Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Il est maintenant bien établi que les niveaux circulants de peptides natriurétiques (PN) sont diminués lors de l'obésité et qu'une faible quantité est associée avec le développement futur d'un diabète de type 2 (DT2). Cependant aucune étude n'a à ce jour démontré un lien causal et mécanistique entre l'activité biologique des PN et le développement du DT2. Le but de cette thèse est d'étudier le rôle des PN au niveau du tissu adipeux et du muscle squelettique dans un contexte d'obésité et de DT2. Nous avons étudié dans un premier volet le lien entre expression et signalisation du système PN dans le tissu adipeux humain et l'insulinosensibilité. Nous avons pu montrer que l'expression du NPRA dans le tissu adipeux humain corrèle négativement avec l'insulinosensibilité et positivement avec l'expression de gènes impliqués dans la régulation du métabolisme glucidique adipocytaire. L'expression du NPRA diminue avec le grade d'obésité, le prédiabète et le diabète de type 2. Nous avons également mis en évidence un nouveau rôle biologique des PN en montrant qu'ils stimulent spécifiquement le transport de glucose dans l'adipocyte humain. Le mécanisme moléculaire implique l'activation de la signalisation d'Akt de manière GMPc-dépendante. Nous avons dans un deuxième volet mis en évidence que l'expression protéique du NPRA musculaire humain corrèle positivement avec la sensibilité à l'insuline systémique et est très diminuée chez les individus obèses. L'expression du récepteur de clairance aux PN (NPRC) est quant à lui plus élevé dans les muscles de sujets DT2. Ces résultats sont retrouvés chez la souris obèse/diabétique. De plus, nous avons montré qu'une perfusion chronique de BNP chez ces souris améliore leur contrôle glycémique ainsi que leur sensibilité à l'insuline. L'amélioration du métabolisme glucidique chez la souris DT2 s'accompagne d'une diminution de l'accumulation d'espèces lipotoxiques et d'une augmentation de la capacité oxydative lipidique musculaire. Ces résultats sont également reproduits sur des cellules musculaires humaines où un traitement chronique aux PN protège partiellement de la lipotoxicité induite par le palmitate. En résumé, cette thèse révèle que l'expression et l'activation du NPRA au niveau des muscles squelettiques et des adipocytes humains déterminent en partie la sensibilité à l'insuline et jouent un rôle clé dans le maintien de l'homéostasie glucidique. / Natriuretic peptides (NP) levels are reduced in obesity and predict the risk of type 2 diabetes (T2D). Since skeletal muscle was recently shown as a key target tissue of NP, we aimed to investigate adipose and muscle NP receptor (NPR) signaling in the context of obesity and T2D. So, we studied control of glucose metabolism in adipocyte. We firstly demonstrated that NPRA expression is positively correlated with de novo lipogenesis gene expression in human adipose tissue. Then, we showed acute NP treatment in human adipocyte increase glucose uptake and oxidation in a p38 MAPK dependent manner. In parallel to this work, we found that muscle NPRA correlated positively with whole-body insulin sensitivity in humans, and was strikingly down-regulated in obese subjects and recovered in response to diet-induced weight loss. In addition, muscle NP clearance receptor (NPRC) increased in individuals with impaired glucose tolerance and T2D. Similar results were found in obese diabetic mice. Although no acute effect of BNP on insulin sensitivity was observed in lean mice, chronic BNP infusion improved blood glucose control and insulin sensitivity in skeletal muscle of obese and diabetic mice. This occurred in parallel of a reduced lipotoxic pressure in skeletal muscle due to an up­regulation of lipid oxidative capacity. In addition, chronic NP treatment in human primary myotubes increased lipid oxidation and reduced palmitate-induced lipotoxicity. Collectively, our data show that activation of NPRA signaling in skeletal muscle is important for the maintenance of long-term insulin sensitivity by decreasing lipotoxic pressure in skeletal muscle and by increasing glucose utilization in adipocytes.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le stratum corneum (SC), couche supérieure de l'épiderme, est composé principalement de cornéocytes entourés d'une matrice lipidique. Cette structure particulière confère au SC son rôle de barrière et protège l'organisme de la perte en eau, de la pénétration de substances exogènes et de l'irradiation ultra-violette (UV). La matrice lipidique du SC est constituée de trois lipides majeurs : les céramides, les acides gras et le cholestérol organisés en phase cristalline. Cette matrice est la principale voie de pénétration des molécules exogènes à travers la peau. L'estimation de l'absorption cutanée pour l'analyse du risque des produits cosmétiques est basée sur les recommandations de l'Organisation de Coopération et de Développement Économiques (OCDE) qui prend en compte les propriétés physicochimiques des molécules i.e. Log Pow (lipophilie) et MW (masse moléculaire). En effet, l'OCDE considère une