Les xénobiotiques se trouvant dans l’environnement peuvent occasionner des effets délétères aux organismes vivants. Toutefois, nous sommes encore loin de connaître l’ensemble des mécanismes d’action des polluants et des réponses mises en place chez les organismes afin de survivre dans un environnement pollué. Dans ce travail, nous avons utilisé le crabe chinois, Eriocheir sinensis, comme modèle d’étude afin de mettre en évidence les réponses à un stress induit par le cadmium dissous dans le milieu aquatique. Nous avons focalisé notre attention sur la fonction d’osmorégulation. Différents types d’exposition ont été testés : une exposition « aiguë » (500 µg Cd l-1 de 1 à 7 jours) ; une exposition « chronique » (10 ou 50 µg Cd l-1 pendant 30 jours). On observe une diminution de la capacité d’hyper-osmorégulation suite à une exposition aiguë. Sous cette condition, les branchies antérieures sont endommagées et les activités de différentes enzymes diminuées. Par contre, le Cd semble sans effet sur les branchies postérieures. Il est par conséquent probable que les branchies antérieures auraient perdu leurs propriétés de perméabilité et laisseraient passer plus librement l’eau et/ou les ions. Une exposition chronique n’affecte pas l’osmorégulation. Cependant, une exposition chronique suivie d’une exposition aiguë montrent que le crabe s’acclimate, c’est-à-dire qu’il devient plus résistant au Cd. Chez ces crabes acclimatés, l’hépatopancréas est capable d’accumuler une plus grande quantité de Cd grâce, en partie du moins, à une teneur accrue en métallothionéines. L’analyse protéomique a permis d’observer que l’expression d’enzymes anti-oxydantes et de chaperonnes moléculaires est augmentée dans les branchies antérieures, suggérant que le Cd affecte les branchies en induisant des espèces réactives à l’oxygène et en oxydant les groupements sulfures des protéines. De plus, le potentiel de dégradation des protéines semble accru. Enfin, plusieurs enzymes impliquées dans différentes voies métaboliques sont sous exprimées, indiquant que le crabe entre dans un état compensatoire lui permettant de faire face à de fortes quantités de Cd. Ce travail démontre qu’une approche intégrative utilisant des analyses physiologiques, morphologiques, biochimiques et protéomiques, permet de caractériser l’état de stress dans lequel un organisme aquatique se trouve suite à différents types d’exposition à un xénobiotique. Même si une exposition chronique ne montre pas d’effet physiologique, elle peut toutefois induire des changements au niveau du protéome.

Le Loup ou Bar Dicentrarchus labrax est une espèce euryhaline dont les femelles pondent généralement en eau de mer. Pendant son cycle de vie, des migrations vers les estuaires et les lagunes, peuvent exposer très tôt les jeunes stades à des variations de salinité. Les mécanismes de l'osmorégulation sont bien connus chez les prélarves, les larves et les adultes de D. labrax en eau de mer (EM, 38) et en eau de mer diluée (EMD, 5), cependant les possibilités d'osmorégulation et leurs mécanismes sont inconnus chez les embryons. Le but de cette étude a été d'évaluer la mise en place de la fonction osmorégulatrice chez les embryons de D. labrax.Tout d'abord le développement embryonnaire des différents sites osmorégulateurs a été décrit, en se focalisant sur le tube digestif, en incluant le pharynx et les premières fentes branchiales. La formation de ces structures débute au stade 12 somites (S) et a été décrite jusqu'à l'ouverture de la bouche, 5 jours après l'éclosion.En second lieu, le lieu et la cinétique d'apparition des premières cellules osmorégulatrices, les « ionocytes » ont été recherchés. Ces cellules ont été identifiées au stade 12S sur la membrane de la vésicule vitelline et au niveau des premières fentes branchiales et du tube digestif primitif au stade 14S. La fonctionnalité de ces cellules a été étudiée grâce à des immunomarquages des principales protéines transmembranaires impliqués dans l'osmorégulation [l'ATPase Na+/K+ (NKA), le cotransporteur Na+/K+/2Cl- (NKCC) et le canal à chlore (CFTR)], et avec une étude ultrastructurale. Des ionocytes potentiellement fonctionnels sont présents à partir du stade 25S au niveau de la membrane de la vésicule vitelline et du tube digestif primitif, mais les ionocytes des premières fentes branchiales ne sont pas totalement fonctionnels à l'éclosion. L'existence d'un phénomène de boisson passive qui permettrait la régulation hydrique chez D. labrax est envisagé.Finalement, l'osmorégulation embryonnaire existant en EM et en EMD a été étudiée. Des mesures nanoosmométriques des fluides embryonnaires indiquent une capacité à hyper- et hypo-osmoréguler. Cependant, en EMD, des analyses en qRT-PCR et des immunomarquages de NKA, NKCC et CFTR révèlent que les mécanismes de l'hyper-osmorégulation peuvent limiter les pertes ioniques mais ne sont pas suffisamment efficaces pour permettre une acclimatation totale à l'EMD à ce stade très précoce. / The European sea bass Dicentrarchus labrax is a euryhaline species which usually spawns in seawater. Due to its life cycle that includes migrations to lagoon and estuaries, young stages can be exposed early to salinity variations. Osmoregulatory patterns are well known in prelarvae, larvae and adults D. labrax in seawater (SW, 38) and in dilute seawater (DSW, 5), but the possibility and mechanisms of embryonic osmoregulation are still unknown. The goal of this study was to investigate the occurence of the omoregulatory function in the embryos of D. Labrax.First, the embryonic development of the different osmoregulatory sites was described, focusing on the digestive system including the pharynx and the first gill slits. The formation of these structures is initialized at stage 12 somites (S) and was described throughout the opening of the mouth five days after hatching.Secondarily, the time and the location of the occurrence of the first osmoregulatory cells, the ionocytes were followed. These cells were identified at stage 12S on the yolk sac membrane and at stage 14S in the first gill slits and in the posterior primitive gut. The functionality of these cells was studied, using immunostaining of the main ionic transporters involved in osmoregulation [the Na+/K+ ATPase (NKA), the Na+/K+/2Cl- cotransporter (NKCC) and the chloride channel (CFTR)], and through ultrastructural investigations. Potentially functional ionocytes are present from stage 25S in the yolk sac membrane and in the gut, but gill slits ionocytes are not fully functional at hatching. Passive drinking is suspected to regulate water balance in D. labrax.Finally, the embryonic osmoregulation in SW and DSW was investigated. Nanoosmometry measurements of the embryonic fluids demonstrated some capabilities of hyper- and hypo-osmoregulation. However, in DSW, qRT-PCR and imunostaining of NKA, NKCC and CFTR, reveal that hyper-osmoregulatory mechanisms can only limit ion loss but are not efficient enough to allow a full acclimation at this early life stage.

Le loup ou bar européen effectue une partie de son cycle de vie dans les lagunes et estuaires, des eaux de transitions caractérisées par des fluctuations environnementales plus marquées qu’en milieu marin. Les mécanismes d’acclimatation à la salinité à des températures plus élevées qu’en milieu marin sont encore relativement inexplorés. Dans cette étude, des juvéniles de loup ont été préacclimatés pendant deux semaines à l’eau de mer (EM) à 18 °C (eau tempérée) ou à 24 °C (eau chaude) puis transférés soit dans l’eau douce (ED) soit dans l’EM aux deux températures testées. À 24 °C, les loups parviennent à maintenir leur pression osmotique sanguine relativement constante, quelle que soit la salinité testée. En revanche, la hausse de température affecte significativement différents traits physiologiques liés à l’osmorégulation, la régulation acido- basique, l’excrétion azotée et la production de mucus. Cette étude a notamment montré qu’une acclimatation thermique à 24 °C modifie la structure morphologique de la branchie et induit un déséquilibre de la balance ionique sanguine. Ce déséquilibre concerne particulièrement les ions Na+ et a pour conséquence une diminution du ratio Na+/Cl- plasmatique, pouvant être symptomatique d’une acidose sanguine. Après transfert en douce, une augmentation moins importante de la densité des ionocytes branchiaux et de l’activité de la pompe Na+/K+ ATPase a été observée à 24 °C comparé à 18 °C. De plus, certains transporteurs ioniques jouant un rôle clé dans l’absorption ionique en eau douce n’ont pas été induits au niveau transcriptionnel à 24 °C. Cela suggère une capacité réduite des poissons de passer d’un épithélium branchial hypo-osmorégulateur vers un épithélium hyper-osmorégulateur lors d’un transfert en eau douce à 24 °C vs 18 °C. Au niveau moléculaire, la hausse de température a affecté l’expression de plusieurs transporteurs ioniques branchiaux, notamment en EM. À 24 °C, la surexpression de transporteurs liés au transport de proton H+ pourrait être le signe d’un déséquilibre acido- basique. De plus, l’induction de transporteurs d’ammonium pourrait indiquer un besoin accru d’excréter de l’azote par voie branchiale, potentiellement lié à un métabolisme plus élevé en eau chaude. L’expression des gènes codant pour la protéine chaperonne HSP90 a été fortement affectée par la hausse de température et dans une moindre mesure par la dessalure. Pour finir, l’analyse des mucocytes suggère que la production de mucus pourrait être induite en réponse au stress thermique. Ce type d’étude fonctionnelle sur l’acclimatation à différents régimes de température permet d’apporter des éléments de compréhension pour pouvoir prédire les réponses des téléostéens face aux conséquences du changement global. / The European sea bass Dicentrarchus labrax undertakes seasonal migrations to estuaries and lagoons that are characterized by fluctuations in environmental conditions. It is unclear to what extent salinity acclimation mechanisms are affected at temperatures higher than in the sea, as usually encountered in transitional waters in spring and summer. In this study, juvenile sea bass were pre-acclimated to seawater (SW) at 18 °C (temperate) or 24 °C (warm) for two weeks and then transferred to either fresh water (FW) or SW at the considered temperatures. We have shown that sea bass are able to efficiently maintain blood osmolality at 24 °C at both salinities. However, temperature increase induced significant changes regarding several physiological traits related to osmoregulation, acid-base regulation, ammonia excretion and mucus production. This study showed that thermal acclimation at 24 °C affects gill morphology through gill remodeling and whole-organism ion balance. Plasma Na+ levels seemed to be particularly affected leading to decreased plasma Na+/Cl- ratio in warm conditions, suggesting a blood acidosis. Following FW transfer, the major effects observed were a lower increase in the density of branchial ionocytes and in Na+/K+-ATPase activity at 24 °C compared to 18 °C. Moreover, several key ion transporters involved in ion uptake were not transcriptionally induced following FW transfer at 24 °C. These data suggest a less effective capacity to switch from hypo-to hyper-osmoregulation after FW transfer when fish are exposed to higher temperature. At the molecular level, the temperature increase affected the expression of several branchial transporters, notably in SW. At 24 °C, higher expression of transporters linked to H+ transport might be linked to an acid-base imbalance. Moreover, the induction of ammonia-transporting channels might also indicate increased need for nitrogen excretion, potentially due to enhanced metabolism in warm conditions. Molecular chaperones HSP90 expression was strongly affected by temperature increase and to a lesser extent by salinity decrease. Finally, gill goblet cells analysis suggested that mucus production is increased in response to thermal stress. This study and additional functional studies investigating different temperature regimes provide insights on the effect of increased temperatures on fish responses and may help to predict how teleost will face the consequences of global change.

