Avec l’avènement des BioMEMS (Bio-MicroElectroMechanical Systems), ce sont toutes les pratiques médicales, biologiques, environnementales et agro-alimentaires qui entament une nouvelle ère. Les enjeux scientifique et industriel se rejoignent dans la miniaturisation des systèmes de détection, l’amélioration de leurs sensibilités et la simplification de leurs procédés de fabrication. Cette thèse hautement interdisciplinaire s’inscrit dans le cadre de ces enjeux. Elle expose la fabrication, la bio-fonctionnalisation et l’application d’un BioMEMS pour l’analyse de réactions enzymatiques en temps réel et à l’échelle micrométrique. Deux choix stratégiques ont été adoptés pour ce travail: le premier concerne l’utilisation de la technologie des plasmas froids ou polymérisation plasma pour la fonctionnalisation de surface à travers le dépôt de films polymères d’allylamine. Ce dépôt a permis ultérieurement l’immobilisation covalente de la trypsine (enzyme modèle protéolytique) au sein du BioMEMS. Cette technologie a été également utilisée pour développer une méthode simple de microfabrication des circuits microfluidiques compatible avec une production à grande échelle. Le second choix concerne l’utilisation de ce bioMEMS autour d’une transduction TeraHertz (THz) mise au point au sein de l’équipe. La spectroscopie THz vise à détecter les événements moléculaires à l’échelle de la picoseconde, sans marqueur et d’une manière non-invasive, en sondant directement les liaisons chimiques de faible énergie. Au cours de ce travail, nous avons donc développé un procédé de fonctionnalisation de surfaces par des amines, optimisé une méthode de greffage des enzymes, et étudié l’activité de la trypsine immobilisée. Nous avons ensuite intégré ces étapes dans le procédé de microfabrication du BioMEMS. Les mesures réalisées dans le domaine sub-THz (0,06-0,11 THz) sur une réaction de biocatalyse confirment la faisabilité d’une telle approche comme méthode analytique en biologie. Les résultats des différentes études montrent également que le mariage des plasmas froids avec les méthodes lithographiques représente une voie efficace, rapide et très compétitive pour le transfert de la technologie des BioMEMS à l’échelle industrielle. / The applications of miniaturized devices are no longer limited to electronic industry. Today, a new kind of microsystems called BioMEMS (Bio-MicroElectroMechanical Systems) are spreading in different fields, including biomedical, environmental and food industry applications. Recurring challenges are focusing on enabling processes for smaller, cost-effective, high-functionality devices, with more sensitivity and suitability for industrial scale development. This highly interdisciplinary thesis work attempts to provide new solutions to meet some of the needs mentioned above. It reports the fabrication, functionalization, and applications of a BioMEMS for enzyme reaction monitoring. First, we have developed a PECVD (plasma enhanced chemical vapor deposition) process for the surface functionalization by plasma polymerized allylamine. Films with high amine density and enhanced stability in aqueous environment were obtained. The amine functions were then used for enzymes immobilization. The covalently bonded trypsin molecules were extensively characterized and kinetic parameters determined using several microscopic and spectroscopic methods. Finally, both optimized processes were applied to the biofunctionalization of a TeraHertz (THz)-based BioMEMS. THz spectroscopy is the only non-invasive analytic method able to monitor molecular events at the picosecond timescale by probing low binding energies directly. It is used here for sensing a biocatalysis reaction inside the bioMEMS microchannels. Sub-THz measurements (0.06-0.11 THz) showed that combining microfluidic microsystems technology with THz detection could be a promising alternative for label-free real-time detection of biological interactions at the microscale. Additionally, we have developed a new microchannel fabrication process using direct plasma polymerization of TMDS (TetraMethylDiSiloxane) on micropatterned surfaces. This achievement demonstrates that cold plasma processes could be used not only for functionalization purposes or surface treatment but for the 3D microfabrication as well. This highly reduces processing time and manual handling steps, which is of a great importance for further industrial scale production.

