observed in pillar cells and in the inner epithelium of branchiostegites. These cells possess numerous deep apical microvilli, a possible adaptation to low salinities for efficient ion uptake. Regarding ion transporters involved in osmoregulation, V-H+ ATPase (VHA) was detected in pillar cells and in the inner branchiostegite epithelium. NKA and Na+/H+ exchanger (NHE-3) were localized in septal cells. Differences in VHA, NHE-3 and NKA gene expression were observed by comparing the two species at certain developmental stages. The differential distribution of these transporters between pillar and septal cells suggest that these two cells may function as a cell complex for ion absorption or secretion. In P, the capacity of all stages to hyper-regulate in FW may originate from the early development of functional gills; and the loss of hypo-regulation may originate from an absence of ion transport in branchiostegites. Finally, the excretory antennal glands produce hypotonic urine in juveniles and adults of both species in FW, thus reducing ion loss. These results illustrate evolutionary adaptations (gain and loss of functions) that have permitted the invasion of FW habitats.

Les fonctions physiologiques spécifiques de la voie de N-méthylation de la phosphatidyléthanolamine (PE), une des deux voies de biosynthèse de la phosphatidylcholine (PC), restent relativement énigmatiques. Il a été démontré chez les poissons euryhalins qu’un stress hyperosmotique induisait une activation de cette voie métabolique au niveau hépatique. L’objectif de notre travail était de vérifier si ce phénomène se produit aussi chez d’autres animaux euryhalins. Les études réalisées in vivo sur deux espèces de crâbes, Eriocheir sinensis et Carcinus maenas, nous ont permis de montrer que l’acclimatation en eau de mer de ces animaux active la synthèse de PC par N-méthylation de la PE dans l’hépatopancréas. Les marquages radioisotopiques montrent aussi que cette PC est échangée avec le plasma et que ce phénomène est amplifié chez les animaux en eau de mer. Ce pool de PC est utilisé comme précurseur de la bétaïne, un osmoeffecteur organique important chez ces animaux. Nous avons ensuite caractérisé la voie de N-méthylation de la PE chez un animal osmoconformeur, la moule Mytilus galloprovincialis. Les résultats, obtenus in vivo et in vitro sur les tissus isolés, démontrent qu’une activité de N-méthylation de la PE en PC est exprimée dans la glande digestive et les hémocytes circulant de M. galloprovincialis. La PC ainsi synthétisée dans ces tissus est échangée avec l’hémolymphe de l’animal. De l’ensemble de ces observations, nous pouvons conclure que la synthèse de PC par N-méthylation est largement exprimée chez les animaux marins euryhalins et qu’une des fonctions physiologiques de cette voie métabolique est de synthétisée des osmolytes organiques comme la bétaïne / The specific physiological functions of the N-methylation of phosphatidylethanolamine (PE), one of the two biosynthetic pathways of phosphatidylcholine (PC), remain relatively mysterious. It has been demonstrated in euryhaline fish that hyperosmotic stress induced activation of this pathway in the liver. The aim of our work was to verify whether this phenomenon also occurs in other euryhaline animals. In vivo studies on two species of crabs, Eriocheir sinensis and Carcinus maenas, showed that seawater acclimation activates PC synthesis by N-methylation of PE in the hepatopancreas. Radioisotopic labelling also showed that PC is exchanged with the plasma and that this phenomenon is amplified in animals in seawater. This pool of PC is used as a precursor of betaine, an important organic osmoeffector in these animals. We then characterized the process of PE N-methylation in an osmoconforming animal, the mussel Mytilus galloprovincialis. The results, obtained in vivo and in vitro on isolated tissues, show that N-methylation of PE to PC is expressed in the digestive gland and circulating haemocytes in M. galloprovincialis. The PC synthesized in these tissues is exchanged with hemolymph of the animal. From all these observations, we conclude that the synthesis of PC by N-methylation is widely expressed in marine euryhaline animals and that a physiological function of this pathway is to provide organic osmolytes such as betaine