Les crevettes Palaemonidae sont issues d'un clade ancestral marin, qui a montré une tendance évolutive remarquable à s'adapter à des conditions non-marines, envahissant avec succès les milieux estuariens et limniques. Adulte, Macrobrachium amazonicum (A) est une espèce d'eau douce (ED) avec une stratégie d'exportation vers les estuaires des larves qui ont besoin d'eau salée pour se développer. Des populations se sont trouvées au cours du temps isolées en ED ; elles ont récemment été décrites comme une nouvelle espèce, M. pantanalense (P), qui a acquis au cours de son évolution la capacité d'effectuer tout son cycle en ED, grâce à l'acquisition de l'hyper-osmorégulation en ED dès l'éclosion, et en perdant l'hypo-osmorégulation en eau salée. Ces deux espèces représentent un bon modèle pour la reconstruction des transitions évolutives des crevettes de l'eau salée à l'ED. L'objectif de ce travail est de comprendre les différences liées à l'adaptation physiologique et moléculaire à l'ED et donc à l'osmorégulation entre les deux espèces au cours de l'ontogénèse. Pour cela nous avons étudié l'ontogenèse comparative des organes osmorégulateurs, en particulier de la cavité branchiale, et la localisation et expression de différents transporteurs ioniques. Au niveau structural, aux stades larvaires, P a un développement branchial plus précoce que A. La Na+/K+ ATPase (NKA) a été essentiellement immunolocalisée au niveau des branchies chez P et au niveau des branchiostégites chez A aux mêmes stades larvaires. Ceci suggère que la forte capacité d'hypo-osmorégulation durant l'ontogenèse de A est liée aux transports ioniques dans les branchiostegites, alors que les lamelles branchiales ne sont pas complètement développées. Sur le plan ultrastructural, les lamelles branchiales des deux espèces comportent deux types de cellules associées, les cellules septales et les cellules piliers qui toutes deux présentent des caractéristiques d'ionocytes. Une différentiation ultrastructurale a été observée au niveau des cellules piliers et de l'épithélium interne des branchiostégites suite à une acclimatation en ED. Ces cellules présentent des microvillosités apicales, profondes et nombreuses, ce qui semble être une adaptation aux faibles salinités permettant une absorption efficace d'ions. Les transporteurs ioniques impliqués dans l'osmorégulation ont été étudiés. La V-H+ ATPase (VHA) a été détectée au niveau des cellules piliers et de l'épithélium interne des branchiostégites. La NKA et l'échangeur Na+/H+ (NHE-3) ont été localisés au niveau des cellules septales. Des différences d'expressions géniques de la VHA, du NHE-3 et de la NKA ont été mesurées en comparant les 2 espèces à certains stades de développement. La distribution différentielle de ces transporteurs entre les cellules piliers et septales suggère que ces deux cellules pourraient fonctionner comme un complexe cellulaire pour absorber ou sécréter des ions. Chez P, la capacité de tous les stades à hyper-réguler en ED peut provenir du développement précoce des branchies fonctionnelles, et la perte de l'hypo-régulation peut être liée au manque de transports ioniques au niveau des branchiostégites. Enfin, les glandes excrétrices antennaires produisent de l'urine hypotonique chez les juvéniles et adultes des deux espèces en ED, ce qui diminue les pertes ioniques. Ces résultats illustrent des adaptations évolutives (perte et gain de fonctions) qui ont permis l'invasion des habitats d'ED. / Palaemonid shrimps originate from an ancestral marine clade showing a remarkable evolutionary ability to adapt to non-marine conditions, successfully invading estuarine and limnic habitats. Macrobrachium amazonicum (A) is a freshwater (FW) species as an adult with an export strategy toward estuaries of larvae requiring salt water for their development. Over time, some populations ended up isolated in FW; recently, they have been described as a new species, M. pantanalense (P), which during its evolution has become able to complete its entire life cycle in FW, thanks to the acquisition of hyper-osmoregulation in FW from hatching, while loosing hypo-osmoregulation in salt water. The two species offer a valuable model to reconstruct the evolutionary transitions of shrimps from salt water to FW. The objective of this study was to decipher the differences in physiological and molecular adaptations to FW, thus in osmoregulation, between both species during ontogeny. We studied the comparative ontogeny of osmoregulatory organs, particularly the branchial chamber, and the localization and expression of ion transporters. During the larval phase, we found that the gill development starts earlier in P than in A. Na+/K+ ATPase (NKA) was mainly localized in gills of P and in branchiostegites of A at the same larval stages. This suggests that the high capacity to hypo-osmoregulate during the ontogeny of A originates from ionic transports in branchiostegites, while gill lamellae are not fully developed. In both species, the gill lamellae contain two associated cells types, septal and pillar cells, displaying features of ionocytes. After FW acclimation, ultrastructural differences were observed in pillar cells and in the inner epithelium of branchiostegites. These cells possess numerous deep apical microvilli, a possible adaptation to low salinities for efficient ion uptake. Regarding ion transporters involved in osmoregulation, V-H+ ATPase (VHA) was detected in pillar cells and in the inner branchiostegite epithelium. NKA and Na+/H+ exchanger (NHE-3) were localized in septal cells. Differences in VHA, NHE-3 and NKA gene expression were observed by comparing the two species at certain developmental stages. The differential distribution of these transporters between pillar and septal cells suggest that these two cells may function as a cell complex for ion absorption or secretion. In P, the capacity of all stages to hyper-regulate in FW may originate from the early development of functional gills; and the loss of hypo-regulation may originate from an absence of ion transport in branchiostegites. Finally, the excretory antennal glands produce hypotonic urine in juveniles and adults of both species in FW, thus reducing ion loss. These results illustrate evolutionary adaptations (gain and loss of functions) that have permitted the invasion of FW habitats.