absorption de 100% pour une molécule ayant une MW inférieure à 500g/mol et un Log Pow compris en -1 et +4. En dehors de ces valeurs, l'OCDE applique une estimation de 10%. Hors, cette estimation est bien souvent loin de la réalité et a besoin d'être affinée. Notre travail s'est focalisé sur le développement d'un critère d'évaluation de la pénétration cutanée afin de moduler les données de l'OCDE par trois approches différentes : chromatographie d'affinité, spectroscopie de fluorescence et microspectroscopie infra-rouge à transformée de Fourier (FTIR) avec une source synchrotron. Etant donné que les propriétés barrières de la peau sont étroitement liées à la composition en céramides du SC, les méthodes développées en chromatographie d'affinité et spectroscopie de fluorescence se sont focalisées sur l'interaction céramide-molécules. Un critère prédictif de la pénétration percutanée a été défini avec chacune de ces méthodes :  et I. La troisième méthodologie a consisté à développer un autre critère (Sindex) par microspectroscopie FTIR avec une source synchrotron. La distribution cutanée des molécules a été suivie sur coupes microtomées de biopsies humaines. A partir de Sindex, une cartographie prédictive de la pénétration percutanée des molécules a été établie. Notre design expérimental comprenait des molécules (filtres UV, conservateurs, actifs cosmétiques) avec des Log Pow et MW variés (cf annexe 1). La pénétration cutanée de ces molécules a été étudiée avec une méthode de référence : cellules de Franz couplées à la chromatographie. Ces données de référence ont servi à valider les modèles et critères prédictifs développés. Ce travail a permis d'explorer de nouvelles pistes pour l'étude prédictive de la pénétration percutanée et de développer ainsi de nouveaux critères. Utilisés en complément des propriétés physicochimiques des molécules, ces nouveaux critères permettent d'affiner l'estimation de la pénétration cutanée de molécules exogènes pour l'analyse du risque.

L'obésité et le diabète de type 2 sont associés à la sédentarité et à une alimentation riche en graisses. En effet, les acides gras saturés s'accumulent dans les tissus non adipeux, comme les muscles squelettiques pour générer des lipides appelés céramides (CER). Mon projet de thèse s'est articulé en deux parties dont l'objectif est d'empêcher les CER d'agir. Nous avons montré que, selon la structure de la membrane plasmique, les CER altèrent la voie de signalisation insulinique en ciblant la PKB, protéine clef de la voie insulinique, via la voie PKC? dans les myotubes L6 et la voie PP2A dans les myotubes C2C12. Nous avons aussi mis en évidence que les CER altèrent la sensibilité à l'insuline via la voie PKC? dans les cellules musculaires humaines. Une fois les CER produits au niveau du réticulum endoplasmique (RE), ils sont transportés au Golgi par un transporteur CERT pour y être métabolisés en sphingomyéline (SM) et des études ont montré que la transformation des CER en SM pouvait être une étape cruciale pour empêcher les CER d'agir. Dans plusieurs modèles d'insulino-résistance musculaire, l'expression de CERT est diminuée et nous avons démontré l'importance du transport des céramides du RE vers le Golgi en inhibant artificiellement l'activité ou l'expression de CERT. A l'opposé, la surexpression de CERT améliore la sensibilité à l'insuline dans les cellules musculaires dans des conditions lipotoxiques. Nos résultats montrent que CERT joue un rôle crucial dans les mécanismes conduisant au développement de l'insulinorésistance musculaire puisque sa présence est essentielle pour le maintien d'un trafic normal des CER entre le RE et le golgi. / Obesity and type 2 diabetes are associated with a sedentary lifestyle and a diet rich in fat. Indeed, saturated fatty acids accumulate in non-adipose tissue such as skeletal muscle to generate lipids called ceramides (CER). My thesis project was divided into two parts with the objective to prevent CER to act. We have shown that, depending on the structure of the plasma membrane, CER alter the insulin signaling pathway by targeting PKB, a key insulin signalling protein, via a PKCζ pathway in L6 myotubes and a PP2A pathway in C2C12 myotubes. We also demonstrated that CER affect insulin sensitivity via the PKCζ pathway in human muscle cells. Once CER generated in the endoplasmic reticulum (ER), they are transported to the Golgi by a carrier called CERT to be metabolized into sphingomyelin (SM). Studies have shown that the transformation of CER into SM could be a crucial step to prevent CER to act. In several muscle insulin resistance models, expression of CERT is decreased and we demonstrated the importance of the transport of ceramide from the ER to the Golgi by inhibiting artificially the activity or the expression of CERT. In contrast, overexpression of CERT enhances insulin sensitivity in muscle cells in lipotoxiques conditions. Our results show that CERT plays a crucial role in mechanisms leading to the development of muscle insulin resistance since its presence is essential for maintaining normal traffic of CER between the ER and the Golgi.