Le cytochrome p450 CYP102A1, mieux connu sous le nom de BM3, provient de la bactérie Bacillus megaterium. Cette enzyme possède un groupement prosthétique hémique lui permettant de catalyser l’insertion d’oxygène dans un lien carbone-hydrogène menant généralement à une hydroxylation du substrat, ce qui en fait une monooxygénase. Ce genre de réaction demeure jusqu’à aujourd’hui difficile à effectuer par chimie traditionnelle ce qui confère un intérêt particulier à cette enzyme. Au contraire des autres cytochromes p450, BM3 est soluble (et non membranaire) et est naturellement fusionnée à son partenaire réductase formant ainsi une seule chaîne polypeptidique. Ainsi, au cours des dernières années, BM3 a attiré beaucoup d’attention de la part de l’industrie de la chimie fine et pharmaceutique due à son potentiel biocatalytique important. Cependant, son usage en industrie est restreint par son instabilité ainsi que par le coût prohibitif du cofacteur qui lui est nécessaire pour catalyser ses réactions, le NADPH. Cette thèse décrit le développement de différentes stratégies visant à libérer les réactions effectuées avec BM3 de leur dépendance au NADPH, tout en maximisant le rendement spécifique de la monooxygénase. En place du NADPH, deux autres cofacteurs de moindre coût furent utilisés comme alternative, soit le NADH et le N-benzyle-1,4- dihydronicotinamide (NBAH) en utilisant le mutant R966D/W1046S de BM3. Afin de maximiser le rendement spécifique de BM3, l’une des stratégies de cette thèse, l’optimisation du milieu réactionnel, repose sur deux éléments clés, soit favoriser la stabilité du cofacteur, car celui-ci est plus instable que l’enzyme elle-même, ainsi que d’abaisser au minimum la température de la réaction, car nous avons constaté que ceci avait pour effet d’augmenter le couplage entre les réactions réductase et monooxygénase et donc la stabilité de l’enzyme. L’effet net de la réaction ainsi optimisée fut d’augmenter le rendement spécifique du mutant R966D/W1046S par un facteur situé entre 2 et 2.6 en fonction du cofacteur utilisé. D’autre part, deux stratégies d’ingénierie enzymatique furent explorées afin de générer des mutations pouvant augmenter la performance de BM3. L’une d’entre elles, la mutagenèse par consensus guidé, généra une librairie de mutants de laquelle les mutants NTD5 et NTD6 furent identifiés, augmentant le rendement spécifique de l’enzyme comparativement à leur parent, R966D/W1046S, par un facteur de 5.2 et 2.3 pour le NBAH et le NADH, respectivement. L’autre stratégie explorée fut d’appliquer une pression sélective sur la bactérie Bacillus megaterium pour forcer, par évolution expérimentale, la performance de l’enzyme. De cette stratégie, un nouveau mutant de BM3 nommé DE, possédant 34 acides aminés substitués sur sa séquence, fut généré. Ce dernier a démontré une plus forte résistance aux solvants organiques ainsi qu’une augmentation de son rendement spécifique vis-à-vis le NADPH et le NADH d’un facteur de 1.23 et 1.76, comparativement à BM3 sauvage, respectivement. Les stratégies décrites dans cette thèse présentent une amélioration significative du rendement spécifique de BM3 ainsi que deux iii nouvelles méthodologies avec lesquelles une enzyme peut être optimisée et de nouvelles mutations bénéfiques identifiées. / The p450 cytochrome CYP102A1, better known as BM3, comes from the bacteria Bacillus megaterium. This enzyme possesses a prosthetic heme group enabling it to catalyze the insertion of oxygen into a carbon-hydrogen bond generally resulting in the hydroxylation of the substrate, the enzyme is therefore a monooxygenase. This type of reaction remains difficult to achieve by traditional chemistry. Unlike other p450 cytochromes, BM3 is soluble (is not membrane bound) and is naturally fused to its reductase partner forming a single polypeptide chain. As such, in recent years, BM3 has garnered much attention from the pharmaceutical and fine chemical industries, due to its high biocatalytic potential. However, its use in industry remains constrained by its instability as well as by the prohibitive cost of its cofactor, NADPH. This thesis describes the development of different strategies aiming at liberating reactions driven with BM3 from their dependence to NADPH whilst maximizing the specific yield of the monooxygenase. Instead of NADPH, two other inexpensive cofactors were used, namely NADH and N-benzyl-1,4-dihydronicotinamide (NBAH) by using the BM3 mutant R966D/W1046S. To maximize BM3 specific yield, one of the strategies used in this thesis work, the optimization of the reaction medium, rested on two key elements. Firstly, favouring the stabilization of the cofactor, as it was found to be more unstable than the enzyme itself and secondly lowering the reaction temperature as this effectively augmented oxidase/reductase reactions coupling and as such the stability of the enzyme. The net effect of the optimized reaction was to enhance the specific yield of the BM3 mutant R966D/W1046S by a factor of 2 and 2,6 depending on which cofactor was used. Two other enzymatic engineering strategies were explored to generate mutations which could enhance the performance of BM3. One of these, consensus guided mutagenesis, generated a library of mutants from which mutants NTD5 and NTD6 were identified enhancing the specific yield of the enzyme comparatively to their parent, R966D/W1046S, by a factor of 5,24 and 2,3 for NBAH and NADH respectively. The other strategy explored was to apply a selective pressure on Bacillus megaterium to force, by experimental evolution, the performance of the enzyme. From this strategy, a new mutant of BM3 called DE, possessing 34 new amino acid substitutions, was generated. This new mutant displayed a greater resistance to organic solvents as well as an augmentation of specific yields when used alongside NADPH and NADH comparatively to wild type BM3 by a factor of 1,23 and 1,76 respectively. The strategies described in this thesis allowed a significative enhancement of BM3 specific yield as well as represent two new methodologies by which new beneficial mutations can be identified.

