A 3.5 jours de développement (J3.5), l'embryon de souris est constitué d'un épithélium externe, le trophectoderme, et d'une masse cellulaire interne (MCI). La MCI est hétérogène, constituée des précurseurs de l'épiblaste (Epi) et de l'endoderme primitif (EPr), représentée par l'expression exclusive de Nanog et de Gata6 respectivement. Lors de l'implantation à E4.5, l'EPr forme un épithélium à la surface de la MCI, en regard de la cavité blastocoelique. L'Epi donnera tous les tissus du nouveau-né. L'EPr permet les premiers échanges nutritionnels entre l'embryon et la mère. Je m'intéresse au rôle de Nanog et de Gata6 dans la détermination et la différenciation de l'Epi et de l'EPr. De plus, je m'intéresse à l'implication de la signalisation RTK dans l'expression de ces deux gènes. Enfin, je cherche à comprendre les interrelations entre Gata6 et Nanog. A l'aide des modèles de souris KO, des modèles in vitro ainsi que des techniques innovantes développées au sein du laboratoire, nous avons mis en évidence que la modulation de l'expression de Nanog, Gata6, Fgf4 et Fgfr2 semble suffisante pour l'engagement des cellules vers un devenir Epi ou EPr. De plus, ces résultats permettent de proposer un nouveau modèle expliquant le rôle de Gata6 et de Nanog dans la spécification des cellules Epi et EPr. / At 3.5 days of development (E3.5), the mouse embryo consists of an outer epithelium, the trophectoderm, and an inner cell mass (ICM). The ICM is heterogeneous, composed of the precursors of the epiblast (Epi) and the primitive endoderm (PrE), expressing either Nanog or Gata6 respectively. Upon implantation at E4.5 the EPr forms an epithelium on the surface of the ICM, facing the blastocoelic cavity. The Epi give rise all tissues of the newborn. The PrE allows the first nutritional exchanges between the embryo and the mother. I focus on the role of Nanog and Gata6 in the determination and differentiation of Epi and PrE. In addition I am interested in the involvement of RTK signaling in the expression of both genes. Finally, I seek to understand the relationships between Gata6 and Nanog. Using the transgenic mouse models, in vitro models as well as innovative techniques developed in the laboratory, we have demonstrated that modulating the expression of Nanog, Gata6, FGF4 and FGFR2 seems sufficient for commitment of cells to become an Epi or EPr. Furthermore, these results allow proposing a new model explaining the role of Gata6 and Nanog in the determination and differentiation of Epi and PrE cells.

During embryonic development and embryonic stem (ES) cell differentiation, the different cardiovascular cell lineages that compose the mature heart arise from different groups of cardiovascular progenitors (CPs), which contribute to the formation of different heart regions. Mesp1 expression is the earliest sign of cardiovascular development. Tracing of the early Mesp1-exressing cells reveals that all cardiovascular cell of the mature heart arise from Mesp1-derived cells. Various functional studies demonstrated that Mesp1 acts as a central regulator of cardiovascular lineage commitment, controlling the expression of early cardiac transcription factors, and promoting the differentiation into cardiomyocytes (CMs), endothelial cells (ECs) and smooth muscle cells (SMCs). In the first part of my thesis work, we generated a Mesp1-GFP reporter ES cell line allowing tracking and isolating the earliest Mesp1-expressing cells. We found that Mesp1 marks an early population of CPs that presents the ability to differentiate into CM, EC and SMC from both heart fields. Transcriptional profiling of Mesp1-CPs uncovered cell surface markers allowing their isolation. In this work, we demonstrated that Mesp1 is required for the specification of these early CPs. To ensure harmonious cardiovascular development, CP specification and migration must be tightly coordinated. In addition to the induction of cardiovascular cell fate, Mesp1 seems also involved in the migration of early CPs, as suggested by the cardiac malformation associated with the persistence of cardiovascular specification and differentiation in Mesp1 null embryo. The