Cette thèse porte sur les méta-heuristiques hiérarchiques parallèles adaptatives pour l'échantillonnage conformationnel. Étant un problème hautement combinatoire et multlmodal, l'échantillonnage conformationnel requière la construction d'approches hybrides à large échelle. Après une analyse dei modèles mathématiques, nécessitant l'examen des différentes formulations du champ de force, nous avons proposé une étude des opérateurs de variation et des méthodes de recherche locale adaptés au problème ainsi que leur hybridation dynamique et adaptative. Cette étude nous a conduit à la proposition de mécanismes d'adaptation des paramètres des algorithmes utilisés en fonction du processus d'évolution. Dans cette thèse, nous proposons également des algorithmes adaptatifs hybndes hiérarchiques distribués, fortement extensibles. L'expérimentation, basée sur l'utilisation de multiples modèles parallèles, démontre la grande efficacité de ces algorithmes. En effet, les résultats obtenus montrent que des RMSD moyens en dessous de 1.0 A peuvent être obtenus sur des instances difficiles des problèmes de prédiction de la structure des protéines et de docking moléculaire. La validation des approches hybrides proposées a été effectuée sur Grid'5000, une grille expérimentale d'échelle nationale composée d'environ 5000 coeurs de calcul. Une image système a été développée en utilisant Globus pour permettre des déploiements distribués à large échelle. L'approche hiérarchique distribuée construite a été ainsi déployée sur plusieurs grappes, avec près de 1000 coeurs de calcul. / The thesis proposes an extensive analysis of adaptive hierarchical parallel metaheuristics for ab initio conformational sampling. Standing as an NP, combinatorial, highly multi-modal optimization problem, conformational sampling requires for high-performance large scale hybrid approaches to be constructed. Following an incremental definition, minimum complexity conformational sampling mathematical models are first analyzed, entailing a review of different force field formulations. A comprehensive analysis is conducted on a large set of operators and local search algorithms including adaptive and dynamic mechanisms. As determined by the analysis outcomes, complex a priori and online parameter tuning stages are designed. finally, highly scalable hierarchical hybrid distributed algorithm designs are proposed. Experimentation is carried over multiple parallelization models with afferent cooperation topologies. Expenmentations resulted in unprecedented results to be obtained. Multiple perfect conformational matches have been determined, on highly difficult protein structure prediction and molecular docking benchmarks, with RMSD average values below 1.0A. The validation of the proposed hybrid approaehes was performed on Grid'5000, a French computational grid, with almost 5000 computational cores. A Globus Toolkit hased Grid'SOOO system image has been developed, sustaining large scale distributed deployments. The constructed hierarchical hybrid distributed algorithm has been deployed on multiple clusters, with almost 1000 computing cores. Finally, a parallel AutoDock version was developed using the ParadisEO framework, integrating the developed algorithms.

