This thesis describes complementary theoretical and experimental investigations into polymorphism of several structurally similar small organic molecules. Five biologically important molecules (DNA/RNA bases) and five barbiturate type compounds were subjected to a wide range of crystallisation conditions which resulted in the characterisation of new products, including new polymorphs of barbituric acid and 6- methyluracil. These results were correlated with computational polymorph predictions and in some cases rationalised to investigate why some structures have unused hydrogen bond acceptors. The crystal structure prediction process was evaluated on hydantoin as part of the formal third crystal structure prediction blind test organised by the Cambridge Crystallographic Data Centre. This involved performing the calculations from just the known molecular structure. The compounds 3-oxauracil and 5-hydroxyuracil were also studied in an informal blind test scenario in collaboration with GlaxoSmithKline. In all cases the experimental crystal structure was found within the lowest energy structures. This work demonstrates that structurally similar organic molecules can have different patterns of the relative energies of the hypothetical low energy crystal structures, along with differences in the experimental polymorphic behaviour. Molecular flexibility and the model applied for the intermolecular forces can reorder the relative stabilities of the low energy structures. These variations are often comparable to the differences in the energies of the different crystal structures which considerably decrease the confidence in the computational predictions. The kinetics of crystallisation and the limitations in the range of crystallisation techniques available are important in determining which polymorphs are seen experimentally. The range of experimental and computational polymorphic behaviour exhibited by the molecules described in this thesis highlights the challenges involved in polymorph prediction

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La Méthionine Aminopeptidase est une métalloenzyme présente chez tous les procaryotes et essentielle à la maturation des protéines chez les bactéries. Malgré sa présence chez les eucaryotes,c’est une cible attractive pour développer de nouveaux antibiotiques. A ce jour, de nombreux inhibiteurs visant cette cible ont été développés mais aucun n’a fait l’objet de recherche avancée car l’effet antibactérien était trop limité. Nous nous sommes intéressés à la MetAPI d’E.coli(EcMetAP) comme modèle de Gram (-). Ainsi, une nouvelle série d’inhibiteurs présentant une fonction 1-Hydroxypyridin-2-one (HOPO) comme motif chélatant, a été conçue, synthétisée et les activités évaluées in vitro et in cellulo. Le design de ces ligands a été effectué par une étude en modélisation moléculaire en partant des structures RX de l’enzyme à Mn (EcMetAP-Mn) co-cristalliséeavec un ligand acide hydroxamique résolues précédemment dans l’équipe. Les études en dynamique moléculaire ont permis de sélectionner trois familles de ligand. Ces molécules ont ensuite été synthétisées. Pour la famille de ligands substitués en 5 du cycle HOPO par un methyl indole, la stratégie de synthèse classique n’a pas permis d’obtenir les ligands souhaités mais, une HOPO fonctionnalisée par un dérivé résultant de l’ouverture du cycle indolique a été isolée et totalement caractérisée. Sur l’ensemble des molécules mises au point, cinq d’entre elles ont une bonne affinité pour la MetAP-Mn, avec des CI50 inférieures à 5 μM. Les molécules présentent dans l’ensemble une activité antibactérienne modérée. L’activité est améliorée en présence de polymyxine nonapeptide, un perméabilisant membranaire. Afin de pallier le problème du manque de perméabilité des bactéries Gram (-), la stratégie de métal-chaperone associant autour d’un cation métallique l’inhibiteur et un ligand auxiliaire fonctionnalisé par un perméabilisant, a permis d’améliorer les activités antibactériennes. / Methionine aminopeptidase (MetAP) is an ubiquitous metalloprotein present in allprokaryotes and essential to the maturation of proteins in bacteria. Despite to be also present in eukaryotes, it is an attractive target to design new antibacterial agents. Numerous inhibitors targeting MetAP have been developed these last years, but none of then have been further studied because of too low antibacterial activities. We chose to work on MetAP1 from E. coli strain (EcMetAP), as an example of Gram negative bacteria, for which several X-ray structures of the enzyme in complex with inhibitors are available in the literature. A new series of inhibitors functionalized by a 1-hydroxypyrdin-2-one (HOPO) as chelating group has been designed and synthesized. The backbone of these HOPOs has been designed by molecular modeling, starting from the X-ray structure of EcMetAP loaded with Mn(II) incomplex with simple hydroxamic acids and previously solved in the lab. Three types of ligands have been selected and further synthesized. However HOPO substituted in position 5 by a methyl indole could not be obtained, instead a polyfunctionalized molecule with a HOPO substituted by a ring-opening derivative of the indole was isolated and completely characterized. The biological activities of all the molecules were determined. Five of them displayed inhibitory effect against EcMetAP-Mn with IC50 lower than 5 μM. The antibacterial activities are modest againt a wild type E. coli strain and an E. coli strain deleted from the AcrAB efflux pump system, but the sensitivity is increased by adding polymyxin nonapeptide. So, the results can be improved using the metal- chaperone strategy previously developed in the team, which allows, by grafing a permeabilizing agent on an ancillary ligand complexed to a metal cation with the HOPO inhibitor, to favor the uptake of the drug by the bacteria.