La prévalence de l'obésité et du diabète de type II est en constante augmentation dans les pays industrialisés. La manifestation hépatique de ces pathologies est la NAFLD (" Non-Alcoholic Fatty Liver Disease "). Celle-ci représente aujourd'hui un réel problème de santé publique et résulte d'atteintes métaboliques et hépatiques. La NAFLD démarre par l'accumulation excessive de lipides dans les hépatocytes nommée " stéatose hépatique ". Ces lipides s'accumulent sous différentes formes comme les triglycérides, les esters de cholestérol, les diglycérides et les céramides. La lipotoxicité induite par l'accumulation de ces espèces lipidiques est à l'origine d'un dysfonctionnement au niveau cellulaire et d'une insulino-résistance. Dans ce contexte, les objectifs de ce travail de thèse ont été d'étudier in vivo le rôle des céramides dans l'apparition et les complications de la NAFLD. Pour cela, nous avons utilisé différentes approches : pharmacologiques, génétiques et nutritionnelles. Par une approche pharmacologique, nous avons montré que la fumonisine B1, un contaminant alimentaire ciblant la synthèse des céramides, est à l'origine d'une toxicité hépatique dépendante d'un facteur de transcription essentiel du métabolisme lipidique, LXR (" Liver X Receptor "). Puis, nous avons combiné différentes approches nutritionnelles et génétiques permettant d'induire ou de protéger de la stéatose hépatique. Pour cela, nous avons utilisé des souris invalidées de façon totale ou hépatocyte-spécifique pour PPARa (" Peroxisome Proliferator-Activated Receptor alpha "), un facteur de transcription essentiel au catabolisme des lipides. Cela nous a permis de confirmer le rôle essentiel de PPARa hépatocytaire dans la réponse au jeûne et l'implication systémique de PPARa dans la régulation du métabolisme des céramides au cours de l'obésité induite par un régime HFD (" High Fat Diet "). Enfin, nous avons utilisé des souris invalidées au niveau hépatocytaire pour la sous-unité catalytique de la PI3 Kinase alpha, p110a. Cela nous a permis de confirmer le rôle majeur de la voie de signalisation à l'insuline dépendante de p110a dans l'apparition de l'insulino-résistance dissociée de la stéatose hépatique induite par un régime HFD. De façon intéressante, grâce à ce modèle, nous avons démontré que la lipolyse adipocytaire (et non l'inhibition de la voie insulinémique) représente le signal dominant de l'activité hépatique de PPARa durant le jeûne. L'ensemble de ces travaux mettent en avant le rôle des céramides dans la lipotoxicité associée à la stéatose hépatique. / Prevalence of obesity and type II diabetes is constantly increasing in industrialized countries. NAFLD (" Non-Alcoholic Fatty Liver Disease ") is the hepatic manifestation of these pathologies. NAFLD represents a significant public health problem and is defined as a nexus of metabolic and hepatic diseases. NAFLD begins with fatty accumulation in the liver named "hepatic steatosis". Lipids can accumulate in different forms like triglycerides, cholesterol esters, diglycerides and ceramides. Lipotoxicity induced by the accumulation of these lipid species leads to cellular dysfunction and insulin resistance. In this context, we studied the role of ceramides in apparition and evolution of NAFLD in vivo. For this purpose, we used pharmacological, genetic and nutritional approaches. By pharmacological approach, we showed that fumonisin b1, a mycotoxin targeting ceramide synthesis, leads to hepatic toxicity, which is dependent from LXR ("Liver X Receptor"), a major transcriptional regulator of lipid metabolism. Then, we combined genetic and nutritional approaches in order to induce or protect from hepatic steatosis. For this, we used mice with hepatic or total deletion for PPARa (" Peroxisome Proliferator-Activated Receptor alpha "), a transcriptional factor essential in fatty acid catabolism. First, this model allow us to confirm the role of hepatocyte PPARa in response to fasting and second, to demonstrate the systemic involvement of PPARa in regulating ceramide metabolism during obesity induced by an HFD ("High Fat Diet"). Last, we used p110a liver-specific knockout mice, the catalytic subunit of PI3Kinase alpha. With this model, we confirmed the critical role of p110a-dependent insulin signaling in insulin resistance dissociated from hepatic steatosis induced by a HFD. Interestingly, we demonstrated with this model that free fatty acid released from adipocyte lipolysis (rather than inhibition by p110a-dependent insulin signaling) determines PPARa activity in the liver. Finally, this work highlights the key role of ceramides in lipotoxicity associated with hepatic steatosis.