Les protéines sont des entités intrinsèquement dynamiques et de nombreuses études ont démontré l’importance de cette propriété à leurs fonctions. Plus particulièrement, la flexibilité protéique est essentielle dans le processus de reconnaissance moléculaire. Lors de tels évènements, les protéines peuvent subir des changements conformationnels mineurs (déplacement de chaînes latérales des acides aminés), majeurs (déplacement de domaines entiers de la protéine) et/ou même se replier. Mes travaux de thèse ont permis de démontrer que de tels réarrangements mineurs sont fréquents et ont aussi permis d’élucider certaines causes potentielles physiques et chimiques. De plus, mes travaux ont démontré l’importance de considérer la flexibilité des chaînes latérales lors de simulations de tels évènements de reconnaissance moléculaire. Plusieurs méthodes computationnelles, dont la dynamique moléculaire et l’arrimage moléculaire, peuvent être utilisées pour prédire la liaison d’un ligand à sa cible. D’un côté, la dynamique moléculaire permet de considérer la flexibilité protéique à toute échelle, mais nécessite un pouvoir computationnel énorme. D’un autre côté, l’arrimage moléculaire restreint le nombre de degrés de liberté considérés, entre autres imposés par la flexibilité protéique. Mes travaux de thèse, en ce qui a attrait au développement de la méthode d’arrimage moléculaire appelée FlexAID, ont permis d’inclure une certaine flexibilité protéique intrinsèque limitant ainsi le nombre de degrés de liberté requis, tout en offrant la possibilité d’ajouter des degrés de liberté supplémentaire pour les mouvements de plus grande envergure ne pouvant être accommodés par cette plasticité protéique. De plus, mes travaux démontrent que FlexAID est compétitive aux autres méthodes dans le domaine et obtient de meilleures performances dans le scénario où les conformations des protéines sous la forme liée sont inconnues. Dans un autre ordre d’idées, les nombreuses simplifications introduites par un logiciel d’arrimage lui permettent d’être une méthode rapide et applicable à la découverte de nouvelles molécules ayant un effet thérapeutique potentiel. Lorsqu’une méthode de repointage est utilisée, les résultats de FlexAID en enrichissement de composés se rapprochent des performances d’autres logiciels couramment utilisés lors de criblage virtuel. Mes travaux portant sur le système biologique de la Matriptase-2 montrent que la méthode FlexAID peut être utilisée à la découverte de nouvelles petites molécules.

La caractérisation à haut débit des interactions protéines-protéines a permis d'établir les premières cartes d'interactions de différents organismes modèles, y compris l'homme. Cependant, la caractérisation structurale des assemblages protéiques reste limitée à un nombre très faible de ces interactions. En mettant en évidence une pression de sélection évolutive spécifique aux interfaces de complexes protéiques, ce travail a permis d'élucider certains mécanismes évolutifs essentiels à l'association entre protéines qui n'avaient pas été décrits jusqu'à présent. Sur cette base, une nouvelle approche bioinformatique, nommée SCOTCH (Surface COmplementarity Trace in Complex History), a été développée pour prédire la structure des assemblages macromoléculaires. Couplée à un programme d'amarrage moléculaire, tel que SCOTCHer, également développé au cours de cette thèse, cette approche a permis de prédire efficacement la structure d'un grand nombre de complexes. Ce travail de thèse s'est également concentré sur l'inhibition des interactions protéiques par des mini-protéines, conçues de façon rationnelle sur la base des structures de complexes. Les résultats obtenus pour deux exemples, celui du complexe Asf1 – Histone H3/H4 et du complexe gp120 – CD4 témoignent du fort potentiel du design rationnel d'interfaces de complexes pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Parmi les 57 cytochromes P450 identifiés lors du séquençage complet du génome humain, on en dénombre environ 15 dont on ne connaît pratiquement rien de leurs rôles physiologiques, de leurs substrats, et de leurs structures, d'où le nom de "P450 orphelins". Le CYP2U1 est l'un des cytochromes P450 les plus fortement exprimé au niveau du cerveau et du cervelet mais c'est aussi l'un des plus conservé parmi les différentes espèces du règne animal. Ce travail de thèse a tout d'abord consisté à optimiser les conditions d'expression du CYP2U1 sous une forme active. Un premier système d'expression dans la levure Saccharomyces Cerevisiae a permis une production d'un complexe CYP2U1-P450 réductase catalytiquement actif permettant des études de recherche de substrat. Un second système d'expression dans Escherichia Coli devrait permettre d'obtenir de plus grandes quantités d'enzyme soluble destinée à des études structurales. Dans un second temps, une recherche de substrats a été effectuée à l'aide d'analyse d'incubats par chromatographie liquide couplée à une détection par spectrométrie de masse. A ce jour, un screening dirigé de plus de soixante-dix molécules, substrats de P450s de la famille 2, a permis d'identifier les premiers substrats exogènes du CYP2U1, les analogues de terfénadone et la débrisoquine. D'autre part, une étude par modélisation moléculaire de la structure du CYP2U1 a été effectuée. Cette étude montre que le CYP2U1 diffère de tous les autres P450s par la présence d'un insert très spécifique dans son domaine N-terminal. Des modèles par homologie basés sur les structures cristallographiques des P450s de la famille 2 ont été construits. Ces modèles ont été validés par dynamique moléculaire et ont permis de proposer un mode d'interaction avec la membrane, d'identifier la position des canaux d'accès ainsi que de déterminer la topologie du site actif. Enfin, un docking des premiers substrats exogènes au sein du site actif du CYP2U1 a permis de confirmer la régioselectivité des hydroxylations catalysées par le CYP2U1.