Face à l’apparition croissante de troubles pigmentaires liés à l’exposition aux UV, le développement de nouveaux actifs blanchissants représente un enjeu majeur pour l’industrie cosmétique. De plus en plus de consommateurs s’orientent vers des produits eco-responsables, il devient urgent de développer de nouvelles méthodes de biocatalyse pour accéder à des antipigmentants. Certains glycosides, comme l’arbutine présentent des propriétés blanchissantes qui restent toutefois limitées face à l’hydrolyse rapide de la liaison O-glycosidique. L’enjeu du projet consiste à synthétiser des analogues de cette molécule en série thioglycosidique. En effet, cette liaison permet une plus grande stabilité vis à vis de l’hydrolyse. La mutation d’une glycosidase native issue de dictyoglomus thermophilum a permis d’accéder à une thioglycoligase. Cette dernière permet d’obtenir par catalyse enzymatique des analogues de l’arbutine. Six composés en série S- et O-glycosidique ont pu être synthétisés et testés en tant qu’agents dépigmentants. La méthodologie de synthèse a ensuite été appliquée pour l’obtention de thioglycolipides. Ces molécules sont connues pour leurs propriétés hydrogélifiantes permettant d’accéder à des matériaux thermoreversibles. Cinq molécules ont été identifiées en tant qu’agents hydrogélifiants. Les propriétés rhéologiques, thermiques et structurales ont été caractérisées mettant en évidence des différences significatives parmi les composés. Enfin les résultats préliminaires sur la formulation d’un produit à la fois antipigmentant et texturant s’avèrent prometteurs pour la validation d’un concept de matériau intelligent pour l’industrie cosmétique. / Considering the increasing appearance of pigmentation disorders caused by UV exposure, the development of new whitening agents is a major challenge for the cosmetics industry. Consumers are turning to ecoresponsible products, it is urgent to develop new methods of biocatalysis for the access to new depigmenting agents. Some glycosides, such as arbutin, have whitening properties which are still limited because of therapid hydrolysis of the O-glycosidic bond. The challenge of this project is synthesize analogues of this molecule in thioglycoside series. Endeed, this bond allows a greater stability against the hydrolysis. The mutation of anative glycosidase to dictyoglomus thermophilum gives access to a thioglycoligase. This makes possible the enzymatic synthesis of arbutine analogues. Six molécules were synthesized and tested as depigmenting agents. The synthesis methodology was then applied to the preparation of thioglycolipids. These moleculesare known for their hydrogellating properties allowing access to thermoreversible materials. Five molecules have been identified as hydrogellating agents. The rheological, thermal and structural properties have been characterized and showed significant differences depending of the compound structure. Lastly, the preliminary results on the formulation of a product that is both antipigmenting and texturizing are promising for the validation of an smart material concept for the cosmetic industry.

Orientador: Silvio Roberto Andrietta, Maria da Graça Stupiello Andrietta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-05T09:44:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_NadiaRegina_D.pdf: 2745233 bytes, checksum: 7cf319498daaffb9bb2444145a564341 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Algumas variedades de milho usadas em rotação com a soja, são sensíveis ao composto diclosulam aplicado em solo para o controle de ervas daninhas. Esse trabalho teve como objetivo isolar microrganismos capazes de degradar esse composto. O estudo envolveu isolamento e seleção de microrganismo, otimização de meio para o cultivo desses microrganismos assim como teste para produção de biomassa em escala de fermentador. Foram coletadas amostras de solos de três localidades (Uberlândia, Rondonópolis e Londrina) em plantio de soja os quais receberam aplicação de diclosulam. As amostras foram coletadas em três diferentes parcelas do solo: entrelinhas, rizosfera e oriundo da mata de vegetação natural (mata virgem). As amostras foram diluídas até ¿10 POT. 6¿, e semeadas em placas contendo os seguintes meios de cultivo: Mínimo, King¿s B e Rosa de Bengala suplementados com diclosulam 10¿mu¿g/mL. Os microorganismos foram incubados por 72 horas a ¿32 GRAUS¿C. as linhagens selecionadas, que apresentaram crescimento nos meios onde o diclosulam estava presente foram transferidas para os mesmos meios de origem, agora com 100¿mu¿g/mL de diclosulam. Os microrganismos capazes de crescer a essa concentração foram transferidos para meio Mínimo, agora suplementado com 500 'mu¿g/mL de diclosulam. Os resultados obtidos foram: 16 linhagens provenientes de Uberlândia, 3 de Rondonópolis... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Some corn varieties used in crop rotation with soybean are sensitive to diclosulam compound applied on soil for weed control. The purpose of this work was to isolate microorganisms able to degrade this compound. The study comprised microorganism isolation and selection, medium optimization for cultivation of these microorganisms, as well as a test for biomass production at fermentor scale. Soil sampling has been taken from three locations (Uberlândia, Rondonópolis and Londrina), where disclosulam had been applied. The samplings were collected in three different soil plots: interlines, rhizosphere and from natural vegetation woods. Samplings were diluted up to ¿10 POT 5¿, and seeded in plaques containing the following cultivation media: minimum, King¿s B and Bengale Rose supplemented with 10¿mu¿g/mL diclosulam. The microorganisms were incubated for 72 hours at ¿32 GRAUS¿C. the selected strains, which presented growth in the media containing diclosulam were transferred to the same original media, now with 100 'mu¿g/mL of diclosulam. The microorganisms able to grow at this concentration were transferred to the minimum medium, now supplemented with 500 'mu¿g/mL of diclosulam. The results obtained were: 16 strains from Uberlândia, 4 from Rondon[opolis. In the case of Londrina, no strain was possible to be isolated (6 strains were isolated only at concentration of 100 'mu¿g/mL)... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Nous nous sommes inspirés des solutions élégantes que la Nature propose, concernant le contrôle et l’optimisation de réactions spécifiques, pour présenter une tentative d’imitation des interfaces biocatalytiques au niveau de nanotubes. Des brosses de nanotubes auto-assemblés à l’aide d’un composé enzymatique, la bêta-lactamase, ont été préparées via des techniques de nanofabrication comme le «layer-by-layer» et le «hard templating».En premier lieu, les effets de confinement géométriques et ses conséquences ont été étudiés et comparés pour des assemblages de films de chitosan/bêta-lactamase sur des surfaces planes et au sein de membranes nanoporeuses.Ensuite, des nanotubes de polyélectrolytes de dimensions contrôlées ont été préparés dans des membranes nanoporeuses puis ancrés sur une surface par couplage chimique pour obtenir des brosses de nanotubes. Des études cinétiques révèlent la présence d’enzymes actives dans ces brosses et une amélioration de la préservation de l’activité quand la bêta-lactamase a été déposée dans les couches intérieures des nanotubes.Enfin, une variété de couches thermo-sensibles avec différentes architectures a été testée pour contrôler la diffusion du substrat sur les films multicouches de bêta-lactamase. L’intégration d’éléments thermo-sensibles stables a été prouvée. Mais des expériences complémentaires avec des mécanismes plus complexes tels que le couplage des réponses thermiques et mécaniques sont nécessaires pour contrôler la biocatalyse impliquant des couches supplémentaires.En résumé, cette étude présente des éléments ouvrant la voie à l’intégration de techniques pour la fabrication de nanostructures complexes pour la biocatalyse. / Inspired by the elegant solutions that Nature has provided to control and promote specific site-reactions, my work presents an attempt to mimic filamentous biocatalytic interfaces. Brushes of self-assembled nanotubes with an enzymatic component (beta-lactamase) were prepared taking advantage of preexisting nanofabrication techniques, such as layer-by-layer and hard-templating.First, the effects of geometrical confinement and its consequences were investigated by comparison of (chitosan/beta-lactamase) multilayer film assembly on flat surfaces and in nanoporous membranes. In a second stage, polyelectrolyte nanotubes with controlled dimensions were prepared in nanoporous membranes and further anchored on a surface by chemical crosslinking to obtain brushes of nanotubes. The kinetic studies revealed the presence of active enzyme in the brushes and enhanced activity preservation when beta-lactamase was deposited as the inner layers of the nanotubes.As a final step, a variety of thermo-responsive coatings with different architectures were tested to control substrate diffusion on top of beta-lactamase-based multilayer films. The integration of stable thermo-responsive elements was proven, although further experiments are required to control biocatalysis with additional layers and using more complex mechanisms, such as coupled thermal and mechanical responses. Knowing that there are more challenges to face before reaching optimum nanotube brushes and apply them for controlled biocatalysis, this study contributes with some elements that may pave the way towards the integration of different techniques for the fabrication of complex biocatalytic nanostructures.