Le métabolisme des lipides joue un rôle primordial au cœur de l'homéostasie cutanée. Précisément, les acides gras polyinsaturés (PUFAs) n-3 et n-6 sont impliqués dans des fonctions à la fois structurales et métaboliques, essentielles au développement et au maintien de la fonction barrière de la peau. Ces fonctions variables et complexes sont toujours partiellement incomprises à ce jour, et les conséquences qui en découlent sont évidentes et parfois néfastes. En effet, cette incompréhension limite notre capacité à reconstruire des modèles cutanés plus représentatifs de la peau normale humaine, qui sont nécessaires aux études pharmaceutiques. De plus, cette dernière fait partie intégrante de notre incapacité à déterminer les causes de certaines pathologies multifactorielles complexes telles que le psoriasis et, conséquemment, à développer des traitements efficaces pour les soigner. Les modèles de peau humaine sains et psoriasiques produits par génie tissulaire ont été exploités afin de mettre en lumière le rôle des acides gras polyinsaturés dans la fonction barrière de la peau. Au cours de cette thèse, plusieurs objectifs spécifiques ont été étudiés. Les deux premiers objectifs visaient l'optimisation du modèle de peau saine grâce à la supplémentation des milieux de culture avec, dans un premier temps, soit une supplémentation individuelle en acide alpha-linolénique (n-3 PUFAs) ou en acide linoléique (n-6 PUFAs). Dans un deuxième temps, une double supplémentation a été réalisée où l'acide alpha-linolénique et l'acide linoléique ont été ajoutés simultanément. Les résultats issus de ces deux études ont montré que la supplémentation des milieux de culture avec l'acide alpha-linolénique et celle avec les deux acides simultanément permettaient d'améliorer la fonctionnalité des substituts cutanés en diminuant l'absorption percutanée de la testostérone, alors que la supplémentation en acide linoléique seul n'avait pas d'effet. Ces résultats surprenants ont mis en évidence l'importance du ratio de n-3 et de n-6 PUFAs lors de la formation de la barrière cutanée in vitro. Le troisième objectif de cette thèse a été de caractériser l'endocannabinoïdome de la peau normale humaine et des substituts sains reconstruits par génie tissulaire. Cette étude a permis de mieux comprendre les différents acteurs du métabolisme des endocannabinoïdes au sein de la peau. Nos résultats ont aussi montré que les différents endocannabinoïdes présents dans la peau humaine étaient également retrouvés dans les substituts cutanés. De plus, une double supplémentation en acide alpha-linolénique et en acide linoléique a permis de moduler le profil d'endocannabinoïdes, confirmant que les peaux représentent un modèle adéquat pour l'étude du métabolisme des endocannabinoïdes cutanés. Finalement, le dernier objectif spécifique de cette thèse consistait à étudier le potentiel de l'acide alpha-linolénique (n-3 PUFAs) comme traitement pour soigner le psoriasis. Cette étude a permis de confirmer que les n-3 PUFAs pouvaient réguler la prolifération et la différenciation des kératinocytes psoriasiques in vitro afin qu'ils retrouvent un phénotype se rapprochant davantage de celui des cellules saines. Nos résultats montrent que cette régulation est induite par la modulation de la production des médiateurs lipidiques issus des acides gras polyinsaturés n-3 et n-6 ainsi que par l'activation et l'inhibition subséquentes des cascades de transduction du signal des kinases. En conclusion, le travail présenté dans cette thèse a permis de faire avancer de manière importante l'état des connaissances en ce qui a trait au métabolisme des acides gras polyinsaturés n-3 et n-6 au sein des peaux saines et psoriasiques. Ce dernier a également permis l'optimisation de la reconstruction tissulaire d'un modèle de peau dans le but d'obtenir un tissu affichant une barrière cutanée similaire à celle d'une peau normale humaine et, par conséquent, de mener à un modèle répondant davantage aux besoins de l'industrie