Au cours de leur métabolisme, les céramides, produits de novo au niveau du réticulum endoplasmique, sont transportés vers l'appareil de Golgi pour être convertis en sphingomyéline. Le mode principal de ce transport implique la protéine cytosolique CERT (CERamide Transfer). La surexpression de CERT, responsable d'un abaissement du taux intracellulaire en céramide pro-apoptotique, a été associée au phénomène de résistance aux agents chimiothérapeutiques de plusieurs lignées de cellules tumorales. L'inhibition de CERT permet de resensibiliser ces lignées cellulaires aux agents anti-cancéreux. Cependant, une seule famille d'inhibiteurs de CERT est connue à ce jour : les HPAs. A l'extrémité C-terminale de la protéine, le domaine START contient le site de liaison du céramide nécessaire à l'activité de transport de CERT. A partir de structures cristallographiques, une méthode d'identification de nouveaux ligands, combinant des outils in silico et in vitro, a été développée. La jaspine B, des analogues HPAs et des iminosucres ont été mis à jour en tant qu'antagonistes potentiels de CERT par cette méthode. Certains des composés identifiés ont été synthétisés et évalués in vitro. Des sondes fluorescentes de la jaspine B ont été conçues afin d'approfondir la compréhension de son mécanisme d'inhibition. En parallèle, un test de liaison in vitro HTR-FRET a été développé, permettant le criblage haut-débit de la Chimiothèque Nationale Essentielle. / During its metabolism, ceramides, produced de novo in the endoplasmic reticulum, are transported to the Golgi complex to be converted into sphingomyelin. The main way of this transport involves the cytosolic CERT protein (Ceramide Transfer). Overexpression of CERT, responsible for a diminution of intracellular level of proapoptotic ceramide, is associated with the phenomenon of resistance to chemotherapeutic agents in several tumor cell lines. The CERT inhibition allows to resensitize these cell lines to anticancer drugs. Yet, only a single family of inhibitors is known to date: HPAs. Located at the C-terminal region of the protein, the START domain contains the binding site of ceramide necessary for the transport activity of CERT. Based on crystallographic structures, a method for the identification of new CERT ligands, combining in silico and in vitro tools, was developed. Jaspine B, HPAs analogs and iminosugars were identified as potential antagonists using this method. Some of these compounds were synthesized and evaluated in vitro. Fluorescent probes of jaspine B were designed for a better understanding of it mechanism of action. In parallel, an in vitro HTR-FRET binding assay was developed, allowing the high-throughput screening of the National Essential Compound Library.