L'objectif de ce travail était d'étudier l'impact du mode de préparation et de la formulation de bioplastiques transparents issus d'huile de soja sur leur structure et leurs propriétés thermiques et mécaniques. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l'huile de soja époxydée (ESO), qui a ensuite été acrylée et co-polymérisée avec méthacrylate de méthyle (MMA) en présence ou non de nano-particules de dioxyde de titane. Deux méthodes de préparation d'ESO ont été comparées. La première a fait appel à une époxydation chimique en présence de peroxyde d'hydrogène et d'acide formique. L'acide sulfurique a été utilisé comme catalyseur pour la production de peracides, ces oxydants forts générant ensuite des époxydes par attaque des doubles liaisons des acides gras de l'huile. La seconde consistait en une époxydation chimio-enzymatique, les peracides étant alors générés dans des conditions douces de pH et de température par catalyse enzymatique en présence d'H2O2 et d'huile. Deux types de lipases ont été utilisées comme biocatalyseurs : la lipase de Candida antarctica (Novozyme 435) et la lipase/acyltransférase de C. parapsilosis. Un contrôle de la réaction a permis d'obtenir des produits à différents degrés d'époxydation (50 et 75  3 %). Les effets du mode d'époxydation, du degré d'acrylation et des teneurs en MMA et TiO2 sur les propriétés des bioplastiques obtenus ont été étudiés par FTIR, RMN 1D et 2D, DMTA, TGA et par mesure des propriétés mécaniques.Mots-clés : Biocomposite, Bioplatique, Nanocomposite, Huile de soja époxydée et acrylée (AESO), Dioxyde de titane (TiO2), Biocatalyse, Lipase / The aim of this research to study the effect the production method and the formulation of transparent soybean oil-based bioplastics on their structure and their thermal and mechanical properties. We focused on epoxidized soybean oil (ESO), that was acrylated and copolymerized methyl methacrylate (MMA) with and without titanium dioxide (TiO2). Two methods of ESO preparation were compared. The first used chemical epoxidation in the presence of H2O2 and formic acid, using sulfuric acid as a catalyst to produce peracids as strong oxydants for the epoxidation. The second one was a chemo-enzymatic method where the peracids were generated in mild conditions by an enzyme in the presence of H2O2. Two types of lipases were selected as biocatalysts for the chemo-enzymatic epoxidation: Novozyme®435 and a non-commercial lipase/acyltransferase (CpLIP2). The reaction was controlled so as to obtain different degrees of epoxidation (DOE), i.e. 50+/-3 mol% and 75+/-3 mol%, from both methods. Acrylated ESO (AESO) was chemically synthesized by acrylation of ESO and acrylic acid. Then AESO was copolymerized with MMA and cured to form a rigid polymer using 1 wt% of benzoyl peroxide as a free radical initiator. A nanocomposite was prepared by blending AESO-co-PMMA with 0.1-0.2 wt% nano-TiO2 (particle size 2-5 nm). The effect of degree of acrylation, MMA content and titanium dioxide content on structural, tensile and thermal properties of the obtained bioplastics were studied using Fourier transform infrared spectrometer (FTIR), 1D and 2D NMR, dynamic mechanical thermal analysis (DMTA), thermogravimetric analysis (TGA) and mechanical properties determination.

Les activités anthropiques ont considérablement augmenté la quantité de gaz à effet de serre (GES) dans l'atmosphère et sont un contributeur majeur au réchauffement climatique. Le dioxyde de carbone (CO₂) est considéré le principal gaz à effet de serre qui contribue largement aux changements climatiques. Diverses technologies sont explorées à travers le monde pour la capture et la séquestration du CO₂. Les solutions à base d'amines sont considérées des solvants efficaces, mais ils sont énergivores et ont des impacts négatifs sur l'environnement. L'absorption du CO₂ à l'aide de l'enzyme anhydrase carbonique (AC) comme catalyseur (libre en solution ou immobilisé) est une technologie prometteuse qui offre une sélectivité et une efficacité élevées pour la capture du CO₂, tout en utilisant des solvants non toxiques et moins énergivores. L'AC est un biocatalyseur bien connu, doté d'une aptitude extraordinaire à absorber les molécules de CO₂ (grâce à son énorme constante catalytique (turnover number, TON)), ce qui lui confère une très grande capacité à stimuler l'hydratation du CO₂. L'immobilisation de l'AC sur des surfaces solides améliore la stabilité et la réutilisation de l'enzyme, en permettant une séparation facile des produits de la réaction sans la contamination du biocatalyseur. Dans ce contexte, cette thèse se concentre sur l'étude de l'absorption du CO₂ en utilisant l'AC immobilisée dans différents bioréacteurs. Plus précisément, les principaux objectifs sont: i) de développer un processus enzymatique amélioré en utilisant l'AC immobilisée dans une colonne à garnissage, ii) d'étudier l'absorption du CO₂ dans un contacteur à membrane avec l'enzyme immobilisée sur la surface de la membrane, et iii) de proposer un nouveau procédé enzymatique hybride dans un contacteur à membrane plane en intensifiant l'absorption du CO₂ par l'enzyme immobilisée autant sur la membrane que sur la surface de nanoparticules magnétiques (MNPs). Une nouvelle technique d'immobilisation de l'AC a été développée en combinant (i) la codéposition de Polydopamine (PDA)/Polyethyleneimine (PEI) contenant des groupes fonctionnels aminés pour fonctionnaliser les surfaces et (ii) l'immobilisation covalente de l'enzyme sur les surfaces aminées en utilisant du glutaraldéhyde. L'approche proposée est intéressante en raison de sa simplicité, de l'abondance des fonctionnalités (amine) du PEI, et de la grande capacité d'adhésion du PDA pendant le processus de fonctionnalisation de la surface, ainsi que de la stabilité et de la réutilisation de l'enzyme immobilisée par liaison covalente. Un procédé enzymatique hybride avec l'enzyme AC immobilisée sur la surface du garnissage et des MNPs dispersées