pharmaceutique. Finalement, cette thèse a contribué à supporter et à promouvoir l'utilisation des n-3 PUFAs en tant que traitement possible pour les patients atteints de psoriasis, ainsi qu'à démontrer la pertinence de poursuivre les recherches dans ce domaine puisqu'elles offrent un potentiel important quant à l'amélioration de la qualité de vie des patients. / Lipid metabolism plays a central role in the skin homeostasis. More specifically, omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acids (n-3 and n-6 PUFAs) are involved in both structural and metabolic functions, which are essential for the development and maintenance of the skin barrier function. These highly variable and complex functions are still partially misunderstood to this day, and the resulting consequences are obvious. Indeed, these gaps in knowledge limit our ability to produce reconstructed skin models that are representative of normal human skin, which are necessary for pharmaceutical studies. In addition, improving our knowledge of skin lipids would help understand the causes of certain complex multifactorial pathologies such as psoriasis and would consequently lead to the development of more effective therapies. Tissue-engineered healthy and psoriatic human skin substitutes have been exploited to shed light on the role of polyunsaturated fatty acids regarding the barrier function of the skin. This thesis evaluated several specific objectives. The first two objectives aimed at the optimization of the healthy skin substitutes using first, individual supplementation of culture media with alpha-linolenic acid (n-3 PUFA) or linoleic acid (n-6 PUFA), as well as in a second step, a dual supplementation with both alpha-linolenic and linoleic acids. The results of these two studies showed that supplementation of culture media with alpha-linolenic acid and with the dual supplementation improved the functionality of skin substitutes by reducing the percutaneous absorption of testosterone, whereas the linoleic acid supplementation alone had no effect. These surprising results demonstrated the importance of the ratio of n-3 to n-6 PUFAs in the formation of the skin barrier in vitro. The third objective of this thesis was to characterize the endocannabinoidome of human skin compared to that of healthy tissue-engineered skin substitutes. This study provides a better understanding of the different actors in the metabolism of endocannabinoids within the skin. Our results show that the different endocannabinoids present in human skin were also found in the skin substitutes, and that they were modulated following a double supplementation with alpha-linolenic acid and linoleic acid, confirming that reconstructed skin equivalents are an adequate model for the study of the metabolism of cutaneous endocannabinoids. Finally, the last specific objective of this thesis was to study the potential of alpha-linolenic acid (n-3 PUFA) as a treatment for psoriasis. This study confirmed that n-3 polyunsaturated fatty acids can regulate the proliferation and differentiation of psoriatic keratinocytes so that they adopt a healthier behavior. This regulation is mediated by the modulation of the lipid mediators produced from n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids, as well as by the activation and inhibition of subsequent signal transduction cascades involving kinases. In conclusion, the results reported in this thesis significantly contribute to advancing the state of knowledge regarding the metabolism of n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids in healthy and psoriatic skin. This thesis also allowed the optimization of a skin model to be more representative of the functionality of normal human skin, and thus the generation of a more efficient model for the pharmaceutical industry. Ultimately, our work will help to support and promote the use of n-3 polyunsaturated fatty acids as a treatment for patients with psoriasis, which could greatly improve their quality of life.