upregulation of the expression of Mesp2, its closest homologue, in the cardiac mesoderm, suggest that Mesp2 could partially compensate for Mesp1 function during early cardiogenesis, while Mesp1 presents a unique and non-redundant function during CP migration. However, Mesp2 KO embryos do not present cardiac malformation but rather major skeletal malformations. Inactivation of both Mesp1 and Mesp2 leads to the complete absence of mesoderm formation and consequently heart development, precluding the assessment of the redundant function of Mesp1 and Mesp2 during cardiovascular specification and differentiation. The second aim of this work was to investigate the mechanisms that compensate for Mesp1 functions during the early steps of cardiogenesis, and those that control the unique Mesp1 function during CP migration. Using inducible gain of function experiments during ES cell differentiation, we found that Mesp2 was as efficient as Mesp1 at promoting CP specification, EMT and cardiovascular differentiation. However, only Mesp1 stimulated the polarity and directional cell migration through a cellular autonomous mechanism. Transcriptional analysis and ChIP experiments revealed that Mesp1 and Mesp2 activate a common set of target genes that promote CP specification and differentiation. We identified two direct Mesp1 target genes, Prickle1 and RasGRP3, that are strongly induced by Mesp1 and not Mesp2 and which control the polarity and the speed of cell migration. Altogether our results identify the molecular interface controlled by Mesp1 that links CP specification and migration during ES cell differentiation. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La tyrosine hydroxylase (TH) est l'enzyme clé de la biosynthèse des catécholamines, classe fondamentale de neurotransmetteurs regroupant la dopamine, la noradrénaline et l'adrénaline. Une expression atypique des catécholamines pourrait conduire à de nombreuses complications neuropsychiatriques. L'étude des facteurs qui régulent le gène de la TH est donc déterminante.<br /><br />Ce travail a pour objectif l'isolement de facteurs de transcription potentiellement impliqués dans l'expression cellulaire restreinte du gène TH de rat. Dans ce but, nous avons développé une stratégie de simple-hybride dans la levure en utilisant la boîte E et les sites octamérique/heptamérique du promoteur TH comme cibles. Deux banques d'ADN complémentaire différentes ont été criblées, issues respectivement de cerveau de rat adulte et de mésencéphale embryonnaire. Ces criblages ont conduit à l'identification de 3 facteurs de transcription candidats : rITF2, un facteur bHLH ubiquitaire déjà décrit pour son aptitude à interagir avec la boîte E du promoteur TH, Lhx9, une protéine LIM à homéodomaine, et ZENON, une nouvelle protéine à doigts de zinc spécifiquement exprimée dans les neurones. La caractérisation de ces 3 facteurs a révélé des propriétés tout à fait intéressantes. Ils sont capables d'interagir spécifiquement avec le promoteur TH, et modulent la transcription du gène TH dans des lignées cellulaires. Leurs patrons d'expression sont complexes et s'inscrivent dans une dynamique développementale très particulière, mais ne sont pas spécifiques du système catécholaminergique. Pour comprendre le rôle de ces facteurs dans l'expression cellulaire restreinte de la TH, nous avons mené une étude de transgenèse des sites cibles utilisés en simple-hybride. La boîte E joue un rôle subtil dans le système catécholaminergique périphérique, illustrant la complexité des mécanismes conduisant à l'expression cellulaire restreinte de la TH. <br /><br />Ce travail souligne les difficultés rencontrées pour isoler des facteurs de transcription impliqués dans des processus d'expression cellulaire restreinte et définit une nouvelle famille de protéines à doigts de zinc, dont ZENON, le premier membre, semble lié au phénotype neuronal. L'identification et l'étude d'autres protéines appartenant à cette famille pourraient donc s'avérer capitales pour la compréhension des mécanismes impliqués dans la mise en place et le maintien des caractères neuronaux au cours du développement.