La miniaturisation des systèmes séparatifs est en plein développement aujourd’hui. Cette évolution se justifie par le très faible volume de l’échantillon et la nécessité croissante de gagner du temps d’analyse. Cette thèse comporte deux parties. La première partie consiste à développer une nouvelle génération de colonnes capillaires ouvertes (« open tubular ») de dimension micronique basées sur la fonctionnalisation de surface et de caractériser leurs propriétés en analyse protéomique pour la séparation de digests peptidiques par chromatographie liquide en phase inverse. La fonctionnalisation de surface a été réalisée après activation de la paroi de silice du capillaire par greffage de dérivés silylés comprenant le motif méthacrylate de glycidyle. La fonction époxyde a ensuite été ouverte par des amines primaires aliphatiques afin d’augmenter l’hydrophobicité de la phase stationnaire. Cette stratégie en deux étapes a l’avantage de permettre de dissocier le greffage de l’introduction du motif fonctionnel et de permettre une plus grande variété de fonctionnalisation. Ces colonnes ont été testées sur des peptides standards ou sur des digests peptidiques avec une analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF hors-ligne et en ligne en couplage nanoLC nanoESI-trappe ionique. Les effets des différents paramètres sur la rétention des peptides ont été étudiés en particulier la longueur de la chaîne alkyle. Les tests montrent que chaque fois que l’on diminue la longueur de la chaîne carbonée de l’amine, les peptides sont élués à un plus faible pourcentage d’acétonitrile. En effet le raccourcissement de la chaîne carbonée conduit à la décroissance des interactions hydrophobes, ce qui conduit les peptides à être élués plus rapidement. La deuxième partie de la thèse présente les premiers développements de greffage de polymère à empreinte moléculaire (acronyme anglais MIP pour Molecular Imprinted Polymer) pour la séparation de peptides et de protéines. La synthèse d’une phase à empreinte moléculaire est réalisée à partir d’un mélange de monomères portant des fonctions acides ou basiques et d’une molécule empreinte qui interagit au cours de la polymérisation par des liaisons non covalentes. Une fois la polymérisation achevée, la molécule empreinte est éliminée de la matrice polymérique, ce qui conduit à la formation d’un polymère rigide renfermant des sites de reconnaissance spécifiques de la molécule modèle. Les colonnes à empreinte moléculaire visent à retenir sélectivement la molécule ciblée ou des molécules proches en taille et en structure, au sein d’un mélange complexe par des interactions spécifiques. Une affinité entre deux peptides différents a été obtenue avec une bonne sélectivité. La préparation des colonnes MIP et NIP (polymère non imprimé) a été effectuée afin de comparer le pouvoir de rétention des deux matériaux et de vérifier la sélectivité de recapture du MIP par rapport au NIP vis-à-vis de la molécule cible. Ces colonnes ont également été testées par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF. / The miniaturization of separative systems is continuously developing today. This emergence is due to the very low sample volume and the increasing need to save analysis time. The present thesis comprises two parts. The first one consists on developing a new generation of open capillary columns ("open tubular") based on micron-scale surface functionalization and characterization of their properties in proteomics analysis for the separation of peptide digests by reversed-phase liquid chromatography. The surface functionalization was carried out after activating silica capillary wall by grafting silylated derivatives including glycidyl methacrylate. The epoxide function was then broken by aliphatic primary amines to increase the hydrophobicity of the stationary phase. This two-step strategy has the advantage of allowing a split grafting of the functional unit and a wider variety of functionalizations. These columns were tested on standard peptides or peptide digests with analysis by MALDI-TOF offline and online nanoLC nanoESI-coupled ion trap. The effects of various parameters, particularly the length of the alkyl chain, on the retention of peptides were studied. The obtained results show that by decreasing the length of the amine carbon chain, peptides are eluted at a lower percentage of acetonitrile. In fact the shortening of the carbon chain results in the decrease of hydrophobic interactions and in faster peptides elution.The second part of this thesis presents preliminary developments of polymer grafting of type MIP (Molecular Imprinted Polymers) for the separation of peptides and proteins. The synthesis of molecularly imprinted phase is made from a mixture of monomers having acid or basic functions and imprint molecules that interact during the polymerization by non-covalent bonds. Once the polymerization is complete, the imprint molecules are removed from the polymer matrix, which results in the formation of a rigid polymer containing recognition sites that are specific to the model molecules. The molecularly imprinted columns were designed to selectively retain the target molecules or molecules similar in size and in structure, within a complex mixture by specific interactions. Affinity between two different peptides was obtained with good selectivity. Preparation of MIP and NIP (No Imprinted Polymers) columns was performed to compare the retention capacity of both materials and to verify the selectivity of the MIP uptake compared to NIP with respect to the target molecule. These columns were also tested by mass spectrometry MALDI-TOF.