Le compartiment microvasculaire est une cible importante du stress oxydant qui est un facteur majeur de la dysfonction endothéliale, notamment au cours d’exposition aux rayonnements ionisants. L’altération de l’endothélium induite par le stress oxydant est impliquée dans la toxicité radio-induite des tissus sains. Limiter les dysfonctions endothéliales est donc un enjeu important des traitements radiothérapeutiques actuels. Cet objectif nécessite une meilleure caractérisation de la signalisation du stress oxydant dans les cellules endothéliales. La voie p38 MAPK est incontournable dans la réponse au stress oxydant mais reste encore insuffisamment caractérisée. Par une approche protéomique, nous avons identifié la nucléophosmine (NPM) comme nouveau partenaire de p38 dans le cytoplasme des cellules endothéliales. La phosphatase PP2a est aussi associée à ce complexe NPM/p38. Nos travaux montrent que le stress oxydant (H2O2, 500μM) régule la déphosphorylation de NPM via PP2a, entraine sa dissociation rapide du complexe et favorise sa translocation vers le noyau. De plus, nous montrons que la présence de NPM déphosphorylée au noyau altère la réponse des cellules aux dommages à l’ADN induits par le stress oxydant. Le céramide sphingolipide membranaire est également un facteur important des voies de stress, particulièrement dans les cellules endothéliales. Notre étude aborde donc l’implication de ce sphingolipide dans la régulation de la voie NPM/p38. Une meilleure caractérisation de la voie p38 et de ses acteurs permettra d’identifier de potentielles cibles afin de limiter les dysfonctions endothéliales et leurs conséquences délétères sur les tissus environnants. / The microvascular compartment is a significant target of oxidative stress that is a major factor in endothelial dysfunction, especially during exposure to ionizing radiation. The alteration of endothelium induced by oxidative stress is involved in radiation-induced toxicity of normal tissues. Limiting endothelial dysfunction is therefore an important issue of current radiotherapeutic treatments. This objective requires a better characterization of oxidative stress signaling in endothelial cells. p38 MAPK pathway is essential in oxidative stress response but still insufficiently characterized. By using a proteomic approach, we identified nucleophosmin (NPM) as a new partner of p38 in the cytoplasm of endothelial cells. PP2a phosphatase is also associated with the NPM/p38 complex. Our work shows that oxidative stress (H2O2, 500μM) regulates the NPM dephosphorylation via PP2a, causes a rapid dissociation of the complex, and promotes its translocation to the nucleus. In addition, we show that the presence of NPM dephosphorylated at T199 in the nucleus alters the cellular response to DNA damage induced by oxidative stress. The membrane sphingolipid ceramide is also an important factor in stress pathways, particularly in endothelial cells. Our study describes the involvement of this sphingolipid in the regulation of NPM/p38 pathway. A better characterization of the p38 pathway and its actors provided by our study will identify potential targets in order to limit endothelial dysfunction and its deleterious effect on surrounding tissues.

Le stratum corneum (SC), couche supérieure de l’épiderme, est composé principalement de cornéocytes entourés d’une matrice lipidique. Cette structure particulière confère au SC son rôle de barrière et protège l’organisme de la perte en eau, de la pénétration de substances exogènes et de l’irradiation ultra-violette (UV). La matrice lipidique du SC est constituée de trois lipides majeurs : les céramides, les acides gras et le cholestérol organisés en phase cristalline. Cette matrice est la principale voie de pénétration des molécules exogènes à travers la peau. L’estimation de l’absorption cutanée pour l’analyse du risque des produits cosmétiques est basée sur les recommandations de l’Organisation de Coopération et de Développement Économiques (OCDE) qui prend en compte les propriétés physicochimiques des molécules i.e. Log Pow (lipophilie) et MW (masse moléculaire). En effet, l’OCDE considère une absorption de 100% pour une molécule ayant une MW inférieure à 500g/mol et un Log Pow compris en -1 et +4. En dehors de ces valeurs, l’OCDE applique une estimation de 10%. Hors, cette estimation est bien souvent loin de la réalité et a besoin d’être affinée. Notre travail s’est focalisé sur le développement d’un critère d’évaluation de la pénétration cutanée afin de moduler les données de l’OCDE par trois approches différentes : chromatographie d’affinité, spectroscopie de fluorescence et microspectroscopie infra-rouge à transformée de Fourier (FTIR) avec une source synchrotron. Etant donné que les propriétés barrières de la peau sont étroitement liées à la composition en céramides du