La traduction est une étape critique de la régulation de l'expression des gènes. Chez l'oursin, la fécondation induit une augmentation de la synthèse protéique, qui dépend essentiellement de la traduction d'ARN messagers maternels. Cette synthèse protéique est indispensable au déroulement des cycles cellulaires du développement précoce. Le développement embryonnaire de l'oursin constitue ainsi un modèle de choix pour étudier la régulation de la traduction. Dans le cadre de cette thèse, le contrôle de la traduction a été étudié chez l'oursin dans deux situations : le contexte physiologique de la fécondation et le contexte de l'induction de l'apoptose. Nous nous sommes interrogés d'abord sur les mécanismes régulateurs impliqués dans la synthèse protéique après fécondation. L'une des étapes limitantes de la traduction est l'initiation. Dans ce cadre, le facteur d'initiation eIF2 joue un rôle clé. eIF2 est responsable de l'apport de la méthionine initiatrice au niveau du ribosome. Lorsque la sous-unité alpha d'eIF2 est phosphorylée, la synthèse protéique globale est inhibée et la traduction sélective de certains ARNm est stimulée. Dans les ovules non fécondés d'oursin, eIF2alpha est physiologiquement phosphorylé et la fécondation provoque sa déphosphorylation. En micro-injectant dans les ovules non fécondés un variant d'eIF2alpha mimant l'état phosphorylé, nous avons montré que la déphosphorylation d'eIF2alpha est nécessaire pour la première division mitotique chez l'oursin. Nous nous sommes intéressés au lien entre la phosphorylation d'eIF2alpha et l'induction de l'apoptose chez l'oursin. En effet, la traduction d'ARNm codant pour des protéines pro- ou anti- apoptotiques influence directement la survie des cellules. L'embryon d'oursin possède la machinerie nécessaire pour le déclenchement de l'apoptose, après induction par l'agent génotoxique MMS. Le traitement au MMS des embryons provoque la phosphorylation d'eIF2alpha. Dans cette situation, nous avons trouvé que la kinase GCN2 est impliquée dans la phosphorylation d'eIF2alpha. En fin, dans le but d'étudier comment la machinerie traductionnelle module le recrutement polysomal, nous avons analysé le traductome en réponse à la fécondation et après le traitement au MMS. Nous avons effectué une approche de séquençage à haut-débit des transcrits purifiés par gradients de polysomes. L'analyse de ces transcrits nous permettra d'appréhender le réseau des gènes régulés au niveau traductionnel lors de la fécondation et de l'induction de l'apoptose dans les embryons d'oursin.

Les êtres vivants sont exposés aux variations environnementales (notamment thermiques) à l'échelle journalière, saisonnière ou annuelle. Chez les ectothermes, la température du milieu affecte directement la température corporelle et donc la physiologie, les performances locomotrices, l'activité et de façon ultime la " fitness " des individus. Le développement embryonnaire est une étape très sensible aux fluctuations thermiques et les ectothermes ont déployé une diversité de moyens pour en atténuer les effets. Chez les espèces à pontes annuelles multiples, la reproduction s'étale sur une période étendue pendant laquelle les conditions thermiques saisonnières varient fortement. Ces fluctuations peuvent profondément contraindre l'activité des individus et affecter les trajectoires de développement. Les déterminants du succès reproducteur impliquent donc la prise en compte des contraintes environnementales mais aussi de l'ontogénie des individus. En effet, chez les espèces à croissance indéterminée, la nature des compromis d'allocation devrait fortement dépendre de la taille et de l'âge des individus. Des changements ontogéniques dans les stratégies d'allocation de la ressource sont attendus en permettant une optimisation du succès reproducteur. Au cours de cette thèse, nous avons examiné les stratégies de reproduction chez une espèce à pontes multiples, le lézard des murailles (Podarcis muralis) dans un contexte thermique contraignant (climat océanique, Centre Ouest de la France). A l'aide d'une approche expérimentale, nous avons mis en évidence le fort impact des conditions thermiques sur la qualité du développement embryonnaire et l'importance de la phénologie (date de ponte) sur les trajectoires individuelles. Les dates de ponte précoces et les températures d'incubation élevées favorisent la survie des jeunes. Le suivi CMR lancé en 2006 a permis de mettre en évidence l'importance de l'âge et de la taille corporelle des femelles dans le compromis d'allocation. Ainsi les individus âgés cessent d'allouer leurs ressources dans la croissance et favorisent la capitalisation de l'énergie. Cette transition permet de soutenir un effort reproducteur plus élevé et un engagement plus précoce dans la reproduction. Des contraintes énergétiques induites par la reproduction ont également pu être révélées en étudiant les variations saisonnières des taux de corticoïdes et de l'ectoparasitisme. Enfin l'étude de la multipaternité souligne l'influence de la taille des femelles et de la séquence de ponte sur la stratégie de reproduction.