Parmi les 57 cytochromes P450 identifiés lors du séquençage complet du génome humain, on en dénombre environ 15 dont on ne connaît pratiquement rien de leurs rôles physiologiques, de leurs substrats, et de leurs structures, d’où le nom de «P450 orphelins». Le CYP2U1 est l’un des cytochromes P450 les plus fortement exprimé au niveau du cerveau et du cervelet mais c’est aussi l’un des plus conservé parmi les différentes espèces du règne animal. Ce travail de thèse a tout d’abord consisté à optimiser les conditions d’expression du CYP2U1 sous une forme active. Un premier système d’expression dans la levure Saccharomyces Cerevisiae a permis une production d’un complexe CYP2U1-P450 réductase catalytiquement actif permettant des études de recherche de substrat. Un second système d’expression dans Escherichia Coli devrait permettre d’obtenir de plus grandes quantités d’enzyme soluble destinée à des études structurales. Dans un second temps, une recherche de substrats a été effectuée à l’aide d’analyse d’incubats par chromatographie liquide couplée à une détection par spectrométrie de masse. A ce jour, un screening dirigé de plus de soixante-dix molécules, substrats de P450s de la famille 2, a permis d’identifier les premiers substrats exogènes du CYP2U1, les analogues de terfénadone et la débrisoquine. D’autre part, une étude par modélisation moléculaire de la structure du CYP2U1 a été effectuée. Cette étude montre que le CYP2U1 diffère de tous les autres P450s par la présence d’un insert très spécifique dans son domaine N-terminal. Des modèles par homologie basés sur les structures cristallographiques des P450s de la famille 2 ont été construits. Ces modèles ont été validés par dynamique moléculaire et ont permis de proposer un mode d’interaction avec la membrane, d’identifier la position des canaux d’accès ainsi que de déterminer la topologie du site actif. Enfin, un docking des premiers substrats exogènes au sein du site actif du CYP2U1 a permis de confirmer la régioselectivité des hydroxylations catalysées par le CYP2U1. / Among the 57 human cytochrome P450 genes that have been identified; substrates, structure and physiologic role of 15 of them is practically unknown. They are called orphan. One of them, CYP2U1 is one of the most expressed cytochrome P450 in the brain and in the cerebellum but also one of the most conserved isoform in the all animal kingdom. This manuscript first describes the optimization of the heterologous expression of an active form of CYP2U1. Expression in a eukaryotic host, yeast Saccharomyces Cerevisiae first allows the production of a catalytic active CYP2U1-P450 reductase complex needed for substrate screening. Another expression system in a prokaryote host Escherichia Coli will allow higher production rate of a truncated and soluble form of the protein which will permit structural studies. Then a directed substrate screening was performed with the liquid chromatography – mass spectrometry analysis of CYP2U1 incubations. To date, 70 molecules, CYP2 family substrates, were tested that allow the identification of the two first exogenous CYP2U1 substrates: débrisoquine and terfenadone analogs. A structural study was achieved using a homology tridimensional model of the enzyme. We have found that CYP2U1 is longer than the other human CYPs, with an N-terminal 20 amino acids insertion, located after the  helical membrane spanning domain. Structural models were built using six crystallized human CYP2s as templates. Molecular dynamics experiments in membrane suggested a specific interaction with the membrane. The active site topology and the access channels were also determined and a docking of the two first exogenous CYP2U1 substrates was performed in order to confirm the regioselective hydroxylation activities observed in vitro.