dans l'absorbant liquide (eau) a été développé dans un bioréacteur constitué par une colonne gaz-liquide. L'enzyme a été immobilisée sur la surface fonctionnalisée des MNPs et du garnissage par liaisons covalentes. Même après 40 jours, l'enzyme immobilisée sur le garnissage et les MNPs a montré une remarquable stabilité, conservant, respectivement, 80 % et 84,7 % de son activité initiale. Étant donné que l'enzyme immobilisée sur les MNPs fonctionne comme une enzyme libre en solution, le processus d'hydratation du CO₂ s'est amélioré de manière significative, en particulier lorsqu'il y a une plus importante limitation de la diffusion lors du processus enzymatique avec l'enzyme immobilisée sur la surface du garnissage. L'AC immobilisée sur la surface d'une membrane plane en polypropylène (PP) par codéposition de PDA/ PEI par liaison covalente a montré la plus grande activité et a conservé la plupart de son activité initiale après 40 jours (82.3%). Un flux d'absorption de CO₂ de 0,29x10⁻³ mol/m²s a été atteint en intégrant la membrane biocatalytique dans un contacteur à membrane plane (FSMC), en utilisant l'eau comme absorbant. Un taux stable d'absorption a été obtenu pendant l'opération à plus long terme (6 heures), illustrant le potentiel de cette technologie dans des applications industrielles. La résistance au transfert de masse dans les pores de la membrane partiellement remplis de liquide a été réduite par l'hydratation catalysée du CO₂ dans ces pores en présence de l'AC immobilisée. L'absorption de CO₂ dans un contacteur à membrane plane avec de l'AC immobilisée sur la surface de la membrane a été intensifiée en incorporant également l'enzyme immobilisé sur la surface des MNPs dispersés dans la phase liquide. Le processus d'absorption du CO₂ a été amélioré grâce à la présence de MNPs biocatalytiques qui agissent comme une enzyme libre en phase liquide. L'AC a été immobilisée de manière covalente sur la surface des MNPs fonctionnalisées. L'absorption du CO₂ a été améliorée dans ce système hybride innovant de contacteur à membrane intensifié en maximisant l'utilisation du TON de cette enzyme, en particulier à des concentrations plus faibles d'enzyme sur la membrane biocatalytique. Autant la membrane que les MNPs avec l'AC immobilisée ont démontré leur réutilisabilité, en conservant leurs activités initiales même après 10 cycles d'absorption. Le contacteur à membrane intensifié a également montré un fonctionnement stable pendant plusieurs heures. En conclusion, les résultats obtenus dans cette thèse illustrent le fait que la capture du CO₂ utilisant de l'anhydrase carbonique immobilisée peut offrir une stratégie rentable, verte et respectueuse de l'environnement, représentant une alternative attrayante aux technologies traditionnelles qui utilisent des absorbants à base d'amines. Avec la crise environnementale croissante, les technologies enzymatiques prennent de l'importance, ce qui suscite de plus en plus de tentatives pour les mettre en œuvre à l'échelle industrielle. / Anthropogenic activities have significantly enhanced the amount of greenhouse gases (GHGs) in the atmosphere and are a major contributor to global warming. Carbon dioxide (CO₂) is a primary greenhouse gas that contributes to climate change. Various technologies are being explored across the world to tackle CO₂ capture and sequestration. Despite their efficiency, amine-based solutions have negative environmental impact and the process is energy intensive. CO₂ absorption using carbonic anhydrase (CA) enzyme as catalyst (free in solution or immobilized) is a promising technology which offers high selectivity and efficiency in CO₂ capture processes by using nontoxic and more energy efficient solvents. CA is a well-known biocatalyst endowed with an extraordinary turnover number (TON), which offers to it a very high capacity to boost CO₂ hydration. CA immobilization on solid surfaces enhances the enzyme stability, and reusability and provides the ability for easy separation of the reaction products without biocatalyst contamination. In this context, the present thesis focuses on the investigation of CO₂ absorption process using immobilized CA in different bioreactors. More specifically, the main objectives are: i) developing an enhanced enzymatic process with immobilized CA enzyme in a packed-bed column bioreactor, ii) studying the CO₂ absorption in membrane contactor with immobilized CA enzyme on membrane surface, and iii) proposing a novel hybrid enzymatic process in an intensified flat sheet membrane contactor for improving CO₂ absorption via immobilized CA enzyme on both membrane and magnetic nanoparticles (MNPs). An improved CA immobilization technique was developed in this work using two steps: (i) co-deposition of Polydopamine (PDA)/Polyethyleneimine (PEI) with amino functional groups for amine-functionalization of surfaces and (ii) covalent enzyme immobilization on the aminated surfaces using glutaraldehyde. The proposed approach is appealing because of its simplicity, abundant amine functionalities of PEI, and great adhesion capacity of PDA during surface functionalization process, as well as the stability and reusability of immobilized enzyme via covalent bonding. A hybrid enzymatic process with CA enzyme immobilized on packing surface and MNPs dispersed in the liquid absorbent (water) was developed in a gas-liquid packed-bed column bioreactor. CA was immobilized on amine functionalized surface of MNPs and packings via covalent attachments. Even after 40 days of storage in buffer solution, the immobilized CA on packing and MNPs showed remarkable stability, retaining 80% and 84.7% of its original activity, respectively. Since the enzyme immobilized on MNPs operates as a free solution-phase enzyme, the CO₂ hydration process improved significantly, specially when the diffusion limitation in the enzymatic process with immobilized CA enzyme on the packing surface was significant. CA enzyme immobilized on polypropylene (PP) flat sheet membrane surface via co-deposition of PDA/PEI through covalent bonding method showed the highest activity and preserved most of its initial activity after 40 days (82.3%). A CO₂ absorption flux of 0.29x10⁻³ mol/m²s was attained by integrating the biocatalytic membrane into a flat sheet membrane contactor (FSMC) using water as absorbent. Stable CO₂ absorption rate was obtained during a longer time operation (6 hours), illustrating its potential for industrial applications. Mass transfer resistance in partially liquid-filled membrane pores was shown to be reduced by the catalyzed CO₂ hydration in these pores in the presence of immobilized CA. CO₂ absorption in flat sheet membrane contactor with immobilized CA on membrane surface was intensified by the incorporation of immobilized CA on the surface of MNPs dispersed in the liquid phase. CO₂ absorption process was improved due to the presence of biocatalytic MNPs, which act as a free solution-phase enzyme. CA was covalently immobilized on amine-functionalized MNPs surface. The proposed innovative hybrid enzymatic process in the intensified membrane contactor improved the CO₂ absorption by maximizing the utilization of CA's large TON, specially at lower CA loadings on the biocatalytic membrane. Immobilized membrane and MNPs demonstrated their reusability and retained their initial activities even after 10 absorption cycles. The intensified membrane contactor also displayed a stable operation for several hours. In conclusion, the results achieved in our work illustrate that CO₂ capture using immobilized CA can offer a cost-effective, green, and environmentally friendly strategy, representing an attracting alternative to customary technologies using amine-based absorbents. With the growing environmental crisis, enzymatic CO₂ capture technologies are becoming more important, prompting more attempts to implement them on industrial scales.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Devant la nécessité de préservation de l’environnement, la chimie devra de plus en plus devenir « verte ». Le développement de catalyseurs bio-hybrides est une voie prometteuse vers une chimie verte. En effet, ces catalyseurs combinent à la fois les avantages de la catalyse homogène (large gamme de réactivité) et ceux de la catalyse enzymatique (réaction en milieux aqueux, optimisation possible par génie biotechnologique). Ces nouveaux types de catalyseurs éco-compatibles semblent être à ce jour une alternative intéressante à la catalyse chimique classique.Cette thèse s’inscrit dans le cadre du développement de nouveaux catalyseurs bio-hybrides appelés Hémozymes, basés sur l’insertion non covalente de complexes métalliques hydrosolubles (responsables de l’activité catalytique), au sein d’une protéine hôte : la Xylanase A (pouvant induire une régio/stéréo/chimio-sélectivité).Pour cette étude, nous avons synthétisé différents complexes métalliques de taille variable (porphyrines, salens et salophens) métallés soit par du fer soit par du manganèse. L’étude de leur association avec la Xln A ainsi que les essais de leur activité catalytique nous ont permis d’aboutir à des résultats intéressants, d’une part pour la réaction d’oxydation du thionanisole par le peroxyde d’hydrogène, d’autre part pour l’oxydation d’alcènes aromatiques par l’oxone (KHSO5). Nous avons ainsi obtenu deux métalloenzymes artificielles remarquables, l’une capable de catalyser l’oxydation énantiosélective du thioanisole par le peroxyde d’hydrogène (84% de rendement, 40% d’excès énantiomérique en faveur de l’isomère S), l’autre capable de catalyser l’époxydation asymétrique du paraméthoxy-styrène par KHSO5 (17% de rendement, 80% d’excès énantiomérique en faveur de l’isomère R). Enfin, de nouvelles stratégies pour concevoir des catalyseurs bio-hybrides ont également été envisagée comme le greffage covalent de complexes métalliques au sein d’une protéine hôte, ou encore l’utilisation d’une forte affinité ligand-protéine (comme les interactions de type inhibiteur) pour enfouir un cofacteur métallique au sein d’une protéine. / In those days, the preservation of the environment is a huge challenge, so chemistry has to become more "Green". The development of bio-hybrid catalysts is a promising way towards a green chemistry. Indeed, these catalysts both combine the benefits of homogeneous Catalysis (wide range of reactivity) and those of enzyme catalysis (reaction in aqueous media, possible optimization by biotechnological engineering). These new kind of eco-compatible catalyst seem to be an interesting alternative to classical chemical catalysis to this day.For this study, we have synthesized various complexes with various size (porphyrins, salens and salophens) metalled by iron or manganese. The study of their association with Xln A and the catalytic activity assays allowed us to achieve interesting results, on the one hand to the oxidation of the thionanisole by hydrogen peroxide, on the other hand for the oxidation of aromatic alkenes by the oxone (KHSO5).This thesis is about the development of new bio-hybrid catalysts called Hemozymes, based on the non-covalent insertion of water-soluble metal complexes (responsible for the catalytic activity), inside a host protein: Xylanase A (which can induce a regio/stereo/chemo-selectivity).We have thus obtained two remarkable artificial metalloenzymes, one able to catalyze the enantioselective oxidation of thioanisole by hydrogen peroxide (84% yield, 40% of enantiomeric excess for the S isomer), the other able to catalyze the asymmetric epoxidation of paramethoxy-styrene by KHSO5 (17% yield, 80% enantiomeric excess for the R isomerFinally, new strategies to develop bio-hybrid catalysts have also been considered, such as covalent linkage of metal complexes within a host protein or the use of a high ligand-protein affinity (such as the interactions of inhibitor with proteins) to introduce the metal cofactor inside the protein pocket.