Les téléostéens euryhalins peuvent vivre dans des milieux à salinité très différentes. L'objectif de mon travail est de décrire les processus d'acclimatation à l'eau salée chez la truite arc-en-ciel par une étude couplant approches de génomique fonctionnelle et génétique. A partir d'une première approche cinétique de transcriptomie différentielle menée sur la branchie, une liste de gènes candidats a été établie et la réponse physiologique des poissons étudiée. Les principaux résultats révèlent de bonnes capacités d'euryhalinité et une réponse transcriptomique maximum 24h après le transfert en eau de mer. Des processus biologiques impliqués dans les mécanismes d'acclimatation sont également proposés. Une seconde partie de ce travail consistait en la caractérisation d'un contrôle génétique des processus liés à l'acclimatation à l'eau de mer chez la truite. Utilisant comme caractères, les teneurs plasmatiques en sodium et en chlore mesurées 24h après un transfert d'eau douce en eau salée répété à 2 reprises, ainsi que le poids branchial, des analyses univariées et multivariées ont permis de détecter 18 QTL dont 9 sont qualifiés de robustes. Une dernière étape de détection de QTL d'expression a alors permis de proposer 69 gènes candidats de premier choix. C'est la première fois qu'une approche mêlant transcriptomie différentielle et approche QTL / eQTL est menée chez une espèce d'intérêt aquacole au génome non séquencé pour la capacité d'acclimatation à un milieu osmotique différent. Ces résultats pavent la route pour une investigation précise des bases génétiques des processus d'acclimatation à l'eau de mer chez les téléostéens.

L’objectif de cette thèse porte sur l’étude de la compartimentalisation cellulaire et de la prise en charge de l’uranium (U) par les protéines cytosoliques des cellules branchiales du poisson zèbre (Danio rerio, espèce modèle en toxicologie aquatique) après exposition contrastées (chronique vs. aiguë, 20 et 250 µg.L-1) par voie directe. Cette étude a nécessité le développement, l’utilisation et le couplage d’outils analytiques de pointe (SEC, IEF hors-gel, RP-UHPLC pour la séparation, ICP-SFMS, ESI-FTMS/MS pour la détection) avec comme défis majeurs la conservation des interactions non-covalentes U biomolécule et une sensibilité maximale pour travailler à des niveaux d’exposition proches de ceux rencontrés dans l’environnement. Après extraction, 24 à 32% de la charge branchiale totale en U est contenue dans le cytosol dans lequel la distribution de l’U sur les biomolécules (en fonction de leur PM mais aussi de leur pI) diffère selon le niveau d’exposition. Enfin, une cartographie des biomolécules cibles de l’U a permis (i) de mettre en évidence une affinité particulière de l’U pour les protéines à caractère acide et/ou contenant du phosphore et (ii) d’identifier 24 protéines candidates pour lier U. / The objective of this thesis is to study the cellular compartmentalization and the chelation of uranium (U) by cytosolic proteins of gill cells of the zebrafish (Danio rerio, model species in aquatic toxicology) under different direct exposure conditions (chronic vs. acute, 20 and 250 µg.L 1). This study required the development of hyphenated techniques (SEC, IEF off-gel, RP-UHPLC for the separation, ICP-SFMS, ESI-FTMS/MS for the detection) with the main challenges of maintaining the non-covalent U-biomolecule interactions and enhancing sensitivity for the analysis of environmentally relevant samples. After extraction, 24% to 32% of the total U detected in the gills were present in the cytosolic fraction, in which the U distribution on the biomolecules (as a function of their MW and pI) varied depending on the exposure level. Finally, U target biomolecules mapping allowed us (i) to highlight a particular affinity of U for acidic and/or P-containing proteins and (ii) to identify 24 protein candidates for U binding.