La transglutaminase microbienne (Microbial transglutaminase : MTG) est fortement exploitée dans l’industrie textile et alimentaire afin de modifier l’apparence et la texture de divers produits. Elle catalyse la formation de liaisons iso-peptidiques entre des protéines par l’entremise d’une réaction de transfert d’acyle entre le groupement γ-carboxamide d’une glutamine provenant d’un substrat donneur d’acyle, et le groupement ε-amino d’une lysine provenant d’un substrat accepteur d’acyle. La MTG est tolérante à un large éventail de conditions réactionnelles, ce qui rend propice le développement de cette enzyme en tant que biocatalyseur. Ayant pour but le développement de la MTG en tant qu’alternative plus soutenable à la synthèse d’amides, nous avons étudié la réactivité d’une gamme de substrats donneurs et accepteurs non-naturels. Des composés chimiquement diversifiés, de faible masse moléculaire, ont été testés en tant que substrats accepteurs alternatifs. Il fut démontré que la MTG accepte une large gamme de composés à cet effet. Nous avons démontré, pour la première fois, que des acides aminés non-ramifiés et courts, tels la glycine, peuvent servir de substrat accepteur. Les α-acides aminés estérifiés Thr, Ser, Cys et Trp, mais pas Ile, sont également réactifs. En étendant la recherche à des composés non-naturels, il fut observé qu’un cycle aromatique est bénéfique pour la réactivité, bien que les substituants réduisent l’activité. Fait notable, des amines de faible masse moléculaire, portant les groupements de forte densité électronique azidure ou alcyne, sont très réactives. La MTG catalyse donc efficacement la modification de peptides qui pourront ensuite être modifiés ou marqués par la chimie ‘click’. Ainsi, la MTG accepte une variété de substrats accepteurs naturels et non-naturels, élargissant la portée de modification des peptides contenant la glutamine. Afin de sonder le potentiel biocatalytique de la MTG par rapport aux substrats donneurs, des analogues plus petits du peptide modèle Z-Gln-Gly furent testés; aucun n’a réagi. Nous avons toutefois démontré, pour la première fois, la faible réactivité d’esters en tant que substrats donneurs de la MTG. L’éventuelle amélioration de cette réactivité permettrait de faire de la MTG un biocatalyseur plus général pour la synthèse d’amides. Mots clés: Lien amide, biocatalyse, biotransformation, transglutaminase, arrimage moléculaire, criblage de substrats, ingénierie de substrats. / Microbial transglutaminase (MTG) is used extensively in the food and textile industry to alter the appearance and texture of products. MTG catalyses the formation of isopeptide linkages between proteins by an acyl transfer reaction between the γ-carboxamide group of a glutamine ‘acyl-donor’ substrate, and the ε-amino group of a lysine ‘acyl-acceptor’ substrate. MTG is tolerant to a broad range of reaction conditions and is therefore suitable for further development as a biocatalyst. Toward developing MTG as a “green” alternative for amide synthesis, we have investigated a range of non-native donor and acceptor substrates to probe the scope of MTG reactivity. Small, chemically varied compounds were tested as alternative acyl-acceptor substrates. We observed a broad acceptor specificity. We show, for the first time, that very short-chain alkyl-based amino acids such as glycine can serve as acceptor substrates. The esterified α-amino acids Thr, Ser, Cys and Trp – but not Ile – also show reactivity. Extending the search to non-natural compounds, an aromatic ring was observed to be beneficial for reactivity, although ring substituents reduced reactivity. Overall, bonding of the amine to a less hindered carbon increases reactivity. Importantly, very small amines carrying either the electron-rich azide or the alkyne groups required for click chemistry were highly reactive as acceptor substrates, providing a ready route to minimally modified, ‘clickable’ peptides. These results demonstrate that MTG is tolerant to a variety of chemically varied natural and non-natural acceptor substrates, which broadens the scope for modification of glutamine-containing peptides. To further probe the biocatalytic potential of MTG in terms of the donor substrate, smaller analogues of the model substrate Z-Gln-Gly were tested. We did not find product formation with substrates smaller than the model substrate. We observed, for the first time, trace esterase activity with MTG. Future improvement of this activity would render MTG a more attractive, general biocatalyst for amide bond formation.