SC, les méthodes développées en chromatographie d’affinité et spectroscopie de fluorescence se sont focalisées sur l’interaction céramide-molécules. Un critère prédictif de la pénétration percutanée a été défini avec chacune de ces méthodes :  et I. La troisième méthodologie a consisté à développer un autre critère (Sindex) par microspectroscopie FTIR avec une source synchrotron. La distribution cutanée des molécules a été suivie sur coupes microtomées de biopsies humaines. A partir de Sindex, une cartographie prédictive de la pénétration percutanée des molécules a été établie. Notre design expérimental comprenait des molécules (filtres UV, conservateurs, actifs cosmétiques) avec des Log Pow et MW variés (cf annexe 1). La pénétration cutanée de ces molécules a été étudiée avec une méthode de référence : cellules de Franz couplées à la chromatographie. Ces données de référence ont servi à valider les modèles et critères prédictifs développés. Ce travail a permis d’explorer de nouvelles pistes pour l’étude prédictive de la pénétration percutanée et de développer ainsi de nouveaux critères. Utilisés en complément des propriétés physicochimiques des molécules, ces nouveaux critères permettent d’affiner l’estimation de la pénétration cutanée de molécules exogènes pour l’analyse du risque. / The stratum corneum (SC) is the upper skin layer and due to its particular composition, corneocytes embedded in a lipidic matrix, it owns a role of barrier function and protects our body against water loss, penetration of exogenous molecules and UV irradiation. Its lipidic matrix is composed of three major lipids: fatty acids, cholesterol and ceramides, organised in liquid crystalline phase. This high cohesion creates cement between corneocytes. This cement is the principal pathway taken by the exogenous molecules to penetrate the skin. Percutaneous penetration estimation of cosmetic products is today based on the Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) recommendations, regarding molecules structural characteristics i.e. Log Pow (polarity) and MW (molecular weight). The OECD claims that 100% dermal absorption may be assumed if the exogenous molecule molecular mass is lower than 500 g/mol and Log Pow ranged between -1 and +4. Besides these values, a 10% coefficient is applied. This approach is sometimes far from reality. Our work focused on developing new evaluation criteria of percutaneous penetration from three different approaches: affinity chromatography, fluorescence spectroscopy and FTIR microspectroscopy with a synchrotron source in order to modulate OECD predictions. Considering that skin barrier properties are closely linked to ceramide composition and conformation within the SC, two methods were developed to study the interaction between ceramides and exogenous molecules by affinity chromatography and fluorescence spectroscopy. A predictive criterion of percutaneous penetration was developed from each of these methods:  and I. The third methodology consisted of developing a predictive criterion, Sindex, by FTIR microspectroscopy with a synchrotron source, on microtomized cuts of human skin biopsies. A predictive cartography was build from Sindex. Our experimental design included exogenous molecules (e.g. UV filters, preservatives, cosmetic actives) with various Log Pow and MW (cf annexe 1). Molecules skin penetration was studied with a Franz cell device coupled to HPLC analysis. These results served as reference data to validate our predictive models and criteria.This work permitted to set up new methods for predicting skin penetration of exogenous molecules and to develop complementary predictive criterion to Log Pow and MW. These new criterion will serve to modulate OECD predictions.

Les sphingolipides sont une famille de lipides membranaires dotés d'un rôle structural, influant sur les propriétés de la bicouche lipidique, mais ils agissent aussi comme des molécules effectrices au rôle essentiel dans de nombreux aspects de la biologie cellulaire. Les sphingolipides céramide, sphingosine et S1P ont des effets opposés: le céramide et la sphingosine inhibent la prolifération et promeuvent la réponse apoptotique à différents stimulus de stress, la S1P est un stimulateur de la prolifération et de la survie cellulaires. Le céramide peut être produit par la voie de synthèse de novo, et l'hydrolyse de la sphingomyéline membranaire catalysée par les sphingomyélinases. Ces deux voies peuvent être activées par la cytokine pro-inflammatoire TNFa, capable d’induire une perte musculaire et jouant un rôle crucial dans le développement de la cachexie. Nous avons fait l'hypothèse que le céramide, ou un de ses métabolites, peuvent être des médiateurs de la perte musculaire tumeur-induite. Nous avons examiné le rôle du céramide dans l'atrophie induite in vitro par le TNFa