L’augmentation de température que subit la planète ces dernières décennies a de nombreuses conséquences dont la recrudescence de maladies infectieuses aussi bien chez l’homme que chez les animaux. Certaines populations de l’ormeau européen Haliotis tuberculata, vivant dans les zones les plus chaudes de Bretagne et de Normandie ont ainsi subi de très importantes mortalités depuis 1997, dues à la bactérie Vibrio harveyi. Cependant, certaines des populations les plus sévèrement touchées se sont aujourd’hui reconstruites et les mortalités semblent s’être arrêtées dans certaines de ces zones. La question se pose donc de l’apparition d’une résistance de l’ormeau face à cette maladie émergente. Pour répondre à cette question, les réponses à l’infection de plusieurs populations naturelles par cette bactérie ont été analysées. Une population présentant une forte résistance à la maladie a été identifiée.La voie d’entrée de la bactérie (ie. les branchies) a été identifiée comme jouant un rôle dans la résistance à l’infection. Par ailleurs, des infections successives ont permis de démontrer un effet d’amorçage immunitaire. Suite à une première exposition, une protection durant jusqu’à deux mois intervient contre l’effet d’inhibition de la phagocytose, provoquée normalement par une infection à V. harveyi. La différence d’expression de gènes des hémocytes d’ormeaux sensibles et résistants a été quantifiée par RNAseq pendant une infection expérimentale. Cette comparaison a montré une reconnaissance plus efficace du pathogène chez les résistants, par des récepteurs tels que les TLR ou les PGRP. La forte surexpression chez la population résistante, d’un gène impliqué dans la synthèse de mucine qui est l’un des composants principaux du mucus renforce l’hypothèse d’une forte implication des branchies dans la résistance. Enfin, une analyse in silico des séquences obtenues en RNAseq a permis d’apporter des preuves de l’existence d’un système de méthylation de l’ADN chez H. tuberculata ainsi qu’une possible implication de ce système dans l’adaptation de l’ormeau à son milieu. / Increasing global temperatures have numerous consequences for marine ecosystems, including the rise of infectious diseases. Certain populations of the European abalone Haliotis tucerculata have suffered from severe and recurrent mortality since 1997 due to infection caused by the bacterium Vibrio harveyi, particularly in areas with higher average summer temperatures. Given the spatial heterogeneity in mortalities, and the observation that the historically most severely impacted populations have recovered in recent years, the question of the emergence of resistance to the disease was addressed. The mortality rate in response to infection by V. harveyi was quantified experimentally in abalone originating from three natural populations, and one population exhibiting resistance to the disease was identified. In a subsequent experiment, the immune response of abalone was compared between infected individuals from a resistant and from a susceptible population. The portal of entry of the bacterium (ie. gills) was identified as playing a role in resistance. Furthermore, successive exposures of abalone to the bacterium demonstrated an immune priming effect, such that following a first exposure, phagocytosis was no longer inhibited by infection with V. harveyi, and that this improved protection against the disease lasted for at least two months. Differences in gene expression was quantified by RNAseq in the hemocytes of resistant and susceptible abalone following exposure to the pathogen. This comparison showed that resistant abalone had more effective recognition of the bacterium by receptors as the TLR or PGRP. The substantial over-expression of a gene involved in the synthesis of mucin, the main component of mucus, (UDP-GalNAC) in the resistant population, supports the interpretation of a strong involvement of gills in the resistance. Finally, an in-silico analysis of the sequences obtained from RNAseq indicate the existence of a DNA methylation system in H. tuberculata and suggested an involvement of epigenetic mechanisms in the adaptation of abalone to its environment.