La transglutaminase microbienne (Microbial transglutaminase : MTG) est fortement exploitée dans l’industrie textile et alimentaire afin de modifier l’apparence et la texture de divers produits. Elle catalyse la formation de liaisons iso-peptidiques entre des protéines par l’entremise d’une réaction de transfert d’acyle entre le groupement γ-carboxamide d’une glutamine provenant d’un substrat donneur d’acyle, et le groupement ε-amino d’une lysine provenant d’un substrat accepteur d’acyle. La MTG est tolérante à un large éventail de conditions réactionnelles, ce qui rend propice le développement de cette enzyme en tant que biocatalyseur. Ayant pour but le développement de la MTG en tant qu’alternative plus soutenable à la synthèse d’amides, nous avons étudié la réactivité d’une gamme de substrats donneurs et accepteurs non-naturels. Des composés chimiquement diversifiés, de faible masse moléculaire, ont été testés en tant que substrats accepteurs alternatifs. Il fut démontré que la MTG accepte une large gamme de composés à cet effet. Nous avons démontré, pour la première fois, que des acides aminés non-ramifiés et courts, tels la glycine, peuvent servir de substrat accepteur. Les α-acides aminés estérifiés Thr, Ser, Cys et Trp, mais pas Ile, sont également réactifs. En étendant la recherche à des composés non-naturels, il fut observé qu’un cycle aromatique est bénéfique pour la réactivité, bien que les substituants réduisent l’activité. Fait notable, des amines de faible masse moléculaire, portant les groupements de forte densité électronique azidure ou alcyne, sont très réactives. La MTG catalyse donc efficacement la modification de peptides qui pourront ensuite être modifiés ou marqués par la chimie ‘click’. Ainsi, la MTG accepte une variété de substrats accepteurs naturels et non-naturels, élargissant la portée de modification des peptides contenant la glutamine. Afin de sonder le potentiel biocatalytique de la MTG par rapport aux substrats donneurs, des analogues plus petits du peptide modèle Z-Gln-Gly furent testés; aucun n’a réagi. Nous avons toutefois démontré, pour la première fois, la faible réactivité d’esters en tant que substrats donneurs de la MTG. L’éventuelle amélioration de cette réactivité permettrait de faire de la MTG un biocatalyseur plus général pour la synthèse d’amides. Mots clés: Lien amide, biocatalyse, biotransformation, transglutaminase, arrimage moléculaire, criblage de substrats, ingénierie de substrats. / Microbial transglutaminase (MTG) is used extensively in the food and textile industry to alter the appearance and texture of products. MTG catalyses the formation of isopeptide linkages between proteins by an acyl transfer reaction between the γ-carboxamide group of a glutamine ‘acyl-donor’ substrate, and the ε-amino group of a lysine ‘acyl-acceptor’ substrate. MTG is tolerant to a broad range of reaction conditions and is therefore suitable for further development as a biocatalyst. Toward developing MTG as a “green” alternative for amide synthesis, we have investigated a range of non-native donor and acceptor substrates to probe the scope of MTG reactivity. Small, chemically varied compounds were tested as alternative acyl-acceptor substrates. We observed a broad acceptor specificity. We show, for the first time, that very short-chain alkyl-based amino acids such as glycine can serve as acceptor substrates. The esterified α-amino acids Thr, Ser, Cys and Trp – but not Ile – also show reactivity. Extending the search to non-natural compounds, an aromatic ring was observed to be beneficial for reactivity, although ring substituents reduced reactivity. Overall, bonding of the amine to a less hindered carbon increases reactivity. Importantly, very small amines carrying either the electron-rich azide or the alkyne groups required for click chemistry were highly reactive as acceptor substrates, providing a ready route to minimally modified, ‘clickable’ peptides. These results demonstrate that MTG is tolerant to a variety of chemically varied natural and non-natural acceptor substrates, which broadens the scope for modification of glutamine-containing peptides. To further probe the biocatalytic potential of MTG in terms of the donor substrate, smaller analogues of the model substrate Z-Gln-Gly were tested. We did not find product formation with substrates smaller than the model substrate. We observed, for the first time, trace esterase activity with MTG. Future improvement of this activity would render MTG a more attractive, general biocatalyst for amide bond formation.

