Le réticulum endoplasmique rugueux (RE), assure la synthèse, le repliement et la maturation des protéines de la voie de sécrétion. Les altérations des fonctions physiologiques du RE, entrainent l’accumulation de protéines mal repliées dans la lumière du RE, une condition appelée stress RE. En réponse au stress RE, un mécanisme compensatoire adaptatif appelé Unfolded Protein Response (UPR) est activé afin de restaurer l’homéostasie du RE et de permettre la survie de la cellule. Dans le cas d’un stress RE sévère ou prolongé, les altérations ne pouvant plus être compensées, la cellule est éliminée par apoptose contribuant ainsi au développement de pathologies cardiaques. Le but des recherches actuelles sur le stress RE en physiopathologie cardiaque n’est pas d’inhiber la réponse au stress RE, mais plutôt de la moduler afin de limiter l’apoptose des cardiomyocytes et de protéger le cœur. Dans ce contexte, nous avons mis en évidence que le stress RE induit une modification importante de l’architecture des cardiomyocytes associée à une altération de la fonction mitochondriale. De plus, nous avons montré que SIRT1, une désacétylase dépendante du NAD+, inhibe l’apoptose mitochondriale induite par un stress RE en limitant spécifiquement l’activation de la voie PERK de la réponse UPR via la désacétylation du facteur eIF2á sur la lysine K143. Enfin, nos résultats indiquent que SIRT1 protège les cardiomyocytes de l’apoptose induite par le stress RE en favorisant la mitophagie, via une activation de la voie de signalisation eEF2K/eEF2. Ces résultats montrent que SIRT1 est impliquée dans la régulation de la réponse autophagique et apoptotique des cardiomyocytes au stress RE et suggèrent que cette désacétylase serait une cible thérapeutique intéressante pour limiter le développement des pathologies cardiaques liées au stress RE. / The endoplasmic reticulum (ER) functions to properly synthesize, fold and process secreted and transmembrane proteins. Impairment of ER function induces an accumulation of misfolded proteins in the ER lumen, a condition termed ER stress. In response to ER stress, an adaptive compensatory mechanism called Unfolded Protein Response (UPR) is activated to restore ER homeostasis and promote cell survival. In the case of severe or prolonged ER stress, homeostasis cannot be restored and the cell is eliminated by apoptosis contributing to the development of cardiac pathologies. Currently, cardiac therapy based on ER stress modulation to conserve beneficial adaptations and to avoid cardiomyocyte apoptosis is viewed as a promising avenue towards effective therapies of ER stress-associated cardiac diseases.In this context, we demonstrated that ER stress induces architectural modifications and alterations of the mitochondrial function in cardiomyocytes. Furthermore, we showed that SIRT1, a NAD+-dependent deacetylase, inhibits mitochondrial apoptosis by modulating the activation of the PERK pathway of the UPR through deacetylation of the translation initiation factor eIF2á on lysine K143. Our results also indicate that SIRT1 protects cardiomyocyte from ER stress-induced apoptosis by activating mitophagy through eEF2K/eEF2 pathway. Collectively, these data demonstrate that SIRT1 regulates ER stress-induced autophagy and apoptosis in the heart and suggest that this deacetylase may be a therapeutic target to protect the heart against ER stress-induced injury.

Le vieillissement normal s’accompagne d’une diminution du contenu du cholestérol cérébral. Au contraire, une accumulation de cholestérol est associée aux processus toxiques dans plusieurs pathologies dégénératives (maladie d’Huntington, maladie de Parkinson, épilepsie, maladie de Niemann Pick de type C, maladie d’Alzheimer). De plus, les parallèles étroits existent entre la physiopathologie moléculaire de la maladie d’Alzheimer et celle de la maladie de Niemann Pick de type C, maladie de l’homéostasie du cholestérol. Ainsi on retrouve dans ces deux pathologies une hyperphosphorylation de la protéine Tau, associée à une augmentation des endosomes élargis et à la production de peptides A. L’ensemble de ces éléments évoque le rôle potentiel de la surcharge en cholestérol cérébral comme facteur favorisant le développement de la maladie d’Alzheimer. L’objectif de mon travail de doctorat a été de déterminer si une surcharge en cholestérol in vivo dans les neurones de l’hippocampe, région précocement touchée par la maladie d’Alzheimer, pouvait être à l’origine de processus neurotoxiques et de modifications biochimiques et neuropathologiques proches de ceux qui sont observés dans cette pathologie. La quasi-totalité du cholestérol cérébral est synthétisée in situ, la barrière hémato-encéphalique ne permettant qu’un apport minime du cholestérol périphérique. L’excès de cholestérol est exporté de la circulation sanguine sous la forme du 24-hydroxycholestérol, un métabolite produit exclusivement dans les neurones par la cholestérol-24-hydroxylase codée par le gène Cyp46a1.La surcharge en cholestérol a été induite in vivo par inhibition de la cholestérol-24-hydroxylase, dans l’hippocampe par une stratégie d’ARN interférence délivré par une injection stéréotaxique d’un vecteur AAV5. Nous avons étudié, d’une part la capacité d’une accumulation de cholestérol à induire chez la souris normale, un phénotype clinique et neuropathologique proche de la maladie d’Alzheimer et d’autre part si cette même accumulation de cholestérol neuronal pouvait aggraver ou compléter le phénotype Alzheimer d’un modèle murin de la maladie, la souris APP23. L’injection