L’objectif de cette thèse a été d’optimiser la réponse immunitaire anti-tumorale induite par les cellules dendritiques (DC) et les cellules iNKTs, en réponse à la prise en charge du KRN7000 (a-galactosyl-céramide) par la molécule CD1d située sur les DCs. Le premier axe de travail visait à synthétiser de nouveaux analogues du KRN7000, en fonctionnalisant la position C6 du sucre et en greffant un groupement phényl sur l’une des chaînes grasses. Les études in vitro ont montré que les modifications apportées par rapport au KRN7000 n’ont pas altéré la prise en charge des molécules obtenues par les DCs. Dans tous les cas, une sécrétion de cytokines a pu être observée. Des études complémentaires visant à décrire le profil cytokinique in vivo sont en cours. Le second axe a consisté en la mise au point d’une stratégie de vectorisation du KRN7000 afin de favoriser sa présentation aux DCs, en l’associant à des molécules d’intérêt comme un peptide spécifique d’une tumeur, une molécule de ciblage des DCs ou des ligands des TLRs. Dans les conditions utilisées, le phénomène d’anergie induit classiquement par l’administration répétée du KRN7000 n’a pas pu être levé. Cependant, nous avons montré d’une part que le KRN7000 vectorisé dans les liposomes est toujours pris en charge par les cellules dendritiques, et d’autre part qu’une réponse immunitaire se traduisant par la production de cytokines par les cellules iNKTs est induite. / The aim of this project was to optimize the anti-tumor immune response induced by dendritic and iNKTs cells, in response to KRN7000 (a-galactosyl-ceramide), which interacts with CD1d molecule situated on DCs. At first we synthesized new analogues of KRN7000, by functionalizing the C6 position of the carbohydrate moiety and by grafting a phenyl group on one of the fatty chain. In vitro studies indicated that chemical modifications of KRN7000 did not alter its interaction with CD1d. In all cases, cytokine secretion was observed. Further studies are in progress to describe the in vivo cytokine profile. In a second step, we developed liposomal constructs incorporating KRN7000 to optimize its presentation to DCs. Some constructions containing KRN7000 were able to associate a peptide, a targetting molecule of DCs or TLR ligands. Even if the anergy phenomenon induced by repeated administrations of KRN7000 could not be regulated by the use of liposomes, we have shown that encapsulated KRN7000 is still supported by DCs and that an immune response resulting in cytokines secretion by iNKT cells is induced.

Les céramides sont des lipides de la classe des sphingolipides issus de la N-acylation d’une base sphingoide par un acide gras. Ces lipides et leurs analogues suscitent un grand intérêt comme composants actifs dans les industries pharmaceutique et cosmétique. Parmi les biocatalyseurs capables de réaliser la synthèse de ce type de lipide, la lipase B de Candida antarctica semble être l’enzyme la plus adaptée à la production de « pseudo-céramides » à partir d’amino-polyols. Dans ce contexte, nous avons abordé l’étude de l’acylation de composés de type « amino-alcool »catalysée par la lipase B de Candida antarctica, en gardant à l'esprit une approche fondamentale afin d’élargir les connaissances actuelles sur ce sujet. La première partie de notre travail a ainsi traité de l’étude cinétique de l’acylation de composés monofonctionnels afin de déterminer les mécanismes réactionnels et l’énantio sélectivité de la lipase B de Candida antarctica pour les réactions de N-acylation et de O-acylation. Les parties suivantes de notre travail ont porté sur une étude structure-réactivité du substrat accepteur d’acyle et sur l’étude de l’influence du solvant utilisé (solvant organique ou liquide ionique) afin de déterminer les facteurs clés influençant la chimio sélectivité et la régio sélectivité de la lipase B de Candida antarctica lors de l’acylation de composés multifonctionnels de type « amino-alcool ». Finalement, à partir des connaissances acquises dans les différentes parties, nous avons développé et optimisé un procédé de synthèse enzymatique de « pseudo-céramides » (O,N-diacyl aminopropanediols) mis en oeuvre en réacteur continu à « lit fixe ». / Ceramides are lipids from the sphingolipide class derived from the N-acylation of a sphingoid base from a fatty acid. These lipids and their analogs are compounds of interest used as active components in pharmaceutical and cosmetic industries. Among biocatalysts able to synthesize this type of lipids, Candida antarctica lipase B appears to be the most appropriate enzyme for the production of "pseudo-ceramides" derived from amino-polyols. In this context, we have studied the acylation of amino-alcohol-like compounds catalyzed by Candida antarctica lipase B, keeping inmind a fundamental approach to expand the current knowledge on this subject. The first part of our work aimed to determine the reaction mechanisms and the enantio selectivity exhibited by Candida antarctica lipase B during O-acylation and N-acylation reactions, by conducting a kinetic study of mono functional compound acylation. In the following parts of our work, we performed a structurere activity study of the acyl acceptor substrate and evaluated the effect of the solvent used (organic solvent or ionic liquid) to determine the key factors influencing the chemo selectivity and the regio selectivity of the Candida antarctica lipase B-catalyzed acylation of polyfunctional amino alcohol compounds. Finally, starting from the knowledge acquired in the previous parts, we have developed and optimized an enzymatic process of “pseudo-ceramide” (O,N-diacylaminopropanediol) synthesis performed in a continuous packed-bed reactor.