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Le triméthoprime (TMP) est un antibiotique communément utilisé depuis les années 60. Le TMP est un inhibiteur de la dihydrofolate réductase (DHFR) bactérienne chromosomale. Cette enzyme est responsable de la réduction du dihydrofolate (DHF) en tétrahydrofolate (THF) chez les bactéries, qui lui, est essentiel à la synthèse des purines et ainsi, à la prolifération cellulaire. La résistance bactérienne au TMP est documentée depuis plus de 30 ans. Une des causes de cette résistance provient du fait que certaines souches bactériennes expriment une DHFR plasmidique, la DHFR R67. La DHFR R67 n'est pas affectée par le TMP, et peut ainsi remplacer la DHFR chromosomale lorsque celle-ci est inhibée par le TMP. À ce jour, aucun inhibiteur spécifique de la DHFR R67 est connu. En découvrant des inhibiteurs contre la DHFR R67, il serait possible de lever la résistance au TMP que la DHFR R67 confère aux bactéries. Afin de découvrir des inhibiteurs de DHFR R67, les approches de design à base de fragments et de criblage virtuel ont été choisies. L'approche de design à base de fragments a permis d'identifier sept composés simples et de faible poids moléculaire (fragments) inhibant faiblement la DHFR R67. À partir de ces fragments, des composés plus complexes et symétriques, inhibant la DHFR R67 dans l'ordre du micromolaire, ont été élaborés. Des études cinétiques ont montré que ces inhibiteurs sont compétitifs et qu'au moins deux molécules se lient simultanément dans le site actif de la DHFR R67. L'étude d'analogues des inhibiteurs micromolaires de la DHFR R67 a permis de déterminer que la présence de groupements carboxylate, benzimidazole et que la longueur des molécules influencent la puissance des inhibiteurs. Une étude par arrimage moléculaire, appuyée par les résultats in vitro, a permis d'élaborer un modèle qui suggère que les résidus Lys32, Gln67 et Ile68 seraient impliqués dans la liaison avec les inhibiteurs. Le criblage virtuel de la librairie de 80 000 composés de Maybridge avec le logiciel Moldock, et les essais d'inhibition in vitro des meilleurs candidats, a permis d'identifier quatre inhibiteurs micromolaires appartenant à des familles distinctes des composés précédemment identifiés. Un second criblage virtuel, d'une banque de 6 millions de composés, a permis d'identifier trois inhibiteurs micromolaires toujours distincts. Ces résultats offrent la base à partir de laquelle il sera possible de développer iv des composés plus efficaces et possédant des propriétés phamacologiquement acceptables dans le but de développer un antibiotique pouvant lever la résistance au TMP conféré par la DHFR R67. / Trimethoprim (TMP) is a common antibiotic which is used since the 60's. TMP is an inhibitor of the bacterial chromosomal dihydrofolate reductase (DHFR). This enzyme catalyses the reduction of the dihydrofolate (DHF) to tetrahydrofolate (THF) which is essential to the biosynthesis of purines thus to cellular proliferation. Bacterial TMP resistance is documented since about 30 years. One of the cause of this resistance comes from the fact that certain bacteria express a plasmidic DHFR, the R67 DHFR, which confers TMP resistance. The R67 DHFR is not inhibited by TMP and can replace the chromosomal DHFR when the latter is inhibited by TMP. The discovery of R67 DHFR inhibitors would allow to break the trimethoprim resistance granted by R67 DHFR. In order to discover R67 DHFR inhibitors, fragment based design and virtual screening approaches were selected. By fragment based design, seven simple compounds with a low molecular mass which inhibited weakly R67 DHFR (fragments) were identified. From these fragments, more complex and symmetrical compounds inhibiting R67 DHFR in the micromolar range were identified. Kinetic studies showed these inhibitors were competitive and at least two molecules bind simultaneously to the active site of the R67 DHFR. Test of the micromolar inhibitors analog showed that the presence of carboxylate, benzimidazole and the length of the molecule all have an effect on the potency of the inhibitors. Molecular docking of the inhibitors, supported by in vitro data, were used to develop a model which suggest that residue like Lys32, Gln67 and Ile68 would be involved in the binding of the inhibitors to the R67 DHFR. Virtual screening of the 80 000 compound Maybridge library with Moldock software, followed by in vitro test of the best candidate, identified four micromolar inhibitors which are chemically distinct from the inhibitor beforehand identified. A second virtual screening of a 6 million compounds bank identified three micromolar inhibitors which are also distinct from the inhibitor beforehand identified. vi These results offer a basis which will allow further development of more potent inhibitors with more acceptable pharmacologic properties in order to develop an antibiotic which would break the TMP resistance granted by the R67 DHFR.