du vecteur AAV5-shCYP46A1 dans la stratum lacunosum moleculare de l’hippocampe conduit à une inhibition significative de l'expression du gène Cyp46a1, associée à une diminution de la concentration du 24-hydroxycholestérol et une augmentation du contenu en cholestérol dans les neurones de l’hippocampe, 3 semaines après l’injection. En réponse à cet excès de cholestérol, des mécanismes régulateurs permettent de diminuer, d’une part l’import et d’augmenter l’export du cholestérol de la cellule et d’autre part d’augmenter le contenu en phosphatidylcholine afin de rétablir un ratio phospholipide/cholestérol physiologique. Cependant, l'accumulation majeure de cholestérol intracellulaire conduit, 3 semaines après l’injection, à une activation de la réponse UPR (Unfolded Protein Response ou stress du réticulum endoplasmique) caractérisée par l'expression des gènes codant les facteurs XBP1s, ATF6, GRP78 associée à celles des protéines PERK phosphorylée, CHOP et caspase 12, entraînant l'activation des caspases 9 et 3. Elle est associée à la phosphorylation des protéines GSK3 (Tyr216) et Tau (Thr231). En parallèle, l’augmentation du cholestérol induit, 3 semaines après l’injection, une augmentation de l’expression de la protéine Rab5 (marqueur des endosomes précoces) et une relocalisation de la protéine APP dans les fractions de radeaux lipidiques associées à l'activation de la voie amyloïdogénique (production des fragments-CTF et des peptides A42). L’étude lipidomique met en évidence, 4 semaines après l’injection, une augmentation du contenu en céramide à longues chaînes et à une augmentation des gangliosides. Tous ces éléments aboutissent à un processus de perte neuronale associée à un recrutement des astrocytes dès la quatrième semaine après l’injection.... / An increasing number of arguments suggest a close and complex link between cholesterol metabolism and neurodegenerative diseases, particularly with Alzheimer’s disease. Normal ageing is associated with a decrease of brain cholesterol content. Conversly, accumulation of brain cholesterol is associated with several neurodegenerative diseases (Huntington disease, Parkinson disease, epilepsy, Niemann Pick C disease, Alzheimer’s disease). Moreover, close connections exist between molecular physiopathology of AD and that of Niemann Pick, a disease of cholesterol homeostasis. Altogether, these results suggest that cholesterol overload might play a role, as an initiating factor for the development of AD.In the brain, cholesterol metabolism is tightly controlled. In adults, cholesterol is mainly synthetized by astrocytes, then shuttles to neurons where it is used. All cholesterol excess must be eliminated. Cholesterol cannot cross freely the blood-brain-barrier. To be metabolized, brain cholesterol must be converted in 24-hydroxy-cholesterol by the cholesterol-24 hydroxylase enzyme, coded by CYP46A1 gene. The objective of my PhD project was to determine if cholesterol accumulation in vivo in hippocampal neurons, a region early involved in AD pathology, could trigger neurotoxic processes with biochemical and neuropathological modifications close to what is observed in AD. Cholesterol overload in vivo was induced by inhibiting cholesterol 24-hydroxylase enzyme activity, using an RNA interference strategy. Stereotactic injection of an AAV5- shCYP46A1 vector in the stratum lacunosum moleculare of the hippocampus led to significant and rapid (as soon as 3 weeks after injection) inhibition of the Cyp46a1 gene in the hippocampus with an absence of RNA interference off-target effect. This inhibition was associated with a decrease of 24-hydroxycholesterol content and an increase of the cholesterol content. In response to this cholesterol excess, cell control mechanisms were initiated leading to decrease import and increase export of cholesterol, accompanied with an increase of phosphatidylcholine content to restore a physiological ratio of phospholipide/cholesterol. However, major accumulation of cholesterol led to neuronal death with activation of caspases 9 et 3, suggesting an apoptotic process. The cholesterol overload drives to an endoplasmic reticulum stress, with activation of the unfolded protein response (UPR) and expression of spliced XBP1, ATF6, GRP78, phosphorylated PERK, CHOP and caspase 12. These modifications were associated with phosphorylation of GSK3 (Tyr 216) and tau (Thr 231) proteins. In parallel, cholesterol accumulation led to increased expression of Rab5 (early endosome marker) and relocalization of APP in rafts domains associated to activation of amyloid pathway (production of -CTF fragments and A42 peptides). Lipidomic analysis showed an increase of ceramides and gangliosides content. All these modifications were associated with neuronal death 4 weeks after injection and astrocytosis, leading to an EEG theta rhythm accelerated to beta frequencies, memory deficits and hippocampal atrophy. In a mouse model of Alzheimer disease, the APP23 mouse, cholesterol accumulation led to major aggravation of the phenotype, with increased production of A peptides, occurring of tau phosphorylation and UPR response, leading to accelerated neuronal death. Altogether, these results suggest a direct link between cholesterol accumulation in the brain and Alzheimer’s disease. Brain cholesterol accumulation could seed the sows to the development of Alzheimer’s pathology. Reducing cerebral cholesterol could thus be a relevant therapeutic strategy to prevent the development, or at least slow down the evolution of the pathology in Alzheimer’s disease.