Le cortisol est reconnu pour être une hormone clé dans le maintien de la balance hydrominérale en eau douce et dans l'adaptation à l'eau de mer, chez de nombreux téléostéens juvéniles. Cependant, son rôle au cours du développement embryonnaire est encore mal connu, notamment son implication dans le développement des cellules spécialisées dans le transport ionique, les ionocytes. L'objectif de ma thèse a été de déterminer l'implication du cortisol lors de la mise en place du lignage des ionocytes de la peau chez l'embryon de médaka (Orysias latipes) puis d'étudier les conséquences d'une élévation du cortisol embryonnaire sur les capacités osmorégulatrices des larves lors d’un transfert dans une eau pauvre en ions ou en eau de mer. Dans un premier temps, une attention particulière a été portée à la dynamique d'apparition des ionocytes de la peau du sac vitellin des embryons. Ces derniers apparaissent en deux vagues successives avec une cinétique propre. Nous avons alors proposé un modèle de développement des ionocytes pour chacune de ces vagues. Grâce à cette première étude, nous avons ensuite montré que du cortisol exogène ne modifie pas le taux de prolifération et/ou de différenciation des ionocytes épidermiques mais accélère leur différenciation. De plus, nous avons identifié un des récepteurs aux glucocorticoïdes (GR2) comme régulateur de l’ontogenèse des ionocytes, très probablement grâce à ces transcrits maternels. Enfin, nous avons montré que les larves de médaka sont capables de réguler très rapidement leurs contenus en ions Na+ et Cl- après de chocs hypo- et hyper-osmotiques. En revanche, la capacité des larves à réguler les contenus en Ca2+ est plus limitée lors d’un choc hypo-osmotique. Un doute important sur l’efficacité du traitement cortisol lors de cette dernière partie ne nous permet pas de mettre en lien le rôle du cortisol dans l’ontogenèse des ionocytes avec la fonction d’osmorégulation de ces derniers à l’éclosion. Ces travaux ont donc permis d’établir les bases de l’ontogenèse des ionocytes embryonnaires ainsi que de l’osmorégulation des larves chez le médaka pour la caractérisation du rôle du cortisol et de ses récepteurs. De façon similaire, ce modèle pourra être utilisé comme support pour l’identification et la caractérisation de nouveaux régulateurs. / Cortisol is a key hormone regulating in teleost fish water and ionic homeostasis in freshwater and seawater and in acclimation during salinity changes. However, its role during embryonic stages is still poorly known, especially its involvement in the development of ionic transport specialized cell, namely the ionocytes. The aim of my thesis was to determine cortisol involvement in epidermal ionocyte lineage establishment in medaka (Orysias latipes) embryos and to study consequences of cortisol elevation in medaka embryos on larval osmoregulatory abilities during transfer from freshwater to ion-poor environment or to seawater transfer. In a first part, we studied the dynamic of ionocyte appearance in yolk-sac epithelium of embryos. Ionocytes appear in two distinct waves with their own kinetic. This allowed us to propose a model of ionocyte development for each wave. In the continuity of this first part, we have showed that exogenous cortisol doesn’t modify the proliferation and/or differentiation rate of epidermal ionocytes but rather accelerate their differentiation. In addition, we have identified GR2, one of glucocorticoid receptors, as the main regulator of ionocyte ontogenesis, most likely through its maternal transcripts. Finally, we have showed that medaka larvae are able to quickly regulate their Na+ and Cl- ion contents after hypo- or hyper-osmotic challenges. In contrast, larvae ability to regulate Ca2+ ion contents is more limited during hypo-osmotic challenge. A doubt on the effectiveness of the cortisol treatment, in this last part, prevent us to understand the relationship between cortisol role in ionocyte ontogenesis and its osmoregulatory functions after hatching. These studies have established in medaka the basis of embryonic ionocyte ontogenesis and larval osmoregulation in order to clarify the role of cortisol and its receptors. Similarly, this fish model could be used as a support for identification and characterization of new regulators of the osmoregulation function.

Les téléostéens euryhalins peuvent vivre dans des milieux à salinité très différentes. L'objectif de mon travail est de décrire les processus d'acclimatation à l'eau salée chez la truite arc-en-ciel par une étude couplant approches de génomique fonctionnelle et génétique. A partir d'une première approche cinétique de transcriptomie différentielle menée sur la branchie, une liste de gènes candidats a été établie et la réponse physiologique des poissons étudiée. Les principaux résultats révèlent de bonnes capacités d'euryhalinité et une réponse transcriptomique maximum 24h après le transfert en eau de mer. Des processus biologiques impliqués dans les mécanismes d'acclimatation sont également proposés. Une seconde partie de ce travail consistait en la caractérisation d'un contrôle génétique des processus liés à l'acclimatation à l'eau de mer chez la truite. Utilisant comme caractères, les teneurs plasmatiques en sodium et en chlore mesurées 24h après un transfert d'eau douce en eau salée répété à 2 reprises, ainsi que le poids branchial, des analyses univariées et multivariées ont permis de détecter 18 QTL dont 9 sont qualifiés de robustes. Une dernière étape de détection de QTL d'expression a alors permis de proposer 69 gènes candidats de premier choix. C'est la première fois qu'une approche mêlant transcriptomie différentielle et approche QTL / eQTL est menée chez une espèce d'intérêt aquacole au génome non séquencé pour la capacité d'acclimatation à un milieu osmotique différent. Ces résultats pavent la route pour une investigation précise des bases génétiques des processus d'acclimatation à l'eau de mer chez les téléostéens.