chez les myotubes, en utilisant des analogues de céramide et des inhibiteurs du métabolisme sphingolipidique. L'apport de céramides exogènes est capable de reproduire l'effet atrophique du TNFa, ce qui suggère que le céramide peut participer à l'atrophie musculaire. Pour vérifier si les céramides sont les médiateurs de l'atrophie induite par le TNFa, nous avons analysé l'effet d'inhibiteurs ciblant différentes étapes du métabolisme: l'inhibition de la voie de synthèse de novo est incapable de rétablir la taille des myotubes en présence de TNFa, alors que les inhibiteurs de sphingomyélinase neutre suppriment l'atrophie TNFa-induite. L’accumulation de céramide et de sphingosine augmente l’effet pro-atrophique, tandis que la S1P a un effet protecteur. Ces observations montrent que, dans les myotubes, le céramide, ou un métabolite produits par la voie de la sphingomyélinase neutre en réponse à une stimulation par le TNFa, participent à l'atrophie des cellules. Pour évaluer le rôle in vivo des sphingolipides, nous avons traité la souris BalbC porteuse d’un carcinome C26 avec myriocine, inhibiteur de la synthèse de novo, capable d'induire une déplétion du muscle en sphingolipides, Ce traitement protège partiellement les souris contre la perte de poids corporel et de poids des muscles induite par la tumeur, sans affecter la taille de celle-ci. De plus, la myriocine réverse significativement la perte de taille des fibres musculaires et réduit l'expression des atrogenes, ce qui montre qu'elle protège le muscle contre l'atrophie. Ces résultats suggèrent fortement que le céramide, ou un métabolite sphingolipidique en aval, est impliqué dans l'atrophie musculaire tumeur-induite. La voie des sphingolipides apparaît donc comme une nouvelle cible potentielle d'interventions pharmacologiques visant à protéger le tissu musculaire contre l'atrophie. / The sphingolipids are a family of membrane lipids with only a structural role, influencing lipid bilayer properties, but they also act as effector molecules with essential roles in many aspects of cell biology. The sphingolipids ceramide, sphingosine and S1P have shown opposite effects: whereas ceramide and sphingosine usually inhibit proliferation and promote apoptotic responses to different stress stimuli, S1P is known to stimulate cell growth, and promote cell survival. Ceramide can be produced through the de novo synthesis pathway, and by membrane sphingomyelin hydrolysis catalyzed by sphingomyelinases. Both pathways can be activated by the pro-inflammatory cytokine TNFa. Because this cytokine has been shown to promote muscle loss and seems to be crucial in the development of cachexia, we hypothesized that the formation of ceramide, or a metabolite, can be involved in tumor-induced muscle wasting. We investigated the role of ceramide in the in vitro atrophic effects of TNFa on differentiated C2C12 myotubes, by using cell permeant ceramides and inhibitors of sphingolipid metabolism. We observed that TNFa atrophic effects, as evaluated by the reduction in myotube area, are mimicked by exogenous ceramides, supporting the idea that ceramide can participate in muscle atrophy. To verify if ceramide is a mediator of TNFa-induced atrophy, and to identify the metabolites potentially involved, we analyzed the effects of drugs able to block sphingolipid metabolism at different steps: the inhibition of de novo synthesis pathway was unable to restore myotube size in the presence of TNFa whereas the inhibitors of neutral sphingomyelinases reversed TNFa-induced atrophy. Moreover, an accumulation of ceramide and sphingosine induced pro-atrophic effects, whereas sphingosine-1-phosphate had a protective effect. These observations establish that in C2C12 myotubes, ceramide or other downstream metabolites such as sphingosine, produced by the neutral sphingomyelinase pathway in response to TNFa stimulation, participate in cell atrophy. To evaluate the in vivo role of sphingolipids, we treated BalbC mice carrying C26 adenocarcinoma woth Myriocin, an inhibitor of the de novo pathway of ceramide synthesis, that is able to deplete muscle tissue in all sphingolipids, was administered daily to the animals. This treatment partially protected animals against tumor-induced loss of body weight and muscle weight, without affecting the size of tumors. Moreover, myriocin treatment significantly reversed the decrease in myofiber size associated with tumor development, and reduced the expression of atrogenes Foxo3 and Atrogin-1, showing that it was able to protect against muscle atrophy. These results strongly suggest that ceramide, or a downstream sphingolipid metabolite, is involved in tumor-induced muscle atrophy. The sphingolipid pathway thus appears as a new potential target of pharmacological interventions aiming at protecting muscle tissue against atrophy.