Dans la communauté scientifique, la glycosylation suscite un vif intérêt tant les relations existantes entre les sucres et les protéines sont étroites et sont impliquées dans de nombreux processus biologiques. De nombreuses méthodologies de synthèse ont été développées pour permettre la production de glycoprotéines sous forme homogènes nécessaires pour leur étude. Les formes S-glycosidiques sont d’un intérêt particulier grâce notamment à la réactivité de l’atome de soufre qui permet le couplage spécifique sucre – acide aminé et qui confère à la liaison une relative résistance à l’hydrolyse acido/basique et enzymatique. Dans le cadre de ce projet nous avons souhaité utiliser des outils biocatalytiques pour proposer une nouvelle voie d’accès aux protéines S-glycosylées en s’appuyant sur le concept des thioglycoligases. Pour répondre à ce challenge, nous nous sommes intéressés à la production d’une banque de glycosidases natives à partir du génome de la bactérie thermophile Dictyoglomus thermophilum. Trois protéines originales ont pu être produites, caractérisées et criblées en activité transglycosylase. Parmi ces dernières la β-glycosidase DtGly s’est révélée être un biocatalyseur efficace en favorisant la synthèse d’une variété de glycosides d’alkyle et de glycosyl glycérol. Par la suite, neuf mutants thioglycoligases ont été produits par mutagénèse dirigée à partir des glycosidases natives. A l’issue de leur criblage en activité thioligase, le mutant de DtGly E159Q a été retenu pour la synthèse de S-glycoconjugués. Une étude de relation structure/activité menée sur l’enzyme mutée nous a conduit à la synthèse d’un acide aminé non-naturel, la Thiotyrosine. L’essai de glycosylation de l’analogue estérifié de cette Thiotyrosine par DtGly E159Q a été suivi par LC-MS et a permis de mettre en évidence la formation du produit de thioglucosylation. Ce premier résultat préliminaire s’avère très prometteur pour la validation du concept de S-glycosylation d’un acide aminé catalysée par une thioglycoligase. / Glycosylation, one of the most complex co- and post-translationnal modifications of proteins, is of utmost importance for the scientific community as carbohydrates and proteins are closely related and involved in numerous diseases. The need to access homogeneous glycoproteins allows the development of a wide range of synthetic methods. Among them S-glycosidic forms have been attractive thanks to the reactivity of sulfur atom which allows the specific sugar – amino acid conjugation and confers a relative resistance through acido/basic or enzymatic hydrolysis. In this project we attempt to take advantage of natural tools to develop an enzymatic methodology to prepare S-glycosylated proteins through the thioglycoligase concept. In order to take up this challenge we first generate an enzymatic pool of wild type glycosidases from the thermophilic bacteria Dictyoglomus thermophilum. Activity screening of the three proteins produced and characterized allows the isolation of the β-glycosidase DtGly with good transglycosylation activity, thus affording a variety of alkyl glycosides and glyceroglycosides. Next we generate nine thioglycoligase mutants through site-directed mutagenesis and after screening of activity, the variant DtGly E159Q was selected to produce S-glycoconjugates. Finally, DtGly E159Q relation structure/activity studies led us to synthesize the unnatural amino acid Thiotyrosine. Enzymatic thioglucosylation assay catalyzed by DtGly E159Q was monitored by LC-MS and gave converging evidence of the successful formation of the S-glucosylated Thiotyrosine. This tremendous preliminary result is promising for further investigations of enzymatic S-glycosylation of amino acid using thioglycoligases as toolbox.