Le vieillissement normal s’accompagne d’une diminution du contenu du cholestérol cérébral. Au contraire, une accumulation de cholestérol est associée aux processus toxiques dans plusieurs pathologies dégénératives (maladie d’Huntington, maladie de Parkinson, épilepsie, maladie de Niemann Pick de type C, maladie d’Alzheimer). De plus, les parallèles étroits existent entre la physiopathologie moléculaire de la maladie d’Alzheimer et celle de la maladie de Niemann Pick de type C, maladie de l’homéostasie du cholestérol. Ainsi on retrouve dans ces deux pathologies une hyperphosphorylation de la protéine Tau, associée à une augmentation des endosomes élargis et à la production de peptides A. L’ensemble de ces éléments évoque le rôle potentiel de la surcharge en cholestérol cérébral comme facteur favorisant le développement de la maladie d’Alzheimer. L’objectif de mon travail de doctorat a été de déterminer si une surcharge en cholestérol in vivo dans les neurones de l’hippocampe, région précocement touchée par la maladie d’Alzheimer, pouvait être à l’origine de processus neurotoxiques et de modifications biochimiques et neuropathologiques proches de ceux qui sont observés dans cette pathologie. La quasi-totalité du cholestérol cérébral est synthétisée in situ, la barrière hémato-encéphalique ne permettant qu’un apport minime du cholestérol périphérique. L’excès de cholestérol est exporté de la circulation sanguine sous la forme du 24-hydroxycholestérol, un métabolite produit exclusivement dans les neurones par la cholestérol-24-hydroxylase codée par le gène Cyp46a1.La surcharge en cholestérol a été induite in vivo par inhibition de la cholestérol-24-hydroxylase, dans l’hippocampe par une stratégie d’ARN interférence délivré par une injection stéréotaxique d’un vecteur AAV5. Nous avons étudié, d’une part la capacité d’une accumulation de cholestérol à induire chez la souris normale, un phénotype clinique et neuropathologique proche de la maladie d’Alzheimer et d’autre part si cette même accumulation de cholestérol neuronal pouvait aggraver ou compléter le phénotype Alzheimer d’un modèle murin de la maladie, la souris APP23. L’injection du vecteur AAV5-shCYP46A1 dans la stratum lacunosum moleculare de l’hippocampe conduit à une inhibition significative de l'expression du gène Cyp46a1, associée à une diminution de la concentration du 24-hydroxycholestérol et une augmentation du contenu en cholestérol dans les neurones de l’hippocampe, 3 semaines après l’injection. En réponse à cet excès de cholestérol, des mécanismes régulateurs permettent de diminuer, d’une part l’import et d’augmenter l’export du cholestérol de la cellule et d’autre part d’augmenter le contenu en phosphatidylcholine afin de rétablir un ratio phospholipide/cholestérol physiologique. Cependant, l'accumulation majeure de cholestérol intracellulaire conduit, 3 semaines après l’injection, à une activation de la réponse UPR (Unfolded Protein Response ou stress du réticulum endoplasmique) caractérisée par l'expression des gènes codant les facteurs XBP1s, ATF6, GRP78 associée à celles des protéines PERK phosphorylée, CHOP et caspase 12, entraînant l'activation des caspases 9 et 3. Elle est associée à la phosphorylation des protéines GSK3 (Tyr216) et Tau (Thr231). En parallèle, l’augmentation du cholestérol induit, 3 semaines après l’injection, une augmentation de l’expression de la protéine Rab5 (marqueur des endosomes précoces) et une relocalisation de la protéine APP dans les fractions de radeaux lipidiques associées à l'activation de la voie amyloïdogénique (production des fragments-CTF et des peptides A42). L’étude lipidomique met en évidence, 4 semaines après l’injection, une augmentation du contenu en céramide à longues chaînes et à une augmentation des gangliosides. Tous ces éléments aboutissent à un processus de perte neuronale associée à un recrutement des astrocytes dès la quatrième semaine après l’injection.... / An increasing number of arguments suggest a close and complex link between cholesterol metabolism and neurodegenerative diseases, particularly with Alzheimer’s disease. Normal ageing is associated with a decrease of brain cholesterol content. Conversly, accumulation of brain cholesterol is associated with several neurodegenerative diseases (Huntington disease, Parkinson disease, epilepsy, Niemann Pick C disease, Alzheimer’s disease). Moreover, close connections exist between molecular physiopathology of AD and that of Niemann Pick, a disease of cholesterol homeostasis. Altogether, these results suggest that cholesterol overload might play a role, as an initiating factor for the development of AD.In the brain, cholesterol metabolism is tightly controlled. In adults, cholesterol is mainly synthetized by astrocytes, then shuttles to neurons where it is used. All cholesterol excess must be eliminated. Cholesterol cannot cross freely the blood-brain-barrier. To be metabolized, brain cholesterol must be converted in 24-hydroxy-cholesterol by the cholesterol-24 hydroxylase enzyme, coded by CYP46A1 gene. The objective of my PhD project was to determine if cholesterol accumulation in vivo in hippocampal neurons, a region early involved in AD pathology, could trigger neurotoxic processes with biochemical and neuropathological modifications close to what is observed in AD. Cholesterol overload in vivo was induced by inhibiting cholesterol 24-hydroxylase enzyme activity, using an RNA interference strategy. Stereotactic injection of an AAV5- shCYP46A1 vector in the stratum lacunosum moleculare of the hippocampus led to significant and rapid (as soon as 3 weeks after injection) inhibition of the Cyp46a1 gene in the hippocampus with an absence of RNA interference off-target effect. This inhibition was associated with a decrease of 24-hydroxycholesterol content and an increase of the cholesterol content. In response to this cholesterol excess, cell control mechanisms were initiated leading to decrease import and increase export of cholesterol, accompanied with an increase of phosphatidylcholine content to restore a physiological ratio of phospholipide/cholesterol. However, major accumulation of cholesterol led to neuronal death with activation of caspases 9 et 3, suggesting an apoptotic process. The cholesterol overload drives to an endoplasmic reticulum stress, with activation of the unfolded protein response (UPR) and expression of spliced XBP1, ATF6, GRP78, phosphorylated PERK, CHOP and caspase 12. These modifications were associated with phosphorylation of GSK3 (Tyr 216) and tau (Thr 231) proteins. In parallel, cholesterol accumulation led to increased expression of Rab5 (early endosome marker) and relocalization of APP in rafts domains associated to activation of amyloid pathway (production of -CTF fragments and A42 peptides). Lipidomic analysis showed an increase of ceramides and gangliosides content. All these modifications were associated with neuronal death 4 weeks after injection and astrocytosis, leading to an EEG theta rhythm accelerated to beta frequencies, memory deficits and hippocampal atrophy. In a mouse model of Alzheimer disease, the APP23 mouse, cholesterol accumulation led to major aggravation of the phenotype, with increased production of A peptides, occurring of tau phosphorylation and UPR response, leading to accelerated neuronal death. Altogether, these results suggest a direct link between cholesterol accumulation in the brain and Alzheimer’s disease. Brain cholesterol accumulation could seed the sows to the development of Alzheimer’s pathology. Reducing cerebral cholesterol could thus be a relevant therapeutic strategy to prevent the development, or at least slow down the evolution of the pathology in Alzheimer’s disease.