Chez la souris, peu de choses sont connues sur les marqueurs de surface qui caractérisent les cellules souches hématopoïétiques (CSHs) embryonnaires. Durant ma thèse, j'ai étudié au niveau du placenta (Pl) et du sac vitellin (SV) les populations CD34+c-kithi, CD144+CD45+ et Sca-1+AA4.1+, déjà décrites comme enrichies en CSHs dans d'autres contextes. Le projet dans son ensemble a permis de montrer que l'enrichissement en CSHs n'implique pas les mêmes marqueurs selon le tissu considéré : dans les sites d'émergence (AGM) et d'émergence/amplification des CSHs (SV), la population la plus enrichie en CSHs a pour phénotype CD144+CD45+ ; concernant le Pl, organe d'amplification des CSHs, elle a pour phénotype CD34+c-kithiSca-1+ alors que dans le foie fœtal (FF), organe d'amplification/différenciation des CSHs, elle a pour phénotype CD34+c-kithiSca-1+AA4.1+. L'analyse moléculaire de ces populations permettra de révéler des molécules régulatrices spécifiques de l'émergence et de l'amplification des CSHs. Par ailleurs, nous avons utilisé les souris transgéniques VECR pour étudier l'origine des CSHs CD34+c-kithi du Pl et il semblerait qu'à E11.5, toutes ne proviennent pas de l'endothélium. Les résultats préliminaires réalisés sur les souris Mpl-/-, qui présentent un défaut de contenu en CSHs dans le Pl et le FF, indiquent qu'à E11.5, le potentiel hématopoïétique de la population CD34+c-kithi du Pl Mpl-/- est inférieur à celui de la population CD34+ckithi du Pl C57Bl6 ; cette différence n'est plus visible à E12.5. Le Pl constitue donc une niche transitoire d'amplification/maturation des CSHs mais il est possible qu'il puisse également produire des CSHs

Une caractéristique fondamentale des vertébrés est leur organisation métamerique, visible au niveau de la colonne vertébrale. Cette organisation se met en place au cours du développement embryonnaire et l'émergence des précurseurs des vertèbres, les somites, formés à partir du mésoderm paraxial présomitique (PSM). Depuis la découverte d'une activité transcriptionelle oscillatoire de la voie de signalisation Notch dans le PSM, on propose que cette activité oscillatoire représente l'action d'une horloge embryonnaire, l'horloge de segmentation, responsable de contrôler la formation des somites de façon périodique. Dans cette étude, je présente la découverte d'une nouvelle association de la voie Wnt avec l'horloge de segmentation en décrivant l'activité oscillatoire de Axin2, une cible de la voie Wnt, dans le PSM. Ensuite, j'ai mise en place un system d'imagerie biphoton qui nous permet d'observer l'action de l'horloge de segmentation en temps réel et in vivo dans les embryons de souris. Ce système permet de mesurer directement les paramètres des oscillations. Ultérieurement je décris la découverte d'un gradient d'expression de la protéine -caténine dans le PSM. A l'aide d'expériences de recombinaisons homologues conditionnelles nous avons déterminé que ce gradient de - caténine contrôle la maturation et différentiation des cellules dans le PSM. De plus, ce gradient constitue un signal essentiel et permissif pour les oscillations de l'horloge de segmentation. En conclusion, je propose un nouveau modèle de mise en place des somites incorporant les résultats présentés.

L’autophagie est un processus vésiculaire des organismes eucaryotes permettant de véhiculer au sein d’autophagosomes des protéines dysfonctionnelles et/ou des organites défectueux qui sont apportés à la vacuole pour y être dégradés. Les acides aminés et les squelettes carbonés ainsi générés pourront ensuite être exportés vers le cytosol et recyclés. Ce travail de thèse a consisté à identifier les rôles que joue l’autophagie au cours du développement et de la germination de la graine d’Arabidopsis thaliana. Dans une première partie, les graines du mutant d’autophagie atg5 ont été caractérisées d’un point de vue morphologique et leur remplissage en molécules de réserve a été étudié. Il a notamment été montré que la graine mutante présente une maturation accélérée et accumule plus de protéines que la graine sauvage. Dans une seconde partie, l’expression de gènes ATG8 a été mise en évidence au cours du développement de l’embryon, dans le phloème de la silique et du funicule, dans les téguments externes et internes, ainsi que dans l’endosperme de la graine. L’activité autophagique a été visualisée par l’observation en microscopie de structures autophagiques dans l’embryon en développement. Enfin, dans une dernière partie, les rôles de l’autophagie au cours de la germination ont été étudiés via le suivi de la mobilisation des molécules de réserve chez le mutant atg5, comparativement à des graines sauvages. Il a ainsi été montré que la graine mutante présente un défaut de mobilisation des protéines. Les résultats obtenus montrent donc que l’autophagie jouerait différents rôles dans la graine, notamment dans sa maturation et son vieillissement, dans l’apport des nutriments depuis la plante mère jusqu’à l’embryon, et encore dans la constitution des réserves au cours du développement, puis leur mobilisation après la germination. / Autophagy is a vesicular process of eukaryotic organisms, which consists of the transport of dysfunctional proteins and/or defective organelles within auto phagosomes toward the vacuole in order to be degraded. The generated amino acids and carbon skeletons are transported to the cytosol and recycled. The aim of this thesis work was to identify the roles of autophagy during seed development and germination in Arabidopsis thaliana. In the first part, seeds of the atg5 autophagy mutant have been morphologically characterized in order to study the accumulation of storage molecules. We demonstrated that atg5 mutant seeds are affected by an accelerated maturation and accumulate more proteins than wild type seeds. In a second part, the expression of ATG8 genes has been exhibited during the embryo development, into the phloem of silique and funiculus, in the outer and the inner integument, and in the seed endosperm. Autophagic activity has been visualized by microscopy observation of autophagic structures in the developing embryo. Finally, in the last part, the roles of autophagy during germination have been studied by monitoring the mobilization of storage molecules in the atg5 mutant seeds and compared with the wild type. We thus established that mutant seeds are affected by a defect in protein mobilization. These results show that autophagy may play several roles in seeds, for instance in the ageing and maturation processes, in the transport of nutrients from the mother plant to the embryo, or in the constitution of storage compounds during seed development and their mobilization after germination.

L’anémie de Fanconi (FANC) est une maladie génétique humaine causant chez les patients une anémie sévère, une susceptibilité accrue à certains cancers, ainsi que des anomalies du développement dont un hypogonadisme. La voie FANC est impliquée dans la réponse au stress réplicatif et la réparation de l’ADN, et joue un rôle potentiel dans la régulation physiologique des cellules souches fœtales et adultes. Dans les modèles murins de la voie FANC, le phénotype majeur est une infertilité liée à un problème de développement du lignage germinal, qui est un paradigme pour l’étude des mécanismes contribuant à la pathologie. Notre étude a porté sur la caractérisation du défaut des cellules germinales primordiales (CGP) dans les embryons murins fancg-/-. Nous avons mis en évidence un défaut numérique des CGP très tôt dans le développement du lignage germinal dès les stades 9,5-10,5 jours post coïtum (jpc). Les CGP présentent un léger défaut de la prolifération à 10,5-11,5 jpc, mais aucun blocage de cycle. L’atteinte proliférative semble trop faible pour expliquer à elle seule la diminution drastique du nombre de CGP, ainsi que le profil mosaïque des gonades embryonnaires avec la présence de cordons dépourvus de CGP observé à 13,5 jpc. L’étude in vivo et ex vivo du comportement migratoire des CGP fancg-/- a permis de mettre en évidence des anomalies de la motilité des CGP, probablement liée à une activation anormale de la GTPase RAC1. Nous avons observé à 11,5 jpc une diminution du nombre de cellules au niveau du front de migration de la population de CGP. Ces anomalies entraîneraient ainsi un retard de migration et l’incapacité pour une fraction des GCP fancg-/- d’atteindre correctement les crêtes génitales à 11,5 jpc. La déplétion des CGP semble ainsi liée principalement à un défaut migratoire conduisant à une augmentation de la mort des CGP à 11,5 jpc, associé au défaut prolifératif intrinsèque des CPG fancg-/-. / Fanconi Anemia (FANC) is a genetic human disease, causing in patient a severe anemia, a higher risk to develop some cancers, and developmental anomalies including hypogonadism. The FANC pathway is involved in the replicative stress response and DNA repair, and has a potential role in the physiological regulation of fetal and adult stem cells. In mice models of the FANC pathway, the main phenotype is the sterility issue, associated to a developmental defect of the germ cell lineage, and is so a paradigm to study the pathology. Our study aimed to characterize the primordial germ cell (PGC) defect in fancg-/- mouse embryos. We showed a numerical defect of PGC early in the germ cell lineage development, as soon as 9.5–10.5 days post coitum (dpc). PGC show a mild defect of proliferation at 10.5–11.5 dpc, but no cell cycle arrest. This low proliferative defect can neither fully explain the drastic decrease of the PGC number, nor the mosaic profile of fetal gonads displaying cords without PGC at 13.5 dpc. In vitro and ex vivo studies of the migration behavior of fancg-/- PGC highlight abnormalities of the PGC’s motility, probably linked to abberant RAC1 GTPase activity. We also observed at 11.5 dpc a decrease of the cell number at the front of migration of the PGC population in 11.5 dpc fancg-/- embryos. Those motility defects could induce a migration delay, preventing a fraction of the fancg-/- PGC population to reach correctly the genital crests by 11.5 dpc. Hence, PGC depletion seems mainly linked to a migratory defect leading to increased cell death in PGC at 11.5 dpc, associated to an intrinsic proliferation defect of